肢體缺血預(yù)/后適應(yīng)改善膿毒癥小鼠心肌IL-6及心臟功能的作用

陳海麗，龔佳紅，李旭卿，李盛村

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325027

膿毒癥是導(dǎo)致死亡的常見原因，其發(fā)病率不斷上升[1-2]。急性炎癥反應(yīng)是膿毒癥患者的一個重要特征[3]。膿毒癥患者會出現(xiàn)心肌損傷和心肌炎癥，甚至50%膿毒癥患者出現(xiàn)心功能不全[4-5]。膿毒癥引起的心肌損傷出現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬障礙和細(xì)胞凋亡，也是其他多器官衰竭的重要環(huán)節(jié)[5-6]。由于促炎癥消退策略，可以對全身性和心臟炎癥實(shí)現(xiàn)雙重調(diào)控，因而抗炎成為非常重要的膿毒癥治療策略。不同于藥理學(xué)方法，肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)（remoteischemicpreconditioning, RIC）被認(rèn)為是一種低成本、低風(fēng)險(xiǎn)、不良反應(yīng)較小的康復(fù)手段[7]。RIC有對抗氧化應(yīng)激、炎癥和抵御心臟損傷的作用[8]。已有研究表明，RIC對多種心臟疾病都有效果，也有研究指出，肢體遠(yuǎn)端缺血后適應(yīng)（postremoteischemicconditioning, pRIC）也有效果[9]。然而，在膿毒癥心臟損傷中RIC或pRIC最佳的時(shí)間組合以及保護(hù)作用機(jī)制仍不清楚。白細(xì)胞介素6（interleukin-6, IL-6）是一種多效細(xì)胞因子，在急性炎癥反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用[10]。血液IL-6含量可以作為早期膿毒癥發(fā)病指標(biāo)，在心肌炎、梗死后心臟炎癥和膿毒癥心肌病中IL-6往往表達(dá)增加[11]。IL-6 的增加可以作為膿毒癥預(yù)后及炎癥嚴(yán)重程度的依據(jù)[12]?；贗L-6 的變化，判斷不同強(qiáng)度或不同組合的RIC效果的研究仍不多。因此，本研究旨在確定肢體缺血預(yù)、后處理對膿毒癥心臟損傷的影響，探討不同組合的預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)通過IL-6而改善膿毒癥心臟功能降低的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫維持在21～23℃，濕度40%～60%，12h/12h自然光交替照明，自由飲水飲食。

1.1.2 試劑與儀器：脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）購自德國Sigma-Aldrich公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR購自大連Takara公司。Vevo2100小動物超聲儀購自加拿大VisualSonics公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)1：對照組；LPS組，腹腔注射6mg/kgLPS；單側(cè)腿缺血預(yù)適應(yīng)組，在注射LPS之前進(jìn)行單側(cè)后肢大腿根缺血預(yù)適應(yīng)方案干預(yù)；雙側(cè)腿缺血預(yù)適應(yīng)組，在注射LPS之前進(jìn)行雙側(cè)腿同時(shí)缺血預(yù)適應(yīng)干預(yù)；單側(cè)腿缺血后適應(yīng)組，注射LPS之后即刻進(jìn)行單側(cè)腿缺血適應(yīng)干預(yù)；雙側(cè)腿缺血后適應(yīng)組，注射LPS之后即刻進(jìn)行雙側(cè)腿同時(shí)缺血適應(yīng)干預(yù)。每組6只小鼠。

實(shí)驗(yàn)2：對照組、LPS組、缺血預(yù)適應(yīng)組、間隔2h的2次缺血后適應(yīng)組、缺血預(yù)適應(yīng)疊加缺血后適應(yīng)組。每組6只小鼠。

實(shí)驗(yàn)3：對照組、LPS組、缺血預(yù)適應(yīng)組。每組6只小鼠。

1.2.2 小鼠干預(yù)過程：缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均為對小鼠大腿根部用橡皮筋結(jié)扎3圈缺血5min，松開10min，重復(fù)4次為一個干預(yù)程序。其中缺血預(yù)適應(yīng)1h后注射LPS，缺血后適應(yīng)為注射LPS后即刻進(jìn)行。

1.2.3 小鼠心臟功能評價(jià)：應(yīng)用Vevo2100小動物超聲成像儀評價(jià)小鼠心臟功能。1%異氟烷吸入麻醉小鼠后，仰臥位固定于檢測臺，左側(cè)臥位安置超聲探頭，以乳頭肌水平作為心臟二維短軸觀察標(biāo)志，同時(shí)記錄M-model掃描，測量3個心動周期左心室舒張末期內(nèi)徑（leftventricularenddiastolicdiameter, LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（leftventricularendsystolicdiameter, LVEDs），據(jù)此計(jì)算獲取左心室射血分?jǐn)?shù)（ejectionfraction, EF）和短軸縮短率（fractionshortening, FS）。以EF和FS來評價(jià)心臟收縮功能。

調(diào)整探頭對準(zhǔn)心尖，獲取心尖四腔觀，多普勒模式測量二尖瓣流出道上方血流速度，以舒張期最大早期速率（E波）和最大末期速率（A波）比值，作為評價(jià)舒張功能的指標(biāo)。

1.2.4 心肌組織mRNA表達(dá)檢測：提取總RNA，取15mg心肌組織于EP管中，加入1mLTRIzol，勻漿，加入200μL氯仿，4℃、12000×g離心15min，吸取上清液至新的1.5mLEP管。加入等體積的異丙醇，4℃、12000×g離心10min，乙醇清洗，離心后加入DEPC水30μL溶解。分光光度計(jì)測定260nm和280nm下的吸光度值。以A260/A280評價(jià)提取純度和濃度。

按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按表1引物擴(kuò)增對應(yīng)基因，定量分析目的基因相對GAPDH的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 單、雙側(cè)腿缺血預(yù)/后適應(yīng)對心肌IL-6mRNA表達(dá)的影響 前期我們對小鼠后肢單側(cè)腿，采用3次每次10min或4次每次5min，間隔時(shí)間10min，開展不同干預(yù)時(shí)間組合的缺血預(yù)適應(yīng)，結(jié)果表明，4次每次5min的干預(yù)方式比前者更能降低LPS小鼠的病死率，因此，實(shí)驗(yàn)中都采用4次每次5min的肢體缺血適應(yīng)干預(yù)。

與對照組比，LPS組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組比，單側(cè)腿缺血預(yù)適應(yīng)和單側(cè)腿缺血后適應(yīng)（LPS注射后即可開展）組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與對應(yīng)的單側(cè)腿缺血預(yù)/后適應(yīng)組比，雙側(cè)腿缺血預(yù)/后適應(yīng)組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 單側(cè)或雙側(cè)缺血預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)對膿毒癥小鼠心肌IL-6mRNA的影響

2.2 不同組合的缺血預(yù)/后適應(yīng)對心肌IL-6mRNA表達(dá)的影響 由于單側(cè)腿干預(yù)降低IL-6mRNA的效果明顯優(yōu)于雙側(cè)腿同時(shí)干預(yù)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)組別均為單側(cè)腿缺血預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)干預(yù)。與對照組比，LPS組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組比，單次缺血預(yù)適應(yīng)組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與LPS組和單次缺血預(yù)適應(yīng)組比，缺血預(yù)適應(yīng)疊加缺血后適應(yīng)組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組比較，間隔2h的2 次缺血后適應(yīng)組小鼠心肌IL-6mRNA的相對表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)疊加干預(yù)對膿毒癥小鼠心肌IL-6mRNA的影響

2.3 缺血預(yù)適應(yīng)對心肌組織TNF-α、IL-1β、Atrogin-1和ApelinmRNA的影響 與對照組比，LPS組小鼠心肌中TNF-α、IL-1β和Atrogin-1 相對表達(dá)量增加（P＜0.05），而ApelinmRNA相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。與LPS組相比，缺血預(yù)適應(yīng)組小鼠心肌TNF-α和IL-1β的mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見圖3A、圖3B。然而，缺血預(yù)適應(yīng)組和LPS組Atrogin-1和Aplein相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3C、圖3D。

2.4 缺血預(yù)適應(yīng)改善膿毒癥小鼠心臟功能 與對照組比，LPS組小鼠收縮功能指標(biāo)EF和FS顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與LPS組比較，缺血預(yù)實(shí)驗(yàn)組小鼠EF和FS顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4A-C。

與對照組比，LPS組小鼠舒張功能指標(biāo)E/A比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與LPS組比，缺血預(yù)實(shí)驗(yàn)組小鼠E/A比值顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4D、圖4E。

3 討論

實(shí)驗(yàn)動物采用腹腔注射LPS并誘導(dǎo)膿毒癥樣病變，是膿毒癥研究的經(jīng)典模型。LPS導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)出體質(zhì)量減少，系統(tǒng)性炎癥增加，心肌萎縮，甚至在短期內(nèi)發(fā)生死亡[13]。心臟功能降低并引發(fā)其余多器官衰竭是膿毒癥患者死亡的主要原因[14]。有研究指出，膿毒癥心臟中存在過度的氧化應(yīng)激、炎癥和線粒體損害，而采用過表達(dá)Parkin分子可以通過改善線粒體質(zhì)量和數(shù)量而阻止膿毒癥所致的心肌萎縮[15]和心臟功能紊亂[16]。

圖3 缺血預(yù)適應(yīng)對膿毒癥小鼠心肌TNF-α、IL-1β、Atrogin-1和ApelinmRNA相對表達(dá)量的影響

圖4 缺血預(yù)適應(yīng)對膿毒癥小鼠心臟功能的影響

膿毒癥心肌中出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，因此，促炎癥消退是重要的治療策略。有研究表明，與對照組比，LPS組小鼠的左室EF、FS、左室收縮壓和左室內(nèi)壓變化速率較低，而IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子增加，同時(shí)心肌損傷標(biāo)志物cTnT明顯上調(diào)；而降低IL-6表達(dá)后，心肌細(xì)胞凋亡減少，心臟功能改善[17]。類似的研究指出，在LPS刺激的H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中可以檢測到IL-6 增加[5]。另外，IL-6直接上調(diào)其余促炎因子參與炎癥應(yīng)答，有助于LPS處理的心肌細(xì)胞凋亡[18]。在心臟主動脈狹窄小鼠心衰模型中，IL-6可以激活STAT3信號通路，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，類似的體外研究也表明IL-6刺激引起H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和有絲分裂吞噬相關(guān)蛋白增加而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[19]。最近，還有研究更進(jìn)一步證實(shí)IL-6并不是炎癥反應(yīng)的伴隨現(xiàn)象，而是可以作為結(jié)局預(yù)后指標(biāo)，研究人員建立了心房顫動小鼠模型，結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，IL-6基因敲除小鼠緩解了心房顫動的發(fā)生在機(jī)制方面，研究者證實(shí)IL-6通過pSTAT3/STAT3信號通路誘導(dǎo)心房的早期纖維化，并參與術(shù)后心房顫動發(fā)生過程[20]。有研究還證明術(shù)后心房顫動患者心包引流液中的IL-6濃度較高，指出心包引流液中的IL-6可能成為臨床預(yù)測術(shù)后心房顫動的生物標(biāo)志物[21]。反之，IL-6基因敲除增加心肌中M2巨噬細(xì)胞分化，減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞分化并防止心肌細(xì)胞凋亡，最終減緩衰老小鼠的心功能不全[22-23]。由此可知，IL-6在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心臟炎癥過程中起重要作用，IL-6可以作為評價(jià)心肌炎癥嚴(yán)重程度和預(yù)后情況的指標(biāo)。在本研究中，LPS引起小鼠心肌中IL-6mRNA的表達(dá)增加，而且對缺血預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)非常敏感。本研究結(jié)果表明，依據(jù)心肌中IL-6mRNA的變化，可以更好地研究缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)治療組合、強(qiáng)度和疊加效益。

缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)作為無創(chuàng)的物理治療方式，可以用于抵御心梗、膿毒癥心肌病的發(fā)生[24]，也可以減緩缺血性腦卒中的癥狀[25]。盡管缺血后適應(yīng)也有保護(hù)作用[26]，早期的研究認(rèn)為肢體缺血預(yù)適應(yīng)可能優(yōu)于缺血后適應(yīng)，然而，缺血預(yù)適應(yīng)是在健康動物中進(jìn)行的，不太符合發(fā)病后治療康復(fù)的干預(yù)需求，限制了其臨床應(yīng)用。因此，缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用分子機(jī)制尤其值得研究，模擬缺血預(yù)適應(yīng)的藥理學(xué)手段，可能會突破其臨床應(yīng)用限制?；贗L-6mRNA在心肌中的變化，本研究結(jié)果表明過多的肢體缺血適應(yīng)干預(yù)并不是有利的，例如2h間隔的重復(fù)缺血后適應(yīng)加劇了炎癥反應(yīng)，同樣，雙側(cè)同時(shí)缺血預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)均未能進(jìn)一步減輕炎癥應(yīng)答。本研究還發(fā)現(xiàn)，由于LPS仍未在小鼠體內(nèi)發(fā)揮充分作用，即刻的缺血后適應(yīng)很可能和缺血預(yù)適應(yīng)有相同的機(jī)制，因此，我們也觀察到缺血預(yù)適應(yīng)和即刻缺血后適應(yīng)的組合降低炎癥的效果是最好的。

最后，本研究也證實(shí)了肢體缺血預(yù)適應(yīng)改善膿毒癥小鼠心臟功能，這與肢體缺血預(yù)適應(yīng)降低心肌組織促炎因子IL-1β和TNF-α密切相關(guān)。膿毒癥小鼠心臟中萎縮基因Atrogin-1 表達(dá)增加，Apelin基因的表達(dá)下降，然而，缺血預(yù)適應(yīng)無法逆轉(zhuǎn)兩者的改變。這表明，缺血預(yù)適應(yīng)組合其他抗萎縮策略，可能會發(fā)揮更大的保護(hù)膿毒癥心肌的作用，具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。在未來，應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)方法模擬肢體缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)效益，以及發(fā)揮更穩(wěn)定地保護(hù)效果，運(yùn)用于更多病種[27]。

綜上所述，在膿毒癥小鼠中，缺血預(yù)適應(yīng)通過降低促炎因子而改善其心臟功能。我們發(fā)現(xiàn)即刻的肢體缺血后適應(yīng)和缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)揮抗炎效益，而疊加的缺血后適應(yīng)卻不利于膿毒癥的炎癥消退。此外，預(yù)適應(yīng)和即刻后適應(yīng)疊加能夠有更多的保護(hù)效益。IL-6mRNA可以作為評價(jià)缺血預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)的各種組合效果好壞的敏感指標(biāo)。