細(xì)葉百合LpAGD14基因的克隆與表達(dá)分析

汪王，田忠平，蘇小霞，楊柳慧，周蘊(yùn)薇(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150000)

GTP酶激活蛋白(GAPs)是一類調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，是ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，Arf)基因功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，能夠與小G蛋白α亞基結(jié)合，激活GTP酶活性，促使GTP水解成GDP，轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔罨癄顟B(tài)[1-2]。失活狀態(tài)的Arf會(huì)結(jié)合到高爾基體上轉(zhuǎn)變成活化態(tài)的ArfGTP，與ArfGAP結(jié)合作用于KDEL-跨膜受體，同時(shí)ArfGAP可以促使ArfGTP水解失活[3-4]。與ArlGTP(類ArfGTPase)不同，ArfGAPs不但能激活霍亂毒素還可以回復(fù)Arf。有研究表明ArfGAP基因主要定位在高爾基體上,參與蛋白質(zhì)在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)蛋白的分類篩選起到促進(jìn)作用，失活狀態(tài)的ARF1的內(nèi)源GTP酶會(huì)抑制高爾基體產(chǎn)生α-淀粉酶和液泡蛋白的共表達(dá)[5]。ArfGAPs作為一種外殼蛋白參與囊泡的形成，是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的重要組成部分[6]。酵母細(xì)胞中GCS1和GLO3(ArfGAP)缺失突變體破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體間的囊泡運(yùn)輸，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)積累，進(jìn)一步證實(shí) ArfGAP在囊泡運(yùn)輸中的重要作用[7]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn), 在動(dòng)物細(xì)胞中，ArfGAPs 參與物質(zhì)跨膜運(yùn)輸過(guò)程[8]；此外，ArfGAPs在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂以及器官分裂等生物過(guò)程同樣發(fā)揮重要作用[9-10]。

關(guān)于Arf參與植物休眠解除進(jìn)程僅在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中有過(guò)報(bào)道[11]。ArfGAP同屬于Arf家族成員，且是高爾基體囊泡的重要組成部分，通過(guò)介導(dǎo)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)ArfGAP是否也能參與植物休眠調(diào)控研究尚屬空白。細(xì)葉百合(Liliumpumilum)地下鱗莖具有休眠特性，未解除休眠的鱗莖開(kāi)花質(zhì)量差甚至出現(xiàn)盲花現(xiàn)象。本研究從細(xì)葉百合鱗莖cDNA文庫(kù)中克隆得到LpAGD14基因，分子生物手段和組織形態(tài)觀察相結(jié)合，對(duì)闡明LpAGD14功能和作用機(jī)制具有重要意義，同時(shí)對(duì)采用基因工程解除植物休眠提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 細(xì)葉百合鱗莖取自東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃。試驗(yàn)于2014年10月中旬選出完好無(wú)損傷的周徑在4～6 cm的鱗莖，用水清洗干凈，再用50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液浸泡30 min后，清水漂洗干凈，晾干。最后用消毒的蛭石(濕度以手握成團(tuán)、放手散開(kāi)為度)混合拌勻，裝入塑料盆中，用保鮮膜封上(膜上打小孔以透氣)，置于4 ℃ 冰箱中冷藏處理。低溫處理階段，以處理第0、30、60、90天樣品分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4時(shí)期，提取RNA，并合成cDNA文庫(kù)。

1.1.2主要試劑和藥品 膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司；熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高保真酶KOD-Plus-Neo購(gòu)自TOYOBO，克隆基因反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara，T載體PMD18-T購(gòu)自全式金公司，內(nèi)切酶KpnⅠ和SpeⅠ購(gòu)自NEB。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)葉百合總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 采用改良的CTAB法提取細(xì)葉百合鱗莖總RNA[12]，采用PrimeScripTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉(zhuǎn)錄cDNA，具體做法是Oligo dT Primer (1 μL)+dNTP (1 μL)+RNA (1 μL)，補(bǔ)水至10 μL，65 ℃保溫5 min，迅速冷卻，上述體系加5×PrimeScrip Ⅱ Buffer (4 μL)+RNase Inhibitor (0.5 μL)+PrimeScrip Ⅱ Rtase (1 μL)，補(bǔ)水至20 μL，經(jīng)42 ℃ 45 min；95 ℃ 5 min后迅速冷卻，即得到cDNA模板。

1.2.2LpAGD14基因的克隆和序列分析 根據(jù)已獲得的該基因最大開(kāi)放閱讀框(ORF)序列設(shè)計(jì)特異性上下游引物L(fēng)pAGD14-F: ATGGCGAATCGGATGAAGGA和LpAGD14-R：AGCAAACCCC TTTGGGAAGA。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆，以M13R為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列采用Clustalx 1.83 軟件與已知的ORF序列進(jìn)行比對(duì)，NCBI在線軟件BlastX進(jìn)行同源比對(duì)。利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；在線分析工具SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)和Pfam (Protein family: http://pfam.Sanger.ac.uk/)用于蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的分析；用Expasy (www.EXPASY.org)預(yù)測(cè)氨基酸相關(guān)理化性質(zhì)。利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)模式 以lilyActin[13](GenBank 登錄號(hào)：JX826390)基因作為內(nèi)參基因，ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix (TOYOBO，Japan)反轉(zhuǎn)錄低溫貯藏4個(gè)時(shí)期總RNA (500 ng)，所得cDNA稀釋5倍作為熒光定量模板。熒光染料采用SYBR Green (TOYOBO，Japan)，在Roche LightCycler96上進(jìn)行如下反應(yīng)：預(yù)變性(95 ℃ for 30 s)；3步法(95 ℃ for 5 s；60 ℃ for 15 s；72 ℃ for 30 s；45 cycles)；溶解(95 ℃ for 10 s；65 ℃ for 60 s；97 ℃ for 1 s)；冷卻(37 ℃ for 30 s)，每組3個(gè)重復(fù)，以S1時(shí)期表達(dá)量為對(duì)照，LpAGD14的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算參考2-ΔΔCt[14]。

1.2.4亞細(xì)胞定位分析基因表達(dá)位點(diǎn) 對(duì)測(cè)序正確的LpAGD14質(zhì)粒稀釋100倍作為模板，設(shè)計(jì)添加酶切位點(diǎn)KpnⅠ (NEB)和SpeⅠ (NEB)的特異性引物：LpAGD14-F:5′-GGTAC∨CATGGCGAATCGGATGAAG-3′和LpAGD14-R:5′-A∨CTAGTCCCAAAAGGGTTTCCTCC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)加上酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒與帶有GFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pBI121-MCS-GFP載體分別經(jīng)KpnⅠ+SpeⅠ雙酶切，酶切體系為：PMD18-T-LpAGD14 /pBI121-MCS-GFP (8 μL)+KpnⅠ(1 μL)+SpeⅠ(1 μL)+CutSmart Buffer (2 μL)+ddH2O (8 μL)，37 ℃酶切20 min，1%瓊脂糖凝膠電泳回收后T4連接過(guò)夜，構(gòu)建pBI121-LpAGD14-GFP植物表達(dá)載體，經(jīng)鑒定后，以pBI121-MCS-GFP為對(duì)照，參考劉鍇棟等[15]的基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥(Aliumcepa)表皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24 h的暗培養(yǎng)，共聚焦顯微鏡觀察基因瞬時(shí)表達(dá)。

1.2.5透射電子顯微鏡觀察高爾基體超微結(jié)構(gòu) 取冷藏處理4個(gè)時(shí)期的細(xì)葉百合鱗莖，通過(guò)固定、沖洗、脫水、滲透、包埋、切片、染色等步驟，電鏡樣品的制備具體參考劉芳等[16]的方法，H-7650透射電子顯微鏡下觀察不同時(shí)期高爾基體形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)葉百合基因LpAGD14的克隆及序列特征分析

采用改良CTAB法提取RNA， 所得RNA 28S條帶亮度大約為18S兩倍，D260/D280介于1.8～2.0間，RNA效果較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，獲得目的基因擴(kuò)增片段，獲得的拼接結(jié)果與已知ORF序列比對(duì)，完全吻合。生物信息學(xué)分析表明，該編碼區(qū)大小為1923 bp,預(yù)測(cè)編碼一個(gè)含有640個(gè)氨基酸的蛋白。具有ArfGAP保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，該結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的第12～130位，由119個(gè)氨基酸組成，屬于Arf基因家族，是一種GTPase。

圖1 LpAGD14的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 The conserved domain prediction of LpAGD14

2.2 LpAGD14基因氨基酸理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

對(duì)基因編碼的氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該蛋白的分子量約為69.43 kDa，理論等電點(diǎn)為8.95，氨基酸的親水指數(shù)為-0.733(正值：疏水；負(fù)值：親水)，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示該蛋白的氨基酸肽鏈位于膜外，推測(cè)其可能不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜類蛋白。LpAGD14基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋，其次為延伸鏈和β-卷角。

2.3 LpAGD14基因氨基酸同源性分析

氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果顯示該氨基酸序列與油棕(Elaeisguineensis)、芭蕉(MusaacuminatesubspMalaccensis)、海棗(Phoenixdactylifera)、鳳梨(Ananascomosus)等多種植物的GTP激活蛋白AGD14具有較高的同源性，都含典型的C4型鋅指結(jié)構(gòu)，有4個(gè)固定的半胱氨酸(cysteine)，即CX2CX16CX2C結(jié)構(gòu)域，分析其與不同物種的GTP激活蛋白AGD14進(jìn)化關(guān)系(圖2)，其中與油棕(XP_010934816)GTP激活蛋白AGD14同源性達(dá)到59%，與其他植物的同源性均在40%以上，因此，將該細(xì)葉百合GTP酶激活蛋白命名為L(zhǎng)pAGD14(登錄號(hào)：KY434115)。

圖2 細(xì)葉百合及其他植物AGD14基因的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of AGD14 of lily and other plants

2.4 LpAGD14基因表達(dá)模式分析

圖3 LpAGD14基因在細(xì)葉百合鱗莖不同休眠時(shí)期的相對(duì)表達(dá)Fig.3 The relative expression of LpAGD14 gene in different dormancy stages of Lilium pumilum

以百合肌動(dòng)蛋白基因lilyActin[13]為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR法對(duì)細(xì)葉百合鱗莖低溫儲(chǔ)藏0 d(S1)、30 d(S2)、60 d(S3)、90 d(S4)鱗莖的LpAGD14基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析(圖3)，結(jié)果表明，LpAGD14基因相對(duì)表達(dá)量在S2時(shí)期較前一時(shí)期增長(zhǎng)3倍，在S3時(shí)期較前一時(shí)期增長(zhǎng)2倍，在S4時(shí)期較前一時(shí)期增長(zhǎng)6倍，差異表達(dá)顯著。

2.5 LpAGD14基因亞細(xì)胞定位分析

共聚集顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空載體質(zhì)粒打入洋蔥表皮后，綠色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞中(圖4A)，而重組融合載體pBI121-LpAGD14-GFP質(zhì)粒打入洋蔥表皮后，在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有較為明顯的綠色熒光，并且能同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光(圖4B)，說(shuō)明pBI121-LpAGD14-GFP融合亞細(xì)胞表達(dá)載體定位在細(xì)胞膜上。

2.6 透射電子顯微鏡觀察高爾基體超微結(jié)構(gòu)

高爾基體結(jié)構(gòu)在低溫貯藏不同時(shí)期具有較為明顯的變化(圖5)。在S1時(shí)期，高爾基體數(shù)量較少，分泌囊泡數(shù)量不多，基本分布為1～3層，到S2時(shí)期，可見(jiàn)高爾基體上分布3～5層扁平囊泡，隨低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在S3時(shí)期高爾基體結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，囊泡層數(shù)繼續(xù)增多，可以觀察到6～7層囊泡，并在S4時(shí)期進(jìn)一步增長(zhǎng)到8～10層，此時(shí)期正與鱗莖休眠解除相對(duì)應(yīng)。

圖4 LpAGD14基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.4 Transient expression of LpAGD14 gene in onionA1, A2, A3: 瞬時(shí)表達(dá)pBI121-MCS-GPF的洋蔥表皮細(xì)胞作為對(duì)照，分別為熒光、白光和重疊視野。B1, B2, B3: 瞬時(shí)表達(dá)pBI121-LpAGD14-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞，分別為熒光、白光和重疊視野。A1, A2, A3：Transiently expressed pBI121-MCS-GPF in onion epidermal cells, fluorescent, bright and vision.B1, B2, B3：Transiently expressed pBI121-LpAGD14-GFP in onion epidermal cells, fluorescent, bright and vision.

圖5 低溫貯藏時(shí)期細(xì)葉百合鱗莖高爾基體超微結(jié)構(gòu)的觀察Fig.5 Golgi bodies ultrastructure observation of Lilium pmnilmn during cold storagea, b, c 和 d分別代表低溫貯藏0、30、60、90 d高爾基體超微結(jié)構(gòu)。Cw: 細(xì)胞壁；G:高爾基體。a, b, c and d represent Golgi bodies ultrastructure during cold storage of 0, 30, 60 and 90 days, respectively. Cw: Cell wall； G: Golgi body.

3 討論

有研究表明，抑制馬鈴薯(Solanumtuberosum)Arf基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物表型及碳水化合物含量發(fā)生變化[17]，而淀粉及可溶性糖和相關(guān)酶活性的變化，能夠進(jìn)一步影響百合鱗莖所處的休眠狀態(tài)[18-19]，推測(cè)Arf基因可能間接參與休眠進(jìn)程的調(diào)控。Liu等[11]從馬鈴薯中克隆得到Arf基因，熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，Arf基因表達(dá)量在馬鈴薯塊莖休眠解除后期顯著增長(zhǎng)，Arf基因積極參與馬鈴薯塊莖休眠解除進(jìn)程。LpAGD14屬于Arf家族下的ArfGAP亞家族成員，在低溫解除細(xì)葉百合鱗莖休眠期間，其表達(dá)量顯著增長(zhǎng)，LpAGD14基因的上調(diào)表達(dá)與鱗莖的休眠解除進(jìn)程相對(duì)應(yīng)。前人發(fā)現(xiàn)，ArfGAPs參與構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)[20]，作為一種主要定位在高爾基體上的外殼蛋白，參與囊泡的形成，是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的重要組成部分[5-6]。小G蛋白中Arf GAP1，Arf GAP2和Arf GAP3對(duì)囊泡的形成具有重要作用[21-24]，通過(guò)膜包裹、形成囊泡、與膜融合或斷裂的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，ArfGAPs能影響細(xì)胞間的物質(zhì)交流，以此調(diào)控植物生物進(jìn)程[25]。此外，高爾基體囊泡被認(rèn)為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)物理相連[26],兩者構(gòu)成細(xì)胞重要的內(nèi)膜系統(tǒng)，參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)超微結(jié)構(gòu)觀察，在低溫貯藏初期，高爾基體囊泡層數(shù)較少，僅可看到1～3層，而在低溫貯藏后期，高爾基體囊泡層數(shù)顯著增多，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，可看到8～10層囊泡層數(shù)，此時(shí)鱗莖已解除休眠狀態(tài)，且LpAGD14基因的相對(duì)表達(dá)量增長(zhǎng)到最大值。分子生物分析結(jié)合組織形態(tài)觀察可以發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏期間，功能基因差異表達(dá)與囊泡層數(shù)變化存在內(nèi)在聯(lián)系，推測(cè)克隆得到的LpAGD14基因可能通過(guò)影響囊泡形成，從而影響物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，對(duì)百合鱗莖休眠與解除產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)中，已確認(rèn)幾種具有ArfGAP活性的蛋白質(zhì)，但大部分ArfGAP 基因在植物中的具體功能研究報(bào)道較少，尤其是對(duì)植物休眠的研究上僅在馬鈴薯中有過(guò)報(bào)道[11]。高爾基體小囊泡是物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體，對(duì)細(xì)葉百合LpAGD14基因的克隆與分析，及進(jìn)一步研究其對(duì)細(xì)胞體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸作用機(jī)制和對(duì)休眠的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

References：

[1] Gillingham A K, Munro S. The small G proteins of the Arf family and their regulators. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2007, 23(23): 579-611.

[2] Tanabe K, Torii T, Natsume W,etal. A novel GTPase-activating protein for ARF6 directly interacts with clathrin and regulates clathrin-dependent endocytosis. Molecular Biology of the Cell, 2005, 16(4): 1617-1628.

[3] Lanoix J, Ouwendijk J, Lin C,etal. GTP hydrolysis by arf-1 mediates sorting and concentration of Golgi resident enzymes into functional COP I vesicles. EMBO Journal, 1999, 18(18): 4935-4948.

[4] Moss J, Vaughan M. Molecules in the ARF orbit. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(34): 21431-20434.

[5] Pimpl P, Hanton S L, Taylor J P,etal. The GTPase ARF1p controls the sequence-specific vacuolar sorting route to the lyticvacuole．Plant Cell, 2003, 15: 1242-1256．

[6] Moss J, Vaughan M. Structure and function of ARF proteins: activators of cholera toxin and critical components of intracellular vesicular transport processes. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(21): 12327-12330.

[7] Poon P P, Cassel D, Huber I,etal. Expression, analysis, and properties of yeast ADP-ribosylation factor (ARF) GTPase activating proteins (GAPs) Gcs1 and Glo3. Methods Enzymol, 2001, 329: 317-324.

[8] Yahara N, Sato K, Nakano A. The Arf1p GTPase-activating protein Glo3p executes its regulatory function through a conserved repeat motif at its C-terminus. Journal of Cell Science, 2006, 119(12): 2604-2612.

[9] Zhuang X L, Jiang J F, Li J H,etal. Over-expression ofOsAGAP, an ARF-GAP, interferes with auxin influx, vesicle trafficking and root development. Plant Journal, 2006, 48(4): 581-591.

[10] Liljegren S J, Leslie M E, Darnielle L,etal. Regulation of membrane trafficking and organ separation by the nevershed ARF-GAP protein. Development, 2009, 136(11): 1909-1918.

[11] Liu B L, Zhang N, Wen Y K,etal. Identification of differentially expressed genes in potato associated with tuber dormancy release. Molecular Biology Reports, 2012, 39(12): 11277-11287.

[12] Du Y P, Li S, He H B,etal. Comparative of methods for RNA extraction from Lily bulb scales. Molecular Plant Breeding, 2010, 8(4): 832-836.

杜運(yùn)鵬, 李雙, 何恒斌, 等. 百合鱗片總RNA提取方法的比較. 分子植物育種, 2010, 8(4): 832-836.

[13] Feng D L, Lai Y, He S L. Cloning, characterization and expression of anArfGAPgene from pepper (CapsicumannuumL.). Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(34): 184-189.

馮冬林, 賴燕, 何水林. 辣椒ArfGAP基因的克隆與表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28(34): 184-189.

[14] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[15] Liu K D, Li H L, Zhong S T,etal. Cloning, subcellular localization and expression analysis ofAsAGfrom sugar apple (AnnonaspuamosaL.). Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(1): 142-154.

劉鍇棟, 黎海利, 鐘舒婷, 等. 番荔枝花器官發(fā)育基因AsAG的克隆, 亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(1): 142-154.

[16] Liu F, Wang J Y, Wang X L,etal. The apical bud cell ultra-structure changes ofLiliumpumilumbulbs during breaking dormancy under refrigerated condition. Acta Horticulturae Sinica, 2013, 40(6): 1110-1118.

劉芳, 王家艷, 王曉麗, 等. 細(xì)葉百合鱗莖在低溫解除休眠過(guò)程中莖尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化. 園藝學(xué)報(bào), 2013, 40(6): 1110-1118.

[17] Zuk M, Prescha A, Keüpczynaski J,etal. ADP ribosylation factor regulates metabolism and antioxidant capacity of transgenic potato tuber. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 288-294．

[18] Sun H M, Li T L, Li Y F. Starch metabolism and sprouting of bulb inLiliumdavidiivar.unicolorstored at different cold temperatures. Acta Horticulturae Sinica, 2004, 31(3): 337-342.

孫紅梅, 李天來(lái), 李云飛. 不同貯藏溫度下蘭州百合種球淀粉代謝與萌發(fā)關(guān)系初探. 園藝學(xué)報(bào), 2004, 31(3): 337-342.

[19] Liu F, Li D D, Lian H,etal. Relationship between dormancy breaking and protective enzymes in refrigeratedLiliumpumilumbulbs. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12): 180-187.

劉芳, 李丹丹, 廉華, 等. 細(xì)葉百合冷藏過(guò)程中鱗莖保護(hù)酶活性與休眠解除的關(guān)系. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(12): 180-187.

[20] Chen P W, Jian X, Luo R,etal. Simpleinvitroassay of Arf GAPs and preparation of Arf proteins as substrates. Methods in Cell Biology, 2015, 30: 69-80.

[21] Kartberg F, Asp L, Dejgaard S Y,etal. ARFGAP2 and ARFGAP3 are essential for COPI coat assembly on the Golgi membrane of living cells. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(47): 36709-36720.

[22] Oix J, Ouwendijk J, Stark A,etal. Sorting of Golgi resident proteins into different subpopulations of COPI vesicles: a role for ArfGAP1. Journal of Cell Biology, 2001, 155(7): 1199-1212.

[23] Ismail S A, Vetter I R, Sot B,etal. The structure of an Arf-ArfGAP complex reveals a Ca2+regulatory mechanism. Cell, 2010, 141(5): 812-821.

[24] Spang A, Shiba Y, Randazzo P A. ArfGAPs: gatekeepers of vesicle generation. FEBS Letters, 2010, 584(12): 2646-2651.

[25] Dodonova S O, Diestelkoetter-Bachert P, von Appen A,etal. A structure of the COPI coat and the role of coat proteins in membrane vesicle assembly. Science, 2015, 349(6244): 195-198.

[26] Sparkes I A, Ketelaar T, De Ruijter N C A,etal. Grab a Golgi: laser trapping of Golgi bodies revealsinvivointeractions with the endoplasmic reticulum. Traffic, 2009, 10(5): 567-571.