黃芩莖葉-虎杖配伍對急性肺損傷大鼠TRPV1 表達及炎性細胞因子的影響

屈新亮，段廣靖，趙 博，謝 鋒，王 斌，高 峰，衛(wèi)培峰，李 敏

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）病理過程較為復(fù)雜，通常由多種因素引起，例如感染、創(chuàng)傷、膿毒血癥等?；颊咧饕行貝?、氣短、呼吸困難等臨床表現(xiàn)，進一步演變可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），病死率達30%～45%［1］。急性肺損傷主要發(fā)病機制與炎癥反應(yīng)相關(guān)，表現(xiàn)為各種病因誘導(dǎo)肺內(nèi)促炎因子生成增加，炎癥因子的大量釋放與激活使肺內(nèi)炎癥反應(yīng)失控，肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞受損、廣泛肺水腫，進一步導(dǎo)致肺部炎性細胞浸潤、水腫、氣體交換障礙［2］。

黃芩、虎杖為兩種傳統(tǒng)的中草藥，均具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化的藥理作用［3-6］。二者發(fā)揮清熱解毒功效時常配伍聯(lián)用［7］。黃芩莖葉與黃芩根的藥理作用相似，也具有抗炎作用［8］。黃芩莖葉-虎杖相互作用關(guān)系尚未明確，對抗炎藥效的影響及機制尚未見深入研究，在一定程度上限制其現(xiàn)代化研究與臨床應(yīng)用，因此闡明其配伍作用機制具有重要意義。

瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）是瞬時受體電位（TRP）家族的成員，有研究表明，TRPV1在感染部位被激活后，在減少炎癥介質(zhì)的分泌和抑制炎癥反應(yīng)過程中具有重要的調(diào)控作用，從而改善了肺損傷。故本研究將探討黃芩莖葉-虎杖配伍后對LPS 誘導(dǎo)大鼠ALI 中炎性因子和TRPV1 表達方面的影響及其機制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

黃芩莖葉（黑龍江省大興安嶺）；虎杖飲片（豪州市永剛飲片廠有限公司）。取黃芩莖葉和虎杖藥材各100 g，加15 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮50 min，雙層紗布過濾；二煎加10 倍量水，武火煮沸后文火煎煮40 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮至1 mL 藥液含生藥1 g，4 ℃以下儲存。

1.2 動物

SPF 級健康雄性SD 大鼠48 只（四川實驗動物質(zhì)量檢測中心），體質(zhì)量（150±10）g，6 周齡，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030，飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度（25±1）℃，相對濕度（50%～60%），自由進食與飲水，動物實驗及方法經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 試劑

LPS（脂多糖，sigma，貨號：L8880）；TNF-α、1L-1β ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)，貨號分別為：ml002859，ml003057）；SOD 活性檢測試劑盒（南京建成，貨號：A001-3-1）；TRPV1 抗體（武漢博士德，貨號：CX0125）；SYBR Green PCR 試劑盒（德國QIAGEN 公 司，貨 號：208052）；RNA 提 取 試 劑 盒TRI reagent（美國英杰，貨號：15596018）。

1.4 儀器

ELx808 全自動酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、ICX40 倒置顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司）、高速冷凍離心機（Thermo）、伯樂電泳儀（BIO RAD）、熒光定量PCR儀（上海羅氏制藥）。

1.5 動物造模與分組處理

將48 只SD 雄性大鼠隨機分為6 組：對照組、模型組、地塞米松陽性組、黃芩莖葉-虎杖配伍低、中、高劑量組。每組8 只。黃芩莖葉-虎杖配伍低、中、高劑量組分別灌胃3.5、7.0、14.0 g/kg，對照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉。地塞米松組大鼠腹腔注射5 mg/kg 地塞米松。連續(xù)給藥7 d，每天給藥1次。第8 天除對照組外，其余各組用1 mL 注射器吸取LPS 溶液（配制成1 mg/mL）經(jīng)大鼠尾靜脈注射8 mg/kg 的LPS 誘導(dǎo)ALI 模型。造模6 h 后，將動物麻醉，取腹主動脈血5 mL，分離血清備用，?80 ℃保存。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值的測定 取新鮮右肺組織，置于超純水中清洗，吸干水分，稱取濕質(zhì)量。將肺組織置于60 ℃恒溫箱干燥，72 h 后，稱重得肺干重，根據(jù)公式W/D=肺組織濕重/肺組織干重×100%計算濕/干質(zhì)量（W/D）比值。

1.6.2 大鼠肺組織病理變化 肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成薄片（約4 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，脫蠟，進行蘇木精-伊紅染色液（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡100 倍視野下觀察肺組織病理變化。

1.6.3 大鼠相關(guān)炎性因子的檢測 測定大鼠肺組織中BALF 上清液中的TNF-α、1L-1β 含量。麻醉并結(jié)扎右肺，暴露氣管行氣管插管，分離并結(jié)扎右側(cè)主支氣管，經(jīng)氣管緩慢注入冷生理鹽水，收集BALF，離心，?80 ℃保存。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，采用酶標(biāo)儀（450 nm）讀取吸光度OD 值，最終計算出樣品的濃度。

1.6.4 大鼠肺組織SOD 的檢測 取大鼠血清，按試劑盒說明書測定各組大鼠肺組織中SOD 的水平。

1.6.5 qRT‐PCR 法檢測肺組織TRPV1mRNA 表達 采用Trizol 法抽提總RNA，根據(jù)試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，β-actin為內(nèi)參照，使用qRT-PCR 試劑盒和羅氏480Ⅱ型qRT-PCR 儀 檢 測TRPV1 的mRNA 水 平。采 用2-ΔΔCT法計算TRPV1 相對表達水平。引物序列見表1。反應(yīng)條件為95 ℃持續(xù)30 s 激活熱啟動酶，95 ℃變性5 s 和60 ℃延伸30 s，共45 個循環(huán)。

表1 引物序列表Tab 1 Primer sequence of TRPV1

1.6.6 Western blot 法檢測肺組織中蛋白表達 在肺組織中加入RIPA 裂解液，于勻漿機中研磨，待充分裂解后，離心取上清，取部分上清蛋白用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將調(diào)整的蛋白濃度與等體積5×上樣緩沖液混合，于沸水中煮沸5 min 上樣，進行SDS‐PAGE 凝膠電泳，200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜70/90 min；封閉后加入TRPV1（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。次日洗膜，加入Ⅱ抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ 統(tǒng)計學(xué)處理圖像分析方法進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin 的灰度比值表示相應(yīng)蛋白表達水平的高低。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以xˉ±s 表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D 值的比較

與對照組相比，模型組大鼠肺組織的W/D 顯著升高（P<0.01），說明肺部水腫較嚴(yán)重；與模型組相比，黃芩莖葉-虎杖配伍組中的低、中、高劑量明顯降低了大鼠肺組織W/D 值（P<0.05），提示藥物可預(yù)防肺水腫。其中黃芩莖葉-虎杖配伍組中的中劑量效果較顯著（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織W/D 比較（n＝8，±s）Tab 2 Comparison of W/D of lung tissue of rats in each group（n＝8，±s）

表2 各組大鼠肺組織W/D 比較（n＝8，±s）Tab 2 Comparison of W/D of lung tissue of rats in each group（n＝8，±s）

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

W/D 2.06±0.21 6.92±0.35**5.74±0.70**#4.99±0.53**#3.84±0.20*##4.51±0.76**##31.62<0.0001組別對照組模型組陽性組低劑量黃芩莖葉-虎杖組中劑量黃芩莖葉-虎杖組高劑量黃芩莖葉-虎杖組劑量（g/kg）--5.0 3.5 7.0 14.0 FP--

2.2 各組大鼠肺組織病理變化的比較

結(jié)果顯示，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無炎性細胞浸潤，未見病理變化；與對照組相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，可見片狀血灶，有大量炎性細胞浸潤；與模型組相比，黃芩莖葉-虎杖的中、高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯改善，炎性浸潤有所減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色（100×）Fig 1 HE staining of lung tissue of rats in each group（100×）

2.3 各組大鼠BALF 中炎性因子的比較

與對照組相比，模型組大鼠肺組織TNF-α、1L-1β 炎性細胞因子水平顯著升高（P<0.01），提示炎性浸潤偏多；與模型組相比，給藥組大鼠BALF 中的TNF-α、1L-1β 水平明顯降低（P<0.05），其中、高劑量尤為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陽性藥地塞米松組大鼠BALF 中的TNF-α、1L-1β 水平明顯降低（P<0.05～0.01），見表3。

表3 各組大鼠BALF 中TNF?α、1L?1β 濃度的比較（pg/mL，n＝8，xˉ±s）Tab 3 Comparison of the concentrations of TNF?α and 1L?1β in the BALF of rats in each group（pg/mL，n＝8，xˉ±s）

2.4 各組大鼠血清中SOD 活性的比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平SOD 活力降低（P<0.01）；與模型組相比，陽性組和低、中、高劑量黃芩莖葉-虎杖配伍組大鼠肺組織血清中SOD 水平明顯增加（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清中SOD 活性的影響（U/mL，n＝8，xˉ±s）Tab 4 Effects of SOD activity in serum of rats in each group（U/mL，n＝8，xˉ±s）

2.5 各組大鼠肺組織TRPV1 mRNA 表達的比較

與對照組相比，模型組大鼠肺組織TRPV1 mRNA 相對表達顯著上調(diào)（P<0.01）；與模型組相比，陽性藥地塞米松組和黃芩莖葉-虎杖的各劑量組大鼠肺組織TRPV1 mRNA 相對表達顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且高劑量黃芩莖葉-虎杖組TRPV1mRNA 相對表達水平低于黃芩莖葉-虎杖低劑量組（P<0.05）。見表5。

表5 各組大鼠肺組織TRPV1 mRNA 表達的比較（n＝8，xˉ±s）Tab 5 Comparison of TRPV1 mRNA expression in lung tis?sues of rats in each group（n＝8，xˉ±s）

2.6 各組大鼠肺組織中TRPV1 蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠肺組織TRPV1 蛋白表達水平顯著上調(diào)（P<0.01）；經(jīng)黃芩莖葉-虎杖處理后，其與模型組相比，明顯下調(diào)了TRPV1 的蛋白表達（P<0.01）。見圖2、表6。

表6 各組大鼠肺組織中TRPV1 蛋白表達水平的比較（n＝8，xˉ±s）Tab 6 Comparison of TRPV1 protein expression in lung tis?sues of rats in each group（n＝8，xˉ±s）

圖2 各組大鼠肺組織中TRPV1 蛋白表達情況Fig 2 The expression bands of TRPV1 protein in the lung tissues of rats in each group

3 討論

ALI 是一種常見的臨床疾病，會導(dǎo)致肺泡毛細血管膜損傷，廣泛的中性粒細胞浸潤和炎癥介質(zhì)的釋放［9］。炎癥反應(yīng)在ALI 的發(fā)生和維持中起著重要作用［10，11］。因此，關(guān)注炎癥過程的潛在目標(biāo)將為預(yù)防和治療ALI 提供新的治療策略。

黃芩莖葉含有黃酮類、酚酸類等多種化學(xué)成分［12］，具有抗炎、抗病毒、抗氧化及保護心肌缺血等顯著藥理活性［8］。在黃芩藥材采收過程中，黃芩莖、葉和花等黃芩地上部分被廢棄，故本研究旨在對黃芩莖葉進行充分利用，加大對黃芩藥用資源的開發(fā)利用［13］?；⒄戎饕锌寡?、抗氧化、抗菌、抗病毒的作用［3］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)虎杖中的主要成分白藜蘆醇苷能降低血清TNF-α、IL-6 水平，增加SOD 水平，改善百草枯所致的急性肺損傷［14］。兩藥協(xié)同配伍發(fā)揮清熱解毒功效，但具體作用及機制尚未闡明。本研究探討了黃芩莖葉配伍虎杖對ALI 是否具有協(xié)同保護作用及具體作用機制。

在各種致病因素引起的肺損傷中，瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）已經(jīng)被證明在炎癥反應(yīng)中充當(dāng)重要角色［15，16］。大多數(shù)TRPV1 表達在肺內(nèi)氣道的上皮及上皮下、血管周圍、氣道平滑肌、肺泡等部位［17］。它可以被溫度（>43 ℃）、辣椒素等激活，因此TRPV1 也被稱為“熱敏感性通道”。有文獻報道，TRPV1 通道被激活后，能夠顯著降低氣道炎癥小鼠的炎癥損傷，其過程可能與降低體內(nèi)TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子有關(guān)［18］。TNF-α、IL-6和IL-1β 是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎性介質(zhì)，在ALI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［19-22］。TNF-α和IL-1β 會增加肺上皮細胞的通透性，進而誘導(dǎo)肺組織損傷和中性粒細胞積聚，從而導(dǎo)致肺水腫［23］。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，可見片狀血灶，W/D 顯著升高，肺水腫及大量炎性細胞浸潤；而黃芩莖葉-虎杖組能明顯改善破壞的肺泡結(jié)構(gòu)，升高SOD 活力，降低大鼠肺組織，減少肺水腫和炎性浸潤。

本研究，與模型組相比，黃芩莖葉-虎杖有效降低 了BALF 中TNF-α、1L-1β 的 水 平，表 明 藥 物 對ALI 的改善與其對炎癥反應(yīng)的抑制有關(guān)。此外，Western blot 法與qRT-PCR 法結(jié)果顯示，相比于模型組，黃芩莖葉-虎杖組顯著下調(diào)TRPV1 蛋白和mRNA 相對表達水平，提示藥物可能通過抑制TRPV1 對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠產(chǎn)生明顯的保護作用。

綜上所述，黃芩莖葉-虎杖對LPS 誘導(dǎo)的ALI大鼠具有保護作用，并其作用機制可能與促進SOD的 活 力，抑 制TNF-α 和IL-1β 的 水 平 以 及 下 調(diào)TRPV1 表達發(fā)揮抗炎作用。

作者貢獻度說明：

屈新亮：實驗撰寫和動物模型構(gòu)建；段廣靖：測定肺組織W/D 值；趙博：ELISA 實驗；謝鋒：動物飼養(yǎng)及分組；王斌：觀察肺組織病理變化；高峰：qRT-PCR 實驗；衛(wèi)培峰：West‐ern blot 實驗；李敏：實驗設(shè)計及校稿。

所有作者聲明不存在利益沖突。