G蛋白信號調(diào)節(jié)因子-13通過調(diào)控β-catenin抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

項友群，方冠，金亦翔，楊凱，潘貽飛

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，浙江 溫州 325015

結(jié)直腸癌（colorectalcancer, CRC）是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一[1]。2015 年我國CRC新發(fā)病例近38萬例，病死近19萬例，發(fā)病率和病死例數(shù)均居世界首位[2]。CRC的進(jìn)展通常伴隨著癌基因和抑癌基因的突變，表達(dá)量的變化以及表觀遺傳學(xué)變化等[3-4]。雖然對CRC進(jìn)展過程中基因水平的表達(dá)調(diào)控已有了廣泛的研究，但是CRC在分子水平的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍有待闡明。明確CRC增殖、遷移和侵襲的相關(guān)分子與相關(guān)信號通路，對于CRC的診斷與治療具有重要的意義。G蛋白信號調(diào)節(jié)因子-13（regulatorofGproteinsignaling13, RGS13）基因位于人類1號染色體長臂3區(qū)1帶，編碼19.1kDa的蛋白質(zhì)。RGS13是Gαi和Gαo的GTPase激活蛋白，使結(jié)合的GTP轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP，從而調(diào)節(jié)G蛋白的活性來抑制G蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。作為一個與細(xì)胞信號通路密切相關(guān)的因子，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不完全清楚。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)RGS13在人類CRC組織中低表達(dá)，并在CRC臨床組織樣本和細(xì)胞系中進(jìn)行驗證，探究了其在CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用及其可能的下游機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：結(jié)直腸正常細(xì)胞系FHC（CRL-1831）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（Americantypeculturecollection, ATCC）；CRC細(xì)胞系SW480（CBP60019）、SW620（CBP60036）、DLD-1（CBP60037）和HCT116（CBP60028）購自南京科佰生物科技有限公司，均經(jīng)過STR分型鑒定且鑒定無誤。細(xì)胞均使用ATCC推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基均補(bǔ)充有10%胎牛血清、1%雙抗和1%L-谷氨酰胺，并置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.1.2 質(zhì)粒：β-catenin、RGS13過表達(dá)質(zhì)粒購自武漢淼靈生物科技有限公司。慢病毒法構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。將適量293T細(xì)胞接種于6孔板中，使用PolyJetTMDNA體外轉(zhuǎn)染試劑按照說明書操作。使用工作濃度的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.1.3 抗體：RGS13抗體（PA5-68626）購自美國ThermoFisher公司，β-catenin（51067-2-AP）、Flag（66008-4-Ig）、GAPDH（60004-1-Ig）抗體購自美國Proteintech公司。

1.1.4 引物：RGS13引物（正向：5’-AGATTTACATCCAGCCACAGTCCC-3’，反向：5’-GACTTTAGAAATCTGGGGTAGGAAT-3’），細(xì)胞周期蛋白-D1（cyclinD1，CCND1）引物（正向：5’-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3’，反向：5’-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’），c-Myc引物（正向5’-CAGTAGCACTGCGCGATAGA-3’，反向：5’-TGCTTCAGACCTTCGTGACC-3’），基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrixmetalloproteinases7，MMP7）引物（正向：5’-GAGT GAGCTACAGTGGGAACA-3’，反向：5’-CTATGACGCGGGAGTTTAACAT-3’），均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.5 臨床組織樣本：實驗使用的134對CRC組織及其癌旁組織樣本取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，均為通過病理學(xué)檢測確診為CRC，通過外科手術(shù)治療取得的臨床組織。所有程序均通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審查[編號：（2021）第（063）號]。

1.1.6 數(shù)據(jù)庫組織樣本：下載TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://tcga-data.nci.nih.gov/）中的結(jié)腸癌（TCGA-COAD）的exon-SeqV2測序數(shù)據(jù)（Level3，rawcount）和臨床數(shù)據(jù)。其中，數(shù)據(jù)庫中可用于差異分析的CRC與癌旁配對樣本共41對，用于生存分析含無病生存期（disease-freesurvival, DFS）信息的樣本共379例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色：將制作好的切片脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)，1×Tris緩沖液（1×TBS）清洗后3%H2O2封閉30min后用5%BSA封閉30min，甩去后4℃孵育一抗過夜，回收一抗，然后37℃下孵育二抗30min，清洗后鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）孵育30min，滴加DAB顯影液于組織上顯色合適時間，ddH2O終止后蘇木素染色，自來水靜置10min，脫色和透明后制片，光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白的染色情況，軟件分析單位面積下的IOD值（陽性著色）。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）：配好10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）膠后，收集細(xì)胞，處理并定容蛋白樣品，上樣20μL，濃縮膠80V電泳15min，分離膠120V電泳1.5h，使用快速轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜15min，5%脫脂牛奶封閉1h，1×TBS清洗PVDF膜后4℃孵育一抗過夜后回收一抗，4℃孵育二抗3h后回收二抗，使用ECL顯影法顯影。Typhoon7000掃膜儀掃描PVDF膜，保存分析圖像結(jié)果。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timequantitativepolymerasechainreaction, RTqPCR）：TRIzol法提取總RNA并使用SuperScriptTMIV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書反轉(zhuǎn)錄出cDNA后，使用SYBRGreen試劑盒按照說明書進(jìn)行qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參。最后置于Q6qPCR儀中檢測并用2-ΔΔCt法分析。

1.2.4 ATP細(xì)胞活力檢測：先細(xì)胞種板，96 孔板中每孔加入1000個細(xì)胞，用0.1%培養(yǎng)基處理細(xì)胞12h。之后按照對應(yīng)天數(shù)用10%培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，棄培養(yǎng)基后將各25μL的ATP試劑和PBS混合加入孔中。振蕩后1200r/min離心5min。靜置后轉(zhuǎn)至黑色96孔板，加樣后生物發(fā)光儀檢測，保存數(shù)值并分析結(jié)果。

1.2.5 軟瓊脂克隆集落形成實驗：先在6孔板中鋪2mL下層瓊脂膠，凝固后鋪1mL混有1×104個細(xì)胞的上層膠，6孔板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用倒置顯微鏡5倍鏡拍照并計數(shù)含32個細(xì)胞以上的克隆，計算細(xì)胞集落數(shù)形成率并分析結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞遷移侵襲實驗：專用小室上室加400μL0.1%FBS培養(yǎng)基，下室加700μL完全培養(yǎng)基。上室接種細(xì)胞5×104個，培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，之后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，甲醇通透20min，吉姆薩染色液染色20min，擦去未從上室穿出到下室的細(xì)胞，倒置顯微鏡拍照計數(shù)并統(tǒng)計分析。

1.2.7 蛋白降解實驗：先細(xì)胞種板，6孔板中每孔加入3×105個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后分別用0.1%FBS的培養(yǎng)基、MG132試劑（10mmol/L）處理細(xì)胞12h、8h后，加入放線菌酮（cycloheximide, CHX）試劑（50μg/mL）分別處理細(xì)胞0h、3h、6h、12h，Westernblot檢測蛋白降解情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用GraphPadPrism5.0軟件作圖。計量資料以±s表示，兩獨立樣本數(shù)據(jù)比較采用非配對t 檢驗，兩配對樣本數(shù)據(jù)比較采用配對t 檢驗，多組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，生存分析采用Log-rank法，非正態(tài)分布計量資料采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGS13在CRC組織與細(xì)胞系中表達(dá)降低且與CRC患者的分期和無病生存期顯著相關(guān) 本研究選取了TCGA數(shù)據(jù)庫中41對配對的CRC組織樣本和癌旁正常組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在CRC組織樣本中RGS13的mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（P＜0.01），見圖1A；對收集到的134對CRC臨床組織樣本進(jìn)行RT-qPCR實驗，得到了與上述分析一致的結(jié)果（P＜0.01），見圖1B。在蛋白水平上，本研究通過對134對CRC臨床組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗并分析，發(fā)現(xiàn)在CRC組織樣本中，RGS13蛋白表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織（P＜0.01），見圖1C。為了方便進(jìn)一步研究RGS13的功能，本研究在常用的CRC細(xì)胞系及正常結(jié)直腸細(xì)胞系中進(jìn)行了Westernblot檢測。結(jié)果表明，相較于正常結(jié)直腸細(xì)胞系FHC，在HCT116、SW480等CRC細(xì)胞系中RGS13的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，見圖1D。

為了進(jìn)一步研究RGS13的表達(dá)量與CRC惡性程度的關(guān)系，本研究對134對臨床組織免疫組織化學(xué)實驗的結(jié)果按照病例的臨床分期分組并分析。結(jié)果表明，CRC低分期（I+II期，70例）病例的RGS13的蛋白表達(dá)量高于CRC高分期（III+IV期，64例）病例的RGS13的蛋白表達(dá)量（P＜0.01），見圖1E。為了進(jìn)一步闡明RGS13的表達(dá)量與CRC患者預(yù)后的關(guān)系，本研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中的379例CRC患者的DFS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RGS13高表達(dá)組（相對表達(dá)量大于均值0.758，86例）的DFS顯著高于RGS13低表達(dá)組（相對表達(dá)量小于均值0.758，293例，P＜0.01），見圖1F。

2.2 RGS13的下調(diào)可顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲 為了在生物學(xué)功能上驗證RGS13的下調(diào)是否促進(jìn)CRC的惡性進(jìn)展，本研究選用RGS13下調(diào)較為顯著的HCT116和SW480細(xì)胞系，構(gòu)建了RGS13的過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，見圖2A。ATP實驗表明，過表達(dá)RGS13的HCT116和SW480細(xì)胞，其增殖指數(shù)顯著低于對照空載細(xì)胞（P＜0.01），見圖2B、圖2C。進(jìn)行軟瓊脂克隆集落形成實驗檢測細(xì)胞的錨定非依賴生長能力，結(jié)果顯示，過表達(dá)RGS13的HCT116和SW480細(xì)胞，其細(xì)胞克隆集落的形成能力顯著低于對照空載細(xì)胞（P＜0.01），見圖2D、圖2E。細(xì)胞遷移侵襲實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)RGS13的HCT116和SW480細(xì)胞，其遷移與侵襲能力顯著低于對照空載細(xì)胞（P＜0.01），見圖2F、圖2G。

2.3 RGS13可下調(diào)β-catenin的表達(dá)從而影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制CRC細(xì)胞系的增殖、遷移與侵襲 Westernblot結(jié)果表明，在過表達(dá)RGS13的HCT116和SW480細(xì)胞中，β-catenin的表達(dá)量低于對照空載細(xì)胞，見圖3A。使用蛋白酶體阻斷劑MG132預(yù)處理過表達(dá)RGS13的HCT116細(xì)胞和對照空載細(xì)胞后，再使用蛋白合成抑制劑CHX處理不同的時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)RGS13的HCT116細(xì)胞的β-catenin的降解速率高于對照空載細(xì)胞，見圖3B。

圖1 RGS13在CRC組織與細(xì)胞系中表達(dá)降低且與CRC患者分期和無病生存期相關(guān)

圖2 RGS13的下調(diào)可顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

RT-qPCR結(jié)果表明，在過表達(dá)RGS13的HCT116細(xì)胞中，CCND1、c-Myc和MMP7的mRNA水平較對照空載細(xì)胞均發(fā)生了顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖3C。為了進(jìn)一步驗證，本研究在過表達(dá)RGS13的HCT116細(xì)胞中回轉(zhuǎn)了β-catenin的表達(dá)，見圖3D。再次進(jìn)行RTqPCR發(fā)現(xiàn)，相較僅過表達(dá)RGS13的HCT116細(xì)胞，過表達(dá)β-catenin逆轉(zhuǎn)了CCND1、c-Myc和MMP7的mRNA水平（P＜0.01），見圖3E。在生物學(xué)功能方面，ATP實驗、軟瓊脂克隆集落形成實驗和細(xì)胞遷移侵襲實驗共同表明，過表達(dá)β-catenin的HCT116-RGS13細(xì)胞，其增殖活力、集落形成能力和遷移與侵襲能力相較HCT116-RGS13對照空載細(xì)胞均得到了提高（P＜0.01），見圖3F、圖3G、圖3H。

3 討論

圖3 RGS13下調(diào)β-catenin的表達(dá)以影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而抑制CRC細(xì)胞系的增殖、遷移與侵襲

異常的Wnt/β-catenin信號在CRC等癌癥研究中被大量報道，并且普遍認(rèn)為這種異常的信號級聯(lián)是CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[7]，90%的CRC患者都可以發(fā)現(xiàn)該通路的突變[8]。胞質(zhì)中的β-catenin通常需要Wnt信號的激活，包括磷酸化、泛素化等一系列過程，導(dǎo)致β-catenin破壞復(fù)合物解聚，抑制β-catenin降解[9]，導(dǎo)致其在核內(nèi)積累，并促進(jìn)許多癌基因如c-Myc、MMP7和CCND1的轉(zhuǎn)錄[10-11]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)β-catenin穩(wěn)定性的不依賴Wnt的機(jī)制，如在人CRC中發(fā)現(xiàn)APC和RNF43的功能喪失突變，以及CTNNB1和RSPO2/3的功能獲得性突變等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)RGS13在CRC中表達(dá)下調(diào)，增強(qiáng)了β-catenin的穩(wěn)定性，這提示RGS13可能通過不依賴Wnt的途徑調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)，并且，本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin的表達(dá)升高增加了癌基因c-Myc、MMP7和CCND1的轉(zhuǎn)錄活性，且促進(jìn)了CRC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，這可能是RGS13下調(diào)促進(jìn)CRC惡性進(jìn)展的重要分子機(jī)制。

RGS13是G蛋白信號（RGS）家族的調(diào)節(jié)因子，包含一個特征性的保守RGS結(jié)構(gòu)域。研究表明axin2RGS域中的一個位點能阻止axin2 聚合體的形成，對該位點的點突變會導(dǎo)致axin2聚合體的形成，從而增強(qiáng)對β-catenin信號的抑制；同時該研究發(fā)現(xiàn)了一種短肽，其可通過促進(jìn)聚合體的形成從而促進(jìn)β-catenin的降解，抑制β-catenin下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制CRC細(xì)胞的增殖[13]。另外一項研究也發(fā)現(xiàn)了一種小分子KYA1797K，其可以結(jié)合axin的RGS結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)形成β-catenin破壞復(fù)合物，促進(jìn)β-catenin降解，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[14]。β-catenin的降解速率調(diào)控是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵調(diào)控方式，本研究發(fā)現(xiàn)含RGS結(jié)構(gòu)域的RGS13的過表達(dá)可促進(jìn)β-catenin降解，從而影響下游相關(guān)因子的表達(dá)，這提示RGS13可能通過RGS結(jié)構(gòu)域促進(jìn)β-catenin的降解，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的驗證。

綜上，本研究認(rèn)為RGS13或通過直接結(jié)合或間接方式下調(diào)β-catenin的胞質(zhì)穩(wěn)定性，進(jìn)而降低下游關(guān)鍵癌基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而在CRC的進(jìn)展中發(fā)揮抑癌作用，而RGS13的下調(diào)將導(dǎo)致CRC的惡性進(jìn)展。隨著研究的不斷深入，RGS13有望作為分子靶點用于CRC的診斷與治療。