TSLP、Bach2及IL-9在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤鼻息肉中的表達(dá)及臨床意義

魏鑫鑫 李曉玲 黃維平 尹中普

鼻息肉（Nasal polyps，NP）是一種常見的鼻腔或黏膜組織的良性增生，可形成于鼻竇或鼻腔粘膜的任何部位中，多見于慢性鼻竇炎鼻息肉（Chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNPs）［1］。既往研究顯示，CRSwNPs 的主要特征是以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增多為主，且細(xì)胞因子在其發(fā)病機制中發(fā)揮著重大作用［2-3］。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是一種類似IL-7 的細(xì)胞因子，能介導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）炎性反應(yīng)，促進(jìn)Th2 的產(chǎn)生。BTB 與CNC 同源基因2（BTB and CNC homology 2，Bach2）是一類大分子的轉(zhuǎn)錄抑制因子，定位于人的6 號染色體長臂中，能調(diào)節(jié)和維持Th2 免疫反應(yīng)，促進(jìn)Treg 細(xì)胞的分化，有效避免致死性的炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞介素-9（Interleukin-9，IL-9）是一種促炎癥因子，在微生物感染、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等病理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究就TSLP、Bach2、IL-9 在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤鼻息肉（Eosinophilic infiltrating nasal polyps，Eos NPs）中的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年2月至2019年2月于南陽市中心醫(yī)院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的85 例Eos NPs 患者（共85 份下鼻甲組織）設(shè)為實驗組，其中男49 例，女36 例，平均年齡（43.59±9.26）歲。根據(jù)Eos NPs 分期標(biāo)準(zhǔn)［4］分為：Ⅱ型2 期37 例，Ⅱ型3 期48 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①Eos NPs 均符合《中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南》標(biāo)準(zhǔn)［5］；②所有入組患者均無鼻部手術(shù)史；③術(shù)前1 個月未用抗生素、糖皮質(zhì)激素等藥物；④慢性鼻竇炎伴多發(fā)性鼻息肉。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神病史者；②過敏性鼻炎患者；③合并其他惡性腫瘤患者。

收集同一時期在本院行單純鼻中隔矯正術(shù)的52 例患者（共52 份下鼻甲組織）設(shè)為對照組。其中男28 例，女24 例，平均年齡（43.07±8.59）歲。兩組患者基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 TSLP、Bach2 檢測方法

采用SP 免疫組化染色檢測TSLP、Bach2 表達(dá)情況。每例組織蠟塊均切片4 張，厚度約4 μm。所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋、載玻片泡酸、高溫滅菌及多聚賴氨酸涂片等處理。DAB 顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組織化學(xué)染色試劑盒TSLP、Bach2 兔多克隆抗體采購自上海優(yōu)寧維生物科技公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.2 TSLP、Bach2 判定標(biāo)準(zhǔn)［6］

TSLP 主要表達(dá)于粘膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)炎癥細(xì)胞的細(xì)胞漿或細(xì)胞核上，其陽性表達(dá)組織染色較深，呈棕黃色或者棕褐色。Bach2 主要表達(dá)于粘膜上皮層細(xì)胞核內(nèi)，其陽性表達(dá)組織染色較淺，且染色顆粒較少。每個標(biāo)本隨機選取5 個高倍（×400）視野，結(jié)果由兩位高年資醫(yī)師采用雙盲法閱片得到。以細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色顆粒者設(shè)為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比及顯色程度分級：①陽性細(xì)胞百分比：無細(xì)胞顯色者為0 分；陽性細(xì)胞的百分比1%～25%時為1 分；陽性細(xì)胞的百分比26%～50%時為2 分；陽性細(xì)胞的百分比＞50%時為3 分。②顯色程度：無著色或顯色不清楚為0 分；淡黃色者為1 分；棕黃色者為2 分；黃褐色或棕褐色為3 分。將兩種評分綜合作為切片的最終評分，＞3 分為陽性。

1.2.3 IL-9 檢測方法

采集兩組患者空腹靜脈血樣10 mL，常溫靜置10 min 后，經(jīng)3 500 r/min（r=10 cm）離心10 min 處理，分離血清置于-20℃冰箱內(nèi)待檢。采用ELISA檢測血清中IL-9 水平，ELISA 試劑盒采購自美國Elabscience 公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析；采用受試者工作特征曲線（Receiver operating c haracterist ic curve，ROC）評估診斷價值，計算曲線下面積（Area under curve，AUC），AUC 值越高，診斷價值越高，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TSLP、Bach2、IL-9 表達(dá)情況比較

實驗組TSLP 的陽性率及IL-9 水平均高于對照組，Bach2 的陽性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組TSLP、Bach2、IL-9 表達(dá)情況比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of the expression of TSLP，Bach2，and IL-9 between the two groups［n（%），（±s）］

表1 兩組TSLP、Bach2、IL-9 表達(dá)情況比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of the expression of TSLP，Bach2，and IL-9 between the two groups［n（%），（±s）］

組別對照組實驗組t/χ2值P 值n 52 85 TSLP陽性11（21.15）72（84.71）54.567＜0.001陰性41（78.85）13（15.29）Bach2陽性42（80.77）27（31.76）30.993＜0.001陰性10（19.23）58（68.24）IL-9（pg/mL）3.58±0.26 6.97±1.19 20.211＜0.001

圖1 TSLP、Bach2 免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 TSLP，Bach2 immunohistochemical dyeing map（SP，×500）

2.2 不同分期Eos NPs 的TSLP、Bach2、IL-9 表達(dá)情況比較

Ⅱ型2 期的TSLP 陽性率、IL-9 水平低于Ⅱ型3 期，Bach2 陽性率高于Ⅱ型3 期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同分期Eos NPs 的TSLP、Bach2、IL-9 表達(dá)情況比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of TSLP，Bach2，and IL-9 expression of Eos NPs in different stages［n（%），（±s）］

表2 不同分期Eos NPs 的TSLP、Bach2、IL-9 表達(dá)情況比較［n（%），（±s）］Table 2 Comparison of TSLP，Bach2，and IL-9 expression of Eos NPs in different stages［n（%），（±s）］

類別Eos NPs 分型nⅡ型2 期Ⅱ型3 期37 48 TSLP陽性26（70.27）46（95.83）10.539＜0.001陰性11（29.73）2（41.67）陰性16（43.24）42（87.50）t/χ2值P 值Bach2陽性21（56.76）6（12.50）18.881＜0.001 IL-9（pg/mL）6.34±0.82 7.45±1.48 4.099＜0.001

2.3 三項指標(biāo)與不同分期Eos NPs 的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性顯示，TSLP、IL-9與Eos NPs分期呈正相關(guān)（R=0.625，P=0.036；R=0.893，P=0.027），Bach2與Eos NPs分期呈負(fù)相關(guān)（R=-0.875，P=0.027）。

2.4 三項指標(biāo)對Eos NPs 患者的診斷價值

聯(lián)合TSLP、Bach2、IL-9 檢測診斷Eos NPs 的靈敏度（0.945）、特異度（0.907）、AUC（0.926）均顯著高于單一指標(biāo)檢測（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 ROC 曲線圖Figure 2 ROC curve

表3 三項指標(biāo)對Eos NPs 患者的診斷價值Table 3 The diagnostic value of three indicators for Eos NPs patients

3 討論

Eos NPs 是慢性鼻竇炎伴鼻息肉的一種，在東亞發(fā)生率較低，但近年來相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，亞洲Eos NPs 比例在未來仍有繼續(xù)增加的趨勢［7］。探討相關(guān)細(xì)胞因子在Eos NPs 中的表達(dá)，對于Eos NPs的發(fā)生機制和診斷價值有著至關(guān)重要的意義。

TSLP是一種主要來源于上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th2型炎癥反應(yīng)的發(fā)生。TSLP與樹突狀細(xì)胞的受體結(jié)合，通過表達(dá)CD4+的T細(xì)胞，促進(jìn)白介素-4（Interleukin-4，IL-4）等因子的產(chǎn)生，增強Th2的免疫應(yīng)答作用［8］。IL-9作為一種炎性因子，可作用于多種炎癥細(xì)胞，參與氣道炎癥反應(yīng)［9］。Bach2主要表達(dá)于T細(xì)胞及B細(xì)胞中，近年研究顯示，Bach2可維持細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答［10］。本次研究結(jié)果顯示：實驗組TSLP的陽性率及IL-9水平均高于對照組，Bach2 的陽性率低于對照組，提示TSLP、Bach2、IL-9在CRSwNP發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，與張佩珊等［11］研究中Eos NPs患者IL-9、TSLP升高及吳君等［12］研究中Eos NPs患者Bach2低表達(dá)結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-9 表達(dá)于人外周血中的嗜酸性粒細(xì)胞表面，參與過敏性疾病的炎癥反應(yīng)，IL-9 水平升高可促進(jìn)機體全身和鼻腔局部的免疫炎癥反應(yīng)，使各種炎癥細(xì)胞和炎癥因子向炎癥部位遷移，加重鼻腔局部組織損傷和粘膜重塑，促進(jìn)Eos NPs 的發(fā)展［13］。大量的細(xì)胞類型已經(jīng)被證明能夠在體內(nèi)和體外對TSLP 產(chǎn)生反應(yīng)，如T 細(xì)胞被TSLP 刺激時可促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化，從而促進(jìn)Th2 的免疫應(yīng)答作用［14］。吳君等［12］研究表明：Eos NPs 疾病發(fā)展中，Bach2基因可負(fù)向調(diào)節(jié)嗜酸性炎癥機制。氣道上皮細(xì)胞在接觸到病原體或過敏原后能夠產(chǎn)生眾多炎癥介質(zhì)，在黏膜炎癥的發(fā)生中起著重要的作用。本次研究發(fā)現(xiàn)：Ⅱ型2期的TSLP陽性率、IL-9水平低于Ⅱ型3期，Bach2陽性率高于Ⅱ型3期，與既往研究結(jié)果［15］一致，說明TSLP、Bach2、IL-9Eos NPs 患者疾病程度有關(guān)。疾病愈發(fā)嚴(yán)重，浸潤程度增多，TSLP、IL-9及Bach2在促進(jìn)Th2型炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用，對NP的發(fā)展與病情進(jìn)展有著重要影響。

Pearson相關(guān)性顯示，TSLP、IL-9 與Eos NPs 分期呈正相關(guān)，Bach2 與CRSwNP 分期呈負(fù)相關(guān)，與Sidwell 等［16］研究結(jié)果一致?？梢婋S著Eos NPs 患者疾病嚴(yán)重程度的增加，TSLP 陽性率、IL-9 水平會逐漸升高，Bach2 陽性率逐漸下降。這一研究結(jié)果證實TSLP、Bach2、IL-9 均與Eos NPsP 患者病情進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)，臨床可通過檢測TSLP、Bach2、IL-9 評估Eos NPs 患者病變損害程度。進(jìn)一步繪制ROC 曲線結(jié)果顯示：聯(lián)合TSLP、Bach2、IL-9檢測診斷Eos NPs 的靈敏度、特異度、AUC 均顯著高于單一指標(biāo)檢測，表明三者聯(lián)合檢測對診斷CRSwNP 有重要臨床意義。

綜上所述，TSLP、Bach2、IL-9 的表達(dá)水平與Eos NPs 疾病程度和浸潤程度有關(guān)，聯(lián)合三者檢測對診斷Eos NPs、評估患者病情進(jìn)展有重大意義，可為臨床判斷提供新的理論依據(jù)。