七氟醚通過HIF信號通路對糖尿病心肌保護作用的研究

李瑾 古力帕日·克力木 馬寧

糖尿病可引起心肌功能障礙，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國心腦血管疾病高發(fā)人群中約有11.6%患有糖尿病，糖尿病性心肌病及其與心臟相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率、死亡率逐年上升［1-2］。心血管疾病史、糖尿病史、麻醉等均與圍手術(shù)期患者心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷有關(guān)［3-4］。因而如何避免糖尿病患者I/R 損傷成為亟待解決問題。七氟醚可減輕心肌I/R 損傷，已有研究表明七氟醚后處理（sevoflurane postconditioning，SPostC）也具有保護心肌組織的作用［5］。HIF 信號通路關(guān)鍵蛋白為缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），該信號通路失活可能減弱SPostC 對糖尿病大鼠心肌I/R 損傷的保護作用［6］。因此，本研究通過建立糖尿病大鼠心肌I/R 損傷模型，探討SPostC 是否可通過調(diào)控HIF 信號通路而對糖尿病心肌組織發(fā)揮保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

110 只健康雄性SD 大鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010，210～260 g，自由飲食、進水，常規(guī)培養(yǎng)7 d。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；七氟醚購自美國Abbott Laboratories；HIF 信號通路激活劑去鐵胺（Deferoxamine，DFO）購自美國默克公司；白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒、兔抗鼠缺氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞配體A1（Erythropoietin producing hepatocellular receptor A1，EphrinA1）抗體、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔活性免疫球蛋白（Active immunoglobulin，IgG）二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 建立模型［7］

大鼠禁食12 h，注射濃度為50 mg/kg 的鏈脲佐菌素，72 h 取尾部靜脈血，檢測血糖濃度高于16.7 mmol/L，采用高脂高糖食物持續(xù)喂養(yǎng)8 w，若大鼠出現(xiàn)多飲、多食、重量減輕視為成功建立糖尿病模型。取糖尿病大鼠模型建立I/R 損傷模型：麻醉大鼠（25%烏拉坦），固定大鼠四肢，監(jiān)測大鼠心電圖，暴露頸部前切口，插管，連接呼吸機通氣，在左側(cè)四五肋間（胸骨）開胸，剪開暴露心臟的心包膜，用絲線（6-0）從左心耳下方3 mm 穿透左冠脈前降支，小管阻塞冠脈引起缺血30 min，松開結(jié)扎線，ST 段（ST segment）降低，缺血區(qū)域發(fā)紅，視為造模成功（80 只）。穿線但不結(jié)扎作為假手術(shù)組（sham組）（30只）。

1.2.2 實驗分組

取I/R 建模成功大鼠，隨機分為I/R 組、I/R+SPostC 組（I/R 損傷大鼠再灌注2.4%七氟醚的K-H溶液15 min、正常K-H 溶液105 min）［8］、I/R+DFO組（心肌缺血處理前24 h 腹腔注射DFO）［9］、I/R+SPostC+DFO 組（心肌缺血處理前24 h 腹腔注射DFO，其余步驟同I/R+SPostC 組），每組各20 只。

1.2.3 檢測大鼠血流動力學指標

Powerlab/8SP 采集系統(tǒng)記錄各組大鼠左室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP）、左室舒張末期壓（Left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（Maximum rise rate of left ventricular pressure，+dp/dtmax）。

1.2.4 檢測ROS、MDA 水平

取各組大鼠心肌組織分為兩部分，一部分用于檢測ROS、MDA 水平，另一部分用于檢測HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達量。采用DHE 熒光探針法檢測ROS 水平，硫代巴比妥酸法檢測MDA 水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 ELISA 法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α 水平

從各組大鼠頸總動脈分別抽取3 mL 血液樣本，放入含有肝素抗凝試管中，4℃條件下放置1 h，3 000 r/min 離心10 min（半徑10 cm），吸取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平，應(yīng)用ANTHOSHT11 型酶標儀（上海賽默生物科技發(fā)展有限公司）進行檢測。

1.2.6 Westernblot檢測HIF-1α、EphrinA1蛋白表達量

各組大鼠心肌組織中分別加入400 μL RIPA裂解液提取總蛋白，取40 μg 蛋白樣品，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜，37℃封閉2 h，分別加入HIF-1α（1∶1 000）、EphrinA1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體稀釋液，4℃孵育24 h，洗膜，加入二抗（1∶3 000）稀釋液，37℃孵育1 h，ECL 顯影，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血流動力學指標檢測

與sham 組比較，I/R 組LVDP、+dp/dtmax 水平降低，LVEDP 水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R 組比較，I/R+DFO 組、I/R+SPostC+DFO 組LVDP、+dp/dtmax 水平升高，LVEDP 水平降低差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R+DFO組比較，I/R+SPostC+DFO 組LVDP、+dp/dtmax 水平升高，LVEDP 水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學指標檢測（±s）Table 1 Detection of hemodynamic indexes of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血流動力學指標檢測（±s）Table 1 Detection of hemodynamic indexes of rats in each group（±s）

注：與sham 組相比，aP＜0.05；與I/R 組相比，bP＜0.05；與I/R+DFO 組相比，cP＜0.05。

分組sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 LVDP/mmHg 78.52±6.57 44.31±4.25a 45.33±3.24a 57.82±3.59ab 63.42±4.48abc 215.149＜0.05 LVEDP/mmHg 6.11±0.69 18.15±1.32a 17.85±1.02a 13.23±0.85ab 8.78±0.54abc 828.984＜0.05+dp/dtmax/mmHg·s-1 2803.51±162.32 1492.65±172.33a 1536.82±157.22a 2263.85±180.41ab 2459.71±135.41abc 295.156＜0.05

2.2 各組大鼠ROS 水平、MDA 含量比較

與sham 組比較，I/R 組ROS、MDA 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R 組比較，I/R+DFO 組、I/R+SPostC+DFO 組ROS、MDA 水平降低，I/R+SPostC+DFO 組低于I/R+DFO 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠ROS 水平、MDA 含量比較（±s）Table 2 Comparison of ROS level and MDA content in each group of rats（±s）

表2 各組大鼠ROS 水平、MDA 含量比較（±s）Table 2 Comparison of ROS level and MDA content in each group of rats（±s）

注：與sham 組相比，aP＜0.05；與I/R 組相比，bP＜0.05；與I/R+DFO 組相比，cP＜0.05。

分組sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 ROS 水平（%）75.23±6.57 154.33±12.36a 151.57±10.49a 113.41±8.75ab 88.54±6.78abc 363.381＜0.05 MDA（nmol/mL）1.85±0.26 8.52±0.62a 8.27±0.71a 6.12±0.44ab 4.57±0.29abc 827.750＜0.05

2.3 各組大鼠血漿中炎癥因子的比較

與sham 組比較，I/R 組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R 組比較，I/R+DFO 組、I/R+SPostC+DFO 組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低，I/R+SPostC+DFO 組低于I/R+DFO 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血漿中炎癥因子的比較（±s）Table 3 Comparison of inflammatory factors in plasma of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠血漿中炎癥因子的比較（±s）Table 3 Comparison of inflammatory factors in plasma of rats in each group（±s）

注：與sham 組相比，aP＜0.05；與I/R 組相比，bP＜0.05；與I/R+DFO組相比，cP＜0.05。

TNF-α（pg/mL）193.58±25.52 579.75±56.18a 582.63±47.12a 299.74±24.41ab 253.36±21.03abc 575.407＜0.05分組sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 IL-1β（pg/mL）151.48±19.30 474.74±39.39a 459.11±38.63a 234.38±23.75ab 171.26±20.90abc 650.207＜0.05 IL-6（pg/mL）119.17±13.32 554.86±52.70a 538.64±45.62a 239.12±27.10ab 162.64±19.71abc 854.828＜0.05

2.4 各組大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達的比較

與sham 組比較，I/R 組HIF-1α、EphrinA1 蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與I/R 組比較，I/R+DFO 組、I/R+SPostC+DFO 組HIF-1α、EphrinA1 蛋白水平升高，I/R+SPostC+DFO 組高于I/R+DFO 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、表4。

表4 各組大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達的比較（±s）Table 4 Comparison of HIF-1α and EphrinA1 protein expressions in each group of rats（±s）

表4 各組大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達的比較（±s）Table 4 Comparison of HIF-1α and EphrinA1 protein expressions in each group of rats（±s）

注：與sham 組相比，aP＜0.05；與I/R 組相比，bP＜0.05；與I/R+DFO組相比，cP＜0.05。

分組sham I/R I/R+SPostC I/R+DFO I/R+SPostC+DFO F 值P 值n 30 20 20 20 20 HIF-1α 0.83±0.04 0.32±0.05a 0.34±0.06a 0.50±0.05ab 0.71±0.05abc 492.205＜0.05 EphrinA1 0.78±0.07 0.25±0.04a 0.26±0.05a 0.49±0.06ab 0.65±0.05abc 405.447＜0.05

圖1 各組大鼠HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達的比較Figure 1 Comparison of HIF-1α and EphrinA1 protein expressions in each group of rats

3 討論

針對心血管疾病主要是恢復心肌組織血流再灌注，缺血預(yù)處理可減輕心肌I/R 損傷，但操作過程中無法準確預(yù)測缺血發(fā)生時間點等問題，已有研究表明SPostC 具有保護心肌組織的作用，且具有安全性、可控性等優(yōu)點，并可減輕大鼠心肌I/R損傷，但在糖尿病條件下SPostC 的保護作用被弱化［10-11］。本研究結(jié)果顯示，SPostC 處理后大鼠血流動力學相關(guān)指標較I/R 組無顯著差異，提示SPostC對糖尿病心肌I/R 損傷的作用被減弱及其對心肌功能的作用明顯降低。EphrinA1 屬于HIF-1α 下游調(diào)節(jié)因子，可減小大鼠心肌梗死面積、減輕心肌組織損傷，心肌組織（細胞）缺氧時HIF-1α 被激活，HIF-1α 進入缺氧反應(yīng)原件核心后激活EphrinA1，EphrinA1 可調(diào)節(jié)α-微管蛋白磷酸化而維持心肌細胞結(jié)構(gòu)、功能從而抑制炎癥、細胞凋亡［12-13］。

DFO 是HIF 信號通路激活劑，原理上是通過抑制脯氨酰羥化酶而激活HIF-1α 等轉(zhuǎn)錄因子，本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌I/R 損傷大鼠LVDP、+dp/dtmax 水平降低，LVEDP 水平升高，而DFO 處理后LVDP、+dp/dtmax 水平升高，LVEDP水平降低，且SPostC+DFO 聯(lián)合作用明顯優(yōu)于DFO單獨作用，提示SPostC+DFO 聯(lián)合作用可改善糖尿病心肌I/R 損傷大鼠的血流動力學增強SPostC 對心肌組織的保護作用。線粒體內(nèi)ROS 生成量過多可激活NLRP3 炎性小體，該小體活化可促使蛋白水解，caspase-1 被激活可促進炎性細胞因子表達，加重心肌組織炎癥損傷［14］。機體內(nèi)氧化、抗氧化酶類失衡導致氧自由基大量生成，過度氧化可損害組織功能，MDA 屬于脂質(zhì)過氧化物酶類，其水平升高表示氧化應(yīng)激能力增強，降低其表達可減輕心肌細胞損傷［15］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌I/R 損傷大鼠心肌組織中ROS、MDA 水平升高，DFO、SPostC+DFO 作用后可降低ROS、MDA 水平，且SPostC+DFO 作用改善程度大于DFO 單獨作用，提示SPostC+DFO 作用可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而減輕糖尿病心肌I/R 損傷。持續(xù)高血糖水平導致機體代謝紊亂，炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激均被激活導致心肌細胞功能改變，炎癥反應(yīng)與心肌I/R損傷有關(guān)，麻醉藥物對缺血心肌組織具有保護作用，其可抑制炎性反應(yīng)、減小心肌梗死面積并可改善心功能，TNF-α 可促進相關(guān)炎性因子合成、釋放，還可促進氧自由基生成進而加重心肌I/R 損傷，IL-1β、IL-6 可加重心肌組織炎癥反應(yīng)進而引起損傷［16］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌I/R 損傷大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，DFO、SPostC+DFO 作用后可降低IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，SPostC+DFO 降低炎性因子表達水平的程度明顯優(yōu)于DFO 單獨作用，提示SPostC+DFO 可通過抑制炎癥反應(yīng)而減輕糖尿病心肌I/R 損傷。表明DFO具有抗炎、抗氧化作用，并可恢復SPostC 對糖尿病心肌I/R 損傷的保護作用。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌I/R 損傷大鼠心肌組織中HIF-1α、EphrinA1 蛋白水平降低，DFO、SPostC+DFO 均可促進HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達，SPostC+DFO 對HIF-1α、EphrinA1 蛋白表達的調(diào)控作用明顯強于DFO 單獨作用，提示DFO 可通過激活HIF 信號通路而減輕心肌組織損傷，SPostC+DFO 可能通過促進HIF-1α、EphrinA1 表達而抑制炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)從而強化SPostC 對糖尿病心肌I/R 損傷的保護作用。綜上所述，SPostC、DFO 聯(lián)合處理可激活HIF信號通路而改善血流動力學、抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)從而增強七氟醚對糖尿病心肌的保護作用。