砷暴露心臟毒性及其防治研究進(jìn)展

蔣璇璇，何 穎,鐘高龍，伍少峰，萬 方，寧芷君，胡 婷，陳忠偉，趙 武，盧冰霞，唐兆新，張 寧，胡蓮美*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2. 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3. 廣西桂墾牧業(yè)有限公司，廣西 南寧，530022)

砷(As)是一種金屬元素，廣泛分布于巖石、土壤、水和空氣中，自然界中的砷化合物分為無機(jī)砷和有機(jī)砷，其中無機(jī)砷普遍存在于一些砷污染嚴(yán)重地區(qū)的地下飲用水中，且易在生物體內(nèi)發(fā)生蓄積，且三價(jià)砷的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于五價(jià)砷。隨著重金屬產(chǎn)量的急劇增加，受砷污染的地下水成為人類和動(dòng)物在環(huán)境中接觸砷的主要來源。此外，飼料也被認(rèn)為是砷污染地區(qū)動(dòng)物的砷來源。三氧化二砷(AsO)是一種常見的無機(jī)砷化合物，具有致畸致癌致突變的遺傳毒性。AsO的用途十分廣泛，AsO作為藥物早期主要是用于治療惡瘡、鼠疫、瘧疾等疾病。此外，在農(nóng)業(yè)上也常用作消毒劑、除銹劑和殺蟲劑。近期發(fā)現(xiàn)，AsO是治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的有效藥物，因此圍繞AsO治療過程的毒副作用的研究報(bào)道層出不窮。本文就近年來國內(nèi)外對(duì)AsO心臟毒性的機(jī)制研究及其防治進(jìn)行綜述。

1 As2O3心臟毒性

自20世紀(jì)40年代中期以來，以砷為基礎(chǔ)的藥物作為促生長作用的飼料添加劑推廣使用，但過量的砷暴露會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生中毒，且對(duì)心臟的毒性作用對(duì)動(dòng)物的傷害尤為嚴(yán)重。研究表明，AsO心臟毒性作用主要表現(xiàn)為Q-T間期延長，其次是竇性心動(dòng)過速、非特異性ST-T波改變和尖端扭轉(zhuǎn)性心動(dòng)過度，常見的急性副作用有胸腔積液和心包積液。嚴(yán)重情況下，會(huì)出現(xiàn)完全性房室傳導(dǎo)阻滯，甚至導(dǎo)致死亡。此外，AsO還可以引起心臟的微量元素失衡，并損害線粒體功能，影響心臟的能量供應(yīng)。

2 As2O3心臟毒性作用機(jī)制

2.1 As2O3誘發(fā)心臟組織學(xué)損傷

AsO對(duì)心臟組織的損傷比較明顯。在光學(xué)顯微鏡下可觀察到心肌細(xì)胞排列紊亂，肌間隙變寬，并可見多處心肌細(xì)胞大片重度凝固性壞死灶，胞膜受損，胞核固縮、變形或溶解，心肌纖維束間有大量出血。研究表明，心肌纖維化也是AsO引起的慢性心臟毒性的原因之一，目前研究其主要機(jī)制有兩個(gè)，一個(gè)是通過激活A(yù)KT/GSK-3β/Snail信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化；另一個(gè)是引起促纖維化因子TGF-β1表達(dá)增加，促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖。在透射電鏡下可觀察到大量的成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞周圍有大量的膠原沉積，并且心肌細(xì)胞染色質(zhì)在核膜邊緣濃縮，核膜破裂，細(xì)胞質(zhì)空泡化；線粒體空泡化、嵴變形或丟失。

2.2 As2O3誘發(fā)心臟離子通道改變

AsO導(dǎo)致心臟電生理變化主要是通過改變L-鈣離子通道(ICa-L)和鉀離子通道。AsO被報(bào)道對(duì)心臟產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，包括Q-T間期延長、室性心動(dòng)過速和心源性猝死，被認(rèn)為與心臟離子通道的改變密切相關(guān)。Ficker等采用全細(xì)胞膜片鉗和western blot方法，證明了AsO對(duì)Q-T間期的作用是通過增加心肌鈣電流和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中hERG蛋白的加工間接影響鉀離子通道產(chǎn)生的。此外，陳錫創(chuàng)等對(duì)Wistar大鼠連續(xù)靜脈注射AsO(0.8 mg/kg/d)7 d后，測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度并通過全細(xì)胞膜片鉗記錄動(dòng)作電位，進(jìn)一步證明了AsO明顯抑制大鼠心室肌細(xì)胞的鉀電流(Ito，Ik1)，增大ICa-L電流，從而改變心臟動(dòng)作電位的平臺(tái)期，影響心肌復(fù)極化，同時(shí)提示Ito、Ik1、ICa-L是AsO致心律失常的潛在靶點(diǎn)。心肌纖維化也是AsO引起心臟慢性毒性的重要原因之一。最新研究表示，TGF-β1除了介導(dǎo)心肌纖維化外，也可以顯著降低hERG和鉀離子通道(IK1)電流密度和下調(diào)hERG和IK1的表達(dá)，提示TGF-β1信號(hào)的調(diào)節(jié)可能為AsO誘導(dǎo)的心臟電生理異常的治療提供新的策略。眾所周知，細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子通道變化可以觸發(fā)多種反應(yīng)，包括肌肉收縮、酶反應(yīng)、細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄等。Li等通過檢測(cè)NF-κB炎癥因子和鈣離子通道蛋白，證明了AsO可以誘導(dǎo)雞心臟發(fā)生鈣離子超載和炎癥反應(yīng)，并且兩者呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢(shì)，具體機(jī)制有待研究。

2.3 As2O3誘發(fā)心臟氧化應(yīng)激損傷

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)促氧化劑與抗氧化劑之間平衡失調(diào)引起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng)，過多的氧化劑導(dǎo)致氧化還原信號(hào)控制的中斷和分子損傷。實(shí)驗(yàn)室主要通過檢測(cè)ROS和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽相關(guān)酶(GSH，GST，GPx)等抗氧化物酶以及氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平等來評(píng)估機(jī)體氧化應(yīng)激程度。砷由于其原漿毒作用，可以直接損害細(xì)胞器(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng))從而導(dǎo)致活性氧升高，過量的活性氧介導(dǎo)砷的許多有害作用，包括DNA損傷、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)和蛋白過氧化、腫瘤發(fā)生等。Binu等用AsO處理雄性Wistar大鼠30 d后，可觀察到心肌損傷，心臟功能指標(biāo)異常，并且抗氧化物酶(GSH，GST，GPx)活性下降、丙二醛(MDA)水平升高，證明AsO誘導(dǎo)的心臟毒性與抗氧化系統(tǒng)損傷有關(guān)。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)被認(rèn)為是氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子，可被上游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)激活，從Nrf2/Keap1復(fù)合物中釋放后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，與抗氧化元件(ARE)結(jié)合后可以增強(qiáng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括了血紅素加氧酶-1(HO-1)。劉紅艷等通過AsO干預(yù)白血病小鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AsO通過抑制Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)心肌產(chǎn)生氧化性損傷。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，證明了AsO對(duì)心臟的氧化損傷途徑是通過誘導(dǎo)磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的下調(diào)，抑制Nrf2的表達(dá)，從而下調(diào)了HO-1，影響心臟的抗氧化系統(tǒng)。

2.4 As2O3誘發(fā)心臟細(xì)胞自噬

自噬主要起到一種適應(yīng)性作用，在基礎(chǔ)條件下自噬活性維持在一個(gè)較低的水平，當(dāng)機(jī)體受到各種外界刺激，如饑餓、缺氧、感染、氧化應(yīng)激、激素藥物刺激等，自噬會(huì)被顯著上調(diào)，過度的自噬會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，即自噬性細(xì)胞死亡。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，包括起始、延長、成熟、降解四個(gè)階段。調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制復(fù)雜，其中Atg1/ULK1激酶復(fù)合物和mTOR誘導(dǎo)自噬體成核過程，Atg5-Atg12和Atg8-PE兩個(gè)泛素化結(jié)合系統(tǒng)調(diào)節(jié)自噬泡的形成，PI3K激酶和Beclin1參與自噬泡膜的延伸和成熟。此外，“自噬通量”多用來作為檢測(cè)自噬程度的指標(biāo)，目前測(cè)量自噬通量的主要方法有監(jiān)測(cè)LC3的轉(zhuǎn)化率(LC3-II/LC3-I)和P62總細(xì)胞水平。AsO誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和氧化應(yīng)激之間存在微妙的相互作用，砷損傷細(xì)胞器引起的ROS升高引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)自噬激活，激活自噬又能清除損傷的線粒體，從而抑制ROS誘導(dǎo)，起到保護(hù)作用。Li等在基礎(chǔ)日糧中給1日齡的雄雞灌服AsO(30 mg/kg)和CuO(300 mg/kg)12周，結(jié)果顯示As/Cu都可導(dǎo)致心臟內(nèi)出現(xiàn)自噬溶酶體、自噬空泡和雙模結(jié)構(gòu)，通過下調(diào)TORC1、TORC2、LC3-I和上調(diào)LC3-II、Beclin1、Atg5等自噬相關(guān)基因水平證明雞心肌發(fā)生了自噬，并通過提高雞心肌酶活性、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和激活PI3K/AKT/mTORC途徑，引起心肌損傷和自噬。目前看來，盡管砷對(duì)其他器官的損傷和細(xì)胞死亡機(jī)制已有大量的研究，但對(duì)砷誘導(dǎo)的心臟疾病的機(jī)制研究較少。

2.5 As2O3誘發(fā)心臟細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序死亡，形態(tài)學(xué)特征包括細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集、胞膜完整，DNA斷裂，凋亡小體形成。目前已知的細(xì)胞凋亡途徑主要有3條：線粒體通路(內(nèi)源性途徑)、死亡受體通路(外源性途徑)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。AsO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于細(xì)胞類型、暴露時(shí)間和暴露濃度，當(dāng)濃度達(dá)到0.5-2.0 μmol/L，凋亡可由多種機(jī)制觸發(fā)。其中ROS線粒體破壞、caspase激活和MAPK信號(hào)激活是砷誘導(dǎo)凋亡的主要途徑。Yu等在體內(nèi)外證明AsO(1 mg/kg)可以引起心臟的氧化損傷，并且下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)，觸發(fā)線粒體依賴性的凋亡途徑。此外，AsO還可引起大鼠心室肌細(xì)胞異常收縮和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。MAPK亞家族調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、分化和凋亡，包括ERK1/2、p38和JNK激酶。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白以及MAPKs激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，AsO可以誘導(dǎo)豚鼠心臟成纖細(xì)胞凋亡并引起TGF-β1蛋白表達(dá)和MAPKs激活，說明細(xì)胞凋亡可能受TGF-β1和MAPKs調(diào)控。Miao等也證明了AsO可以誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并顯著激活MAPK-家族蛋白。

2.6 其他機(jī)制

近幾年，對(duì)AsO心臟毒性的研究中加入了不少關(guān)于線粒體和能量代謝的研究，包括線粒體功能、線粒體動(dòng)力學(xué)和線粒體發(fā)生，也凸顯了心肌細(xì)胞擁有高密度的線粒體和重要能量供應(yīng)源的特殊地位。研究顯示，AsO暴露導(dǎo)致線粒體嵴紊亂和溶解，線粒體空泡化，并引起線粒體生成超氧化物，顯著降低線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、III、IV的活性，降低細(xì)胞耗氧率，從而影響ATP的生成，無法滿足心臟的高耗能需求。ATP耗竭過程中，線粒體裂變?cè)黾?，然而過度裂變會(huì)觸發(fā)心肌的壞死和凋亡。

3 As2O3心臟毒性的防治

3.1 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

AsO作為治療藥物使用時(shí)，心臟毒性的發(fā)生與劑量、作用時(shí)間和患者的身體狀態(tài)有關(guān)。在使用AsO之前應(yīng)對(duì)患者的心血管進(jìn)行初步評(píng)估，藥物治療后1～2周內(nèi)患者最易出現(xiàn)心臟不良反應(yīng)，這個(gè)時(shí)期常常需要注意監(jiān)測(cè)可能出現(xiàn)的心臟毒性。環(huán)境中的砷污染主要存在人畜飲用水中，研究表明，隨著飲用水源砷含量的降低，環(huán)境水質(zhì)改善，砷中毒癥狀和體征的改善率可能也會(huì)增加。因此，監(jiān)測(cè)并改善砷中毒地區(qū)的水質(zhì)對(duì)控制該病至關(guān)重要。

3.2 抗氧化劑的使用

目前大量的文獻(xiàn)證明，AsO引起心肌損傷是由于受到過量的活性氧和自由基侵蝕導(dǎo)致的，因此抗氧化劑的使用也成為了緩解AsO引起的心臟毒性的重要措施之一，而針對(duì)減輕AsO心臟毒性的抗氧化劑的研究主要集中在內(nèi)源性成分和天然植物提取物。

3.2.1 內(nèi)源性活性物質(zhì) 內(nèi)源性活性物質(zhì)是天然存在人類和動(dòng)物體內(nèi)的一類物質(zhì)，包括激素、維生素、蛋白質(zhì)和一些小分子物質(zhì)等。開發(fā)內(nèi)源性活性物質(zhì)作為藥物對(duì)疾病的治療具有極大的實(shí)用價(jià)值，如今廣泛使用的內(nèi)源性藥物多具有抗氧化、抗衰老的作用。金屬硫蛋白(MTs)是一類普遍存在細(xì)胞內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白。作為一種重要的抗氧化劑，MTs已被證明可用于保護(hù)糖尿病引起的心血管并發(fā)癥，如糖尿病心肌病和阿霉素引起的心肌損傷。Miao等通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，MTs對(duì)AsO誘導(dǎo)的心臟毒性具有保護(hù)作用，并通過完全抑制MAPK亞家族成員(p38、Erk1/2和JNK)激活和細(xì)胞凋亡，阻止AsO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡。硫辛酸(LA)屬于B族維生素中的一種輔酶，存在于線粒體中。有報(bào)道過，LA通過對(duì)腎細(xì)胞的抗氧化作用改善AsO誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。此外，LA對(duì)心臟的保護(hù)作用在于減弱心肌鉀離子流(I)的抑制從而改善AsO誘導(dǎo)的心臟Q-T間期延長。鋅是機(jī)體必需的微量元素之一，Zhao等研究評(píng)估了Zn和AsO在鯉魚心臟的相互作用，結(jié)果顯示Zn可以降低心臟中ROS及MDA水平，增強(qiáng)抗氧化酶SOD、CAT活性，并通過MAPK途徑抑制細(xì)胞內(nèi)ROS簇，減輕AsO引起的心臟氧化損傷；此外，還驗(yàn)證了Zn可以通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制Bax/Bcl-2、Caspase家族和LC3蛋白的表達(dá)，有效抑制AsO誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡。

3.2.2 天然植物提取物 許多中草藥具有清除自由基、增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)的作用，這取決于中草藥中的抗氧化成分，分為黃酮類化合物、酚類化合物、皂苷類、多糖類化合物、其他抗氧化成分。黃酮類化合物是絕大數(shù)植物內(nèi)都含有的一種成分，藥用價(jià)值豐富，可用于防治心腦血管疾病、解肝毒、抗自由基和抗氧化等。Yu等研究表明，花山梨黃酮類化合物(SPF)對(duì)AsO所致心臟毒性具有抗氧化保護(hù)作用，并通過激活PI3K/AKT通路介導(dǎo)Nrf2和HO-1的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)反應(yīng)。SPF還可以調(diào)整Bcl-2蛋白下調(diào)和Bax和Caspase-3蛋白上調(diào)，有效抑制AsO誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體依賴性凋亡。研究發(fā)現(xiàn)丹參主要成分丹酚酸B可以改善經(jīng)AsO作用后的H9c2心肌細(xì)胞活力，減少ROS的產(chǎn)生，并用PI3K抑制劑驗(yàn)證了丹酚酸B是通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，減少AsO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、桑葚、花生及紅酒中，研究發(fā)現(xiàn)高劑量的白藜蘆醇對(duì)AsO所致心臟毒性具有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性及拮抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。丁香酚被證明可減輕脂質(zhì)過氧化，并恢復(fù)心肌膜上Na/K-ATP酶和Ca-ATP酶活性，改善AsO誘導(dǎo)的心率紊亂，糾正了心電圖Q-T間期延長，對(duì)心臟起到保護(hù)作用。此外，粉防已堿和青蒿素也被證明可以改善AsO引起的心肌病理損傷和心電圖Q-T間期延長。最新研究顯示，南天竹總生物堿可以減輕AsO造成的心臟毒性并改善心臟功能。根皮素是存在于蘋果、梨等水果果皮和根皮中的抗氧化成分之一，研究表明根皮素可以降低AsO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ROS生成，增加抗氧化酶的活性，抑制Nrf2表達(dá)，顯著減輕了AsO對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷。此外，還可以有效增加細(xì)胞耗氧率和Ca-ATP酶活性，減輕AsO對(duì)心臟線粒體損傷和致凋亡作用。

綜上所述，目前研究減輕AsO心臟毒性的藥物主要基于氧化應(yīng)激和心臟電生理學(xué)的改善，并且大多數(shù)藥物只針對(duì)單一靶點(diǎn)研究，少有多靶點(diǎn)多通路的藥效研究。此外，研究減輕AsO心臟毒性的藥物種類較為局限。因此，仍需要開展新的藥物研究和對(duì)藥物新靶點(diǎn)及保護(hù)機(jī)制的深入探究。

4 展 望

許多研究表明，環(huán)境中的砷暴露導(dǎo)致的慢性砷中毒顯著增加了人畜患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，而AsO作為APL和實(shí)體瘤的治療藥物，心臟毒性的評(píng)估一直是其在臨床上應(yīng)用的重要考慮。目前對(duì)AsO心臟毒性機(jī)制的研究還缺乏系統(tǒng)、全面、深入的探討，多是局限于單一機(jī)制的研究，仍需要繼續(xù)進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)。藥用植物是目前研究最多的抗氧化劑來源，由于其具有多成分多靶點(diǎn)且毒性低的特點(diǎn)，對(duì)于開發(fā)治療AsO引起心臟毒性的有效方法具有良好前景。