苯丙氨酸解氨酶基因密碼子偏好性與進化分析

李秋娥，秦 余，鄭喬木，譚國棟，廖 海，周嘉裕

(西南交通大學 生命科學與工程學院，成都 610031)

植物中所有含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由苯丙烷類合成途徑直接或間接所產(chǎn)生的，該途徑是植物中最重要的次生代謝途徑之一，與植物的生長發(fā)育和抗逆防御反應(yīng)等生理過程息息相關(guān)[1]。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)將苯丙氨酸非氧化脫氨轉(zhuǎn)化生成反式肉桂酸，然后形成香豆素與綠原酸等中間體，最后轉(zhuǎn)化為異黃酮、木質(zhì)素與生物堿等次生代謝產(chǎn)物[2]。歐芹PAL結(jié)構(gòu)中的Ala-Ser-Gly形成了4-methylidene-imidazole-5-one(MIO)環(huán)化結(jié)構(gòu)，與酶的催化反應(yīng)相關(guān)，為解析PAL的催化機制與合理化改造奠定了基礎(chǔ)[3]。

PAL是苯丙烷合成途徑的第一個關(guān)鍵酶，其表達強弱與植物抗逆性強弱呈正相關(guān)，這也使其成為苯丙烷途徑代謝調(diào)控的重要候選基因之一[4-5]。目前，已從單細胞藻類[6]、裸子[7]與被子植物[8]等不同類別植物中克隆獲得PAL基因。過表達PAL基因的轉(zhuǎn)基因植物獲得了較高的生長發(fā)育速度與較強的抗逆性，而降低PAL基因的表達導致植物木質(zhì)素合成減少和抗逆性減弱[2, 9]。提高PAL基因的表達效率是開展以PAL基因為靶點代謝調(diào)控的重要基礎(chǔ)。然而，由于物種密碼子的不同，其各自特有的偏好性也有所差別，因此必須分析外源基因密碼子偏好性，選擇適宜宿主來表達外源基因，通過對密碼子進行合理優(yōu)化進而提高外源基因的表達效率[10]。此外，通過對密碼子偏好性的分析，還能夠了解密碼子偏好性形成的機制及不同物種間的遺傳進化關(guān)系[11]。

本文從NCBI下載41條不同植物來源的PAL基因序列，及本課題組獲得的暗紫貝母轉(zhuǎn)錄組中的PAL基因序列，利用CodonW、EMBOSS、SPSS、Origin與MEGA等程序與在線軟件獲得密碼子偏好性、RSCU聚類樹及系統(tǒng)進化樹等信息。通過比較擬南芥、煙草、大腸桿菌和酵母等模式生物體的密碼子，確定最適表達宿主。以上結(jié)果將為開展PAL基因的功能鑒定、植物遺傳進化研究及轉(zhuǎn)基因植物培育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)來源

暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)轉(zhuǎn)錄組經(jīng)過功能注釋后，獲得暗紫貝母PAL(FuPAL)基因的CDS序列。其余41種不同植物的PAL基因序列來源于GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，登錄序號見表1。從密碼子使用數(shù)據(jù)庫(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中獲得了模型生物如酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)。

表1 PAL的密碼子偏好性參數(shù)

1.2 PAL基因的密碼子偏好性分析

采用EMBOSS在線程序(http://emboss.toulouse.inra.fr.)以及CodonW程序分析PAL基因的編碼序列(coding sequence，CDS)的RSCU、有效密碼子數(shù)(effective number of codon，ENc)、密碼子G/C含量、密碼子第3位G/C含量GC3s、密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)等，并用SPSS分析相關(guān)基因及基因組密碼子使用偏好性聚類。用PAL基因的ENc及GC3s值構(gòu)建散點圖和ENc-GC3s期望曲線：ENc=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2]。

利用MEGA-X軟件鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建PAL的系統(tǒng)進化樹，檢驗方法設(shè)為Bootstrpmethod，檢驗次數(shù)設(shè)為1 000，分析其在進化上的親緣關(guān)系。通過聚類樹的比較，分析PAL密碼子偏好性與物種進化之間的聯(lián)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL同義密碼子相對使用度

RSCU反映的是特定密碼子編碼其對應(yīng)氨基酸時同義密碼子之間的相對使用概率，當RSCU>1，說明該密碼子的相對使用頻率較高；當RSCU<1，則說明相對使用頻率較低[12]。圖1為根據(jù)42條PAL的RSCU值制作的熱圖，結(jié)果顯示密碼子相對使用度在單子葉植物、雙子葉植物和其他低等植物PAL之間存在較大差異，并且單子葉與其他植物差異存在顯著分界線。單子葉、雙子葉及其他低等植物PAL的優(yōu)勢密碼子(RSCU>1)分別有22、18與10個，且最優(yōu)密碼子分別為CUC、UUG與CUG。由于單子葉植物有ACC、CUC、AUC和GGC等4種優(yōu)勢密碼子的RSCU>2，而其他種類植物優(yōu)勢密碼子的RSCU均小于2，說明單子葉植物的密碼子偏好性強于其他植物[13]。

圖1 PAL的RSCU熱圖

2.2 PAL偏好性相關(guān)參數(shù)比較

圖2為42條PAL的GC、GC3s、CAI與Enc熱圖，顯示不同植物類群的密碼子偏好性參數(shù)可以被有效聚類。單子葉、雙子葉和其他低等植物PAL的GC平均值分別是58.9%、46.6%和53.2%，GC3s平均值分別為75.4%、45%和59%。結(jié)果表明雙子葉植物PAL偏好AT，而單子葉和其他植物PAL偏好CG。單子葉、雙子葉和低等植物ENc平均值分別為42、51.8、50.4。這說明單子葉植物的PAL基因相比其他植物的PAL基因的密碼子偏好性更強。

圖2 PAL的密碼子偏好性參數(shù)

2.3 PAL系統(tǒng)進化樹及RSCU聚類

根據(jù)42條PAL基因的CDS序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)能夠有效反映PAL基因在進化上的親緣關(guān)系(圖3)。42條PAL基因被分為兩大簇類，第1簇由被子植物組成(葡萄、紫萍例外)，第2簇由其他植物組成。第1簇中，單雙子葉植物又分別聚類為兩個小簇。第2簇中，大多數(shù)蕨類與苔蘚植物小立碗蘚聚集。在RSCU聚類(圖4)中PAL基因也可大致分為2大簇。第1簇包含了大多數(shù)雙子葉及少量蕨類、裸子植物；第2簇主要由單子葉、蕨類與苔蘚植物組成，然而單子葉植物玉米和雙子葉植物莧卻單獨形成兩個分支。苔蘚植物小立碗蘚與蕨類問荊靠近，與蕨類退化形成苔蘚類植物的觀點相符。將RSCU聚類與系統(tǒng)進化樹進行比較，表明RSCU聚類反映植物進化的關(guān)系準確度弱于系統(tǒng)進化樹。類似現(xiàn)象已多次發(fā)現(xiàn)，其原因可能源于基因的倍增和重組、水平的基因轉(zhuǎn)移等[14]。

圖3 PAL系統(tǒng)進化樹

圖4 PAL的RSCU值聚類分析

2.4 ENC-polt圖分析

以GC3s為橫坐標，ENC為縱坐標繪制ENc-plot圖，自然選擇或是堿基突變的影響導致密碼子偏好性可以由圖中各點離期望曲線顯示，距期望值近則受堿基突變影響較大，反之受自然選擇影響大[15]。ENc-plot圖(圖5)顯示來源于單子葉植物的暗紫貝母、雜交百合、石蒜、紫萍與鳳梨PAL基因，以及來源于雙子葉植物的擬南芥PAL基因分布于期望曲線附近，表明突變影響是導致這6種PAL基因密碼子偏好性形成的主要因素，而自然選擇影響是導致其余植物密碼子偏好性形成的主要因素。

圖5 PAL基因的ENc-plot分析

2.5 PAL與模式生物密碼子偏好性對比

將42種PAL密碼子使用頻率與大腸桿菌、酵母、煙草與擬南芥等常用表達宿主的基因組密碼子使用頻率進行比較，計算密碼子適應(yīng)指數(shù)，值越大，則說明外源基因在宿主內(nèi)的表達水平越高。結(jié)果顯示，相比煙草，擬南芥更適合作為42種植物PAL的遺傳轉(zhuǎn)化宿主。暗紫貝母、百合、郁金香、異葉天南星、鳳梨、玉米、水稻、西谷椰子、香蕉與紫萍等10種單子葉植物和問荊、江南卷柏和小立碗蘚等低等植物，大腸桿菌是比酵母更適合的外源表達宿主，而酵母是適合其余植物的外源表達宿主。

3 討論與結(jié)論

單雙子葉、低等植物等不同植物來源PAL基因有不同的優(yōu)勢密碼子，提示余下的非優(yōu)勢密碼子可能是密碼改造的重點區(qū)域。裴建軍[16]利用類似思路，對海棲熱袍菌木聚糖酶基因的非優(yōu)勢密碼區(qū)域進行改造，提高了表達效率。Enc值是目前評價密碼子偏好性強弱最具參考價值的參數(shù)，Enc分析發(fā)現(xiàn)植物PAL偏好性整體性較弱，這可能導致植物PAL基因的表達較弱，使其成為苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵步驟。Huang等[9]也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即植物苯丙烷類化合物與PAL基因的表達強度呈正相關(guān)性。分析同樣來自苯丙烷代謝途徑的COMT、4CL[17]等對G/C偏好性，發(fā)現(xiàn)它們具有相同的G/C偏好性，并且來自單子葉植物與低等植物PAL偏好G/C，雙子葉植物PAL偏好A/T，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是單、雙子葉植物在進化過程和生存環(huán)境的差異[18]。同時，推測來源于同一代謝途徑的基因可能受到相近的遺傳壓力，從而表現(xiàn)出相近的密碼子偏好性。

ENc-plot分析(圖5)顯示，雙子葉植物(除擬南芥)與低等植物的PAL基因偏好性主要受自然選擇的影響，單子葉植物既受到突變影響又受到自然選擇影響。這一結(jié)果與張孟偉等[19]的觀點一致，他們認為自然選擇壓力導致了苯丙氨酸解氨酸密碼子使用偏好性的產(chǎn)生。嚴子成等[14]發(fā)現(xiàn)COMT基因的密碼子偏好性形成主要受自然選擇影響。對比基于密碼子偏好性的RSCU聚類與基于核酸序列的系統(tǒng)進化樹證實，RSCU聚類在一定程度上能夠反映物種進化的關(guān)系，但和系統(tǒng)進化樹相比其準確度較弱，推測其原因，可能是PAL核酸序列更易受到自然選擇的影響，而單子葉植物PAL密碼子偏好性受自然選擇與突變的雙重影響。侯惠靜等[20]與嚴子成等[14]也認為基于密碼子偏好性的聚類與物種的真實系統(tǒng)關(guān)系存在少量差異，提示物種分類不僅限于對核苷酸序列分析，也需要結(jié)合不同水平上的綜合結(jié)果才能獲得更準確的結(jié)果。

通過與模式生物對比，可為不同植物PAL選擇適合的外源表達載體提供參考。例如，大腸桿菌相比酵母更適合作單子葉植物PAL的外源表達載體，已有單子葉植物玉米PAL在大腸桿菌中獲得了成功表達，其重組蛋白可同時催化苯丙氨酸和酪氨酸[21]。相比煙草，擬南芥更適合作為所有植物PAL的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，提示以擬南芥基因組密碼子為參考，對PAL基因進行改造，能夠獲得高效表達，用于植物抗逆育種及PAL基因的功能研究。

通過分析42種PAL基因的密碼子偏好性，發(fā)現(xiàn)各序列的優(yōu)勢密碼子，可通過對該基因非優(yōu)勢密碼區(qū)域進行改造從而提高表達效率，為提高植物基因的表達提供理論指導。通過對比模式生物的密碼子偏好性，確定不同植物PAL基因最適表達宿主，大腸桿菌適合絕大多數(shù)單子葉植物表達，酵母適合雙子葉等植物；擬南芥相比煙草更適合作為所有42種植物PAL基因的遺傳轉(zhuǎn)化宿主，可為PAL的異源表達提供理論依據(jù)。研究結(jié)果可為開展植物PAL基因的功能鑒定、植物遺傳進化研究與轉(zhuǎn)基因植物培育等奠定理論基礎(chǔ)。