脛骨橫向骨搬移術促進重度糖尿病足創(chuàng)面愈合機制的初步研究▲

麻仕璽 花奇凱* 鄺曉聰 韋 姣 莫 燕 候 俊

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院關節(jié)外科,廣西南寧市 530021;2 廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,廣西南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學玉林校區(qū)，廣西玉林市 537000)

糖尿病足創(chuàng)面是一種典型的難愈性創(chuàng)面，目前采用脛骨橫向骨搬移(tibial transverse transport，TTT)技術治療效果顯著[1]，其可促進創(chuàng)面原組織再生修復[2]，但對該技術治療效果的生物學機制尚未清楚。本研究通過觀察創(chuàng)面再生愈合時相變化及微血管形成和巨噬細胞極化情況，對TTT技術促進糖尿病足創(chuàng)面愈合的作用機制作初步探討。

1 對象及方法

1.1 觀察對象 選擇2017～2020年在廣西醫(yī)科大學關節(jié)外科住院治療的重度糖尿病足患者61例為研究對象，患者年齡34～83(60.82±9.91)歲,糖尿病足病程1～72(5.43±9.96)個月,Wagner分級3～5級?？紤]到免疫組化檢測的資金及患者依從性問題，從61例患者中隨機挑選Wagner分級3、4、5級各4例患者進行創(chuàng)面邊緣組織免疫組化檢測，12例患者均知情同意。

1.2 納入標準及排除標準 納入標準： (1)糖尿病足Wagner分級3～5級；(2)患者院外經(jīng)血糖控制、創(chuàng)面換藥，創(chuàng)面依然遷延不愈。排除標準：B超或血管造影檢查顯示患者腘動脈流出道狹窄>85%；患者因客觀或主觀因素不配合手術及后期治療；患者近期發(fā)生過心腦血管事件或存在心腦血管疾病的危險因素。

1.3 材料 鼠抗人CD86、CD163、CD31、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)單克隆抗體(美國CST公司)，含10 mL/kit正常羊血清原液、生物素標記羊抗鼠IgG、1 mL/kit辣根酶標記鏈霉卵白素原液3種試劑的免疫組化染色試劑盒(廠家：中國碧云天生物技術有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 創(chuàng)面邊緣組織免疫組化檢測 (1)取材固定：切取創(chuàng)面邊緣組織于10%的福爾馬林溶液中固定；(2)浸蠟包埋；(3)切片貼片；(4)脫蠟水化：二甲苯溶液通透，使用濃度分別為100%、95%、80%、70%的乙醇溶液及蒸餾水依次浸泡；(5)抗原熱修復：修復液中持續(xù)煮沸5 min，冷卻；(6)磷酸緩沖溶液(phosphate buffer solution，BPS)沖洗；(7)內(nèi)源性過氧化物酶活性滅活：3%過氧化氫溶液浸泡，置于37 ℃溫箱15 min；(8)BPS沖洗；(9)封閉非特異蛋白：山羊血清；(10)Ⅰ抗孵育：(添加鼠抗人CD86、CD163、CD31、VEGF單克隆抗體1 ∶500)，置于4 ℃冰箱過夜；(11)37 ℃溫箱復溫，BPS沖洗；(12)Ⅱ抗孵育：滴加生物素標記羊抗鼠IgG(1 ∶100)，37 ℃溫箱孵育15 min；(13)BPS沖洗；(14)滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素稀釋液(1 ∶100)，37 ℃溫箱放置15 min；(15)BPS沖洗；(16)二氨基聯(lián)苯胺顯色；(17)BPS沖洗；(18)蘇木素復染；(19)1%鹽酸酒精分化液分化；(20)飽和碳酸鋰溶液返藍；(21)濃度分別為75%、90%、95%、100%的乙醇溶液依次脫水，二甲苯溶液通透；(22)中性樹膠封片、顯微鏡下觀察染色情況，分別取3個視野，統(tǒng)計每個視野下陽性細胞數(shù)。

1.4.2 創(chuàng)面邊緣組織HE 染色 (1)取材固定：取創(chuàng)面邊緣組織于10%的福爾馬林溶液中固定；(2)浸蠟包埋；(3)切片貼片；(4)脫蠟水化：二甲苯脫蠟，用濃度分別為100%、95%、75%的乙醇溶液及蒸餾水依次浸泡水化；(5)染色：蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化液分化，水洗，飽和碳酸鋰溶液返藍，75%乙醇溶液脫水，伊紅染色液染色；(6)脫水通透：95%、100%乙醇溶液脫水，用二甲苯乙醇溶液(1 ∶1)、二甲苯依次浸泡。

1.5 觀察指標 (1)觀察患者術后創(chuàng)面的愈合情況。(2)術前、術后1個月創(chuàng)面邊緣組織CD86及CD163免疫組化染色結果、陽性細胞計數(shù)和M1/M2值(分別以CD86、CD163單克隆抗體標記M1、M2型巨噬細胞，應用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計陽性細胞計數(shù)，CD86陽性細胞數(shù)與CD163陽性細胞數(shù)之比即為M1/M2值)，以及CD31和VEGF免疫組化染色結果、陽性細胞計數(shù)變化。(3)術前、術后1個月創(chuàng)面邊緣組織HE染色情況。(4)術前及術后1個月，行足部血管造影檢查觀察足部微血管變化。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，術前術后比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 創(chuàng)面愈合情況 61例患者創(chuàng)面全部愈合，愈合時間為1～12(3.83±2.31)個月。創(chuàng)面愈合過程基本按炎癥期、增殖期和重塑期3個階段發(fā)展，炎癥期可見創(chuàng)面黃白、滲液、組織壞死(圖1A、1B)；增殖期潰瘍創(chuàng)面炎癥逐漸消退，開始出現(xiàn)粉紅色顆粒狀肉芽組織，創(chuàng)面邊緣上皮組織逐漸向創(chuàng)面中心爬行(圖1C、1D)；重塑期愈合的創(chuàng)面皮膚外觀逐漸接近正常組織(圖1E)。創(chuàng)面愈合期間有部分患者會出現(xiàn)炎癥期反復和炎癥期與增殖期的重疊。

圖1 不同時期的創(chuàng)面愈合過程形態(tài)變化

2.2 創(chuàng)面邊緣組織免疫組化染色結果 術前CD86陽性細胞呈帶狀分布于表皮中，術后1個月可見陽性細胞減少，呈散在分布(圖2)。術前CD163陽性細胞主要位于真皮層中，術后1個月可見陽性細胞比術前明顯減少(圖3)。術前VEGF陽性細胞較少，術后比術前明顯增多(圖4)。術前CD31陽性細胞較少，術后比術前明顯增多,并呈細小條索狀串聯(lián)，微血管數(shù)量增多(圖5)。

圖2 創(chuàng)面邊緣組織CD86免疫組化染色情況(×40、×100、×400)

圖3 創(chuàng)面邊緣組織CD163免疫組化染色情況(×40、×100、×400)

圖4 創(chuàng)面邊緣組織VEGF免疫組化染色情況(×100)

圖5 創(chuàng)面邊緣組織CD31免疫組化染色情況(×100)

2.3 手術前后M1、M2 型巨噬細胞計數(shù)及M1/M2變化情況 術后M1型巨噬細胞計數(shù)(79.74±13.96)較術前(158.18±29.14)明顯減少(t=12.390，P<0.001)；術后M2型巨噬細胞計數(shù)(32.27±6.62)較術前(43.64±7.70)減少(t=4.407，P<0.001)；術后M1/M2(2.50±0.29)較術前(3.62±0.18)降低(t=9.974，P<0.001)。

2.4 創(chuàng)面邊緣組織HE染色 術前HE染色顯示組織殘缺,未見皮膚附屬器(圖6A、6B、6C)；術后組織結構完整,可見腺體樣結構和膠原沉積(圖6D、6E、6F)。

圖6 創(chuàng)面邊緣組織手術前后HE染色情況(比例尺625 μm、200 μm、100 μm)

2.5 足部血管造影檢查 術前微血管少(圖7A)；術后1個月微血管增多,側支微循環(huán)形成(圖7B)。

圖7 足部血管造影檢查的影像學資料

3 討 論

生物力學領域中，張力-應力法則是對生物組織施加持續(xù)牽拉應力，使張力-應力的機械信號轉化為生物學信號，激發(fā)組織細胞增殖，促進組織再生。TTT是以張力-應力激發(fā)細胞生物效應而促進創(chuàng)面組織再生的微創(chuàng)外科技術，其是在患者脛骨內(nèi)上側骨皮質(zhì)微創(chuàng)開窗，經(jīng)搬移裝置對皮質(zhì)截骨片持續(xù)施加牽張應力，由此產(chǎn)生生物效應，促進創(chuàng)面組織再生修復[3]。本研究中，61例重度糖尿病足患者接受TTT術后創(chuàng)面組織再生愈合，并且術后1個月取創(chuàng)面的新生皮膚做組織學檢查，發(fā)現(xiàn)其表皮、真皮和皮下組織等各層結構完整，基底層的細胞增多，且在真皮與皮下組織發(fā)現(xiàn)膠原沉積和腺體樣結構。足部血管造影檢查顯示術后1個月微血管及側支微循環(huán)形成增多。這提示TTT可促進糖尿病足創(chuàng)面的組織再生。

本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)，術后1個月外周血中基質(zhì)細胞衍生因子-1、單個核細胞、單個核細胞上的CXCR4水平均較術前增高[4]，表明術后介導骨髓干細胞動員的重要信息通路SDF-1/CXCR4信號軸活性增強，骨髓干細胞動員效應增強，進入創(chuàng)面向組織細胞分化的干細胞數(shù)量相應增多，這可能是創(chuàng)面組織再生最重要的細胞生物學基礎。

本研究中大部分糖尿病足患者的創(chuàng)面在術后1～2周出現(xiàn)炎性分泌物逐漸減少，炎癥減輕，局部開始生長粉紅肉芽組織的情況，即使部分創(chuàng)面局部壞死，經(jīng)過再次清創(chuàng)，亦能長出粉紅肉芽組織，這是創(chuàng)面愈合早期的關鍵轉折，標志著創(chuàng)面從遷延不愈的炎癥期進入細胞增殖分化、組織再生的增殖期。有研究表明，創(chuàng)面愈合受多種因素的共同作用影響，巨噬細胞的生物效應在創(chuàng)面組織再生的過程中具有重要的促進作用[5-6]。而創(chuàng)面巨噬細胞的生物效應取決于巨噬細胞的數(shù)量和表型，尤其是M1/M2平衡[7]。 因此，本研究主要從創(chuàng)面巨噬細胞極化、創(chuàng)面愈合分期和微血管增加的角度來進行初步分析。

術前創(chuàng)面黃白、水腫，可見壞死組織和炎性分泌物，處于炎癥期，這一時期糖尿病足創(chuàng)面巨噬細胞數(shù)量和功能異常，M1型巨噬細胞釋放大量炎性因子[8]，創(chuàng)面高炎狀態(tài)導致巨噬細胞向M2表型極化障礙[9],進而導致創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶增多，降解細胞外基質(zhì)及生長因子，阻斷創(chuàng)面血管發(fā)生，膠原沉積減少[10-11]，這是導致創(chuàng)面炎癥遷延不愈并停滯于炎癥期的因素之一。術后1個月M1、M2型巨噬細胞計數(shù)均比術前減少，提示術后創(chuàng)面從高炎狀態(tài)進入低炎狀態(tài)；M1/M2減小，表明M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，M1、M2型巨噬細胞趨向平衡。進入創(chuàng)面的干細胞分泌前列腺素E2、TSG-6、白介素-10等細胞因子以及外泌體，并以旁分泌或其他方式作用于巨噬細胞，調(diào)控細胞內(nèi)相關信息通路，抑制炎性因子的表達，上調(diào)抗炎因子的表達[12]，這是干細胞誘導創(chuàng)面巨噬細胞表型重新編程的主要細胞生物效應，可誘導促炎型M1型巨噬細胞向抗炎型M2型巨噬細胞極化。此外，巨噬細胞炎性因子的表達、分泌減少，由TNF-α等炎性因子誘導單核細胞分化形成的M1型巨噬細胞隨之減少，從而改變創(chuàng)面炎性狀態(tài)。以上因素的綜合作用使創(chuàng)面巨噬細胞發(fā)生質(zhì)變、量變，生物效應也隨之改變。隨著M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化，M1/M2逐漸降低，創(chuàng)面逐漸從M1型巨噬細胞生物效應占主導作用轉變成M2型巨噬細胞生物效應占主導作用。M2型巨噬細胞主要分泌VEGF、血小板衍生生長因子、轉化生長因子-β、內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等促血管生成因子，促進創(chuàng)面炎癥消退和細胞增殖、分化，介導創(chuàng)面血管生成[13-19]。然而這些因子的分泌量取決于創(chuàng)面巨噬細胞M1/M2的平衡，M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，促進血管生成因子的分泌量也隨而增加。轉化生長因子-β調(diào)控相關信息通路誘導間充質(zhì)干細胞向創(chuàng)面遷移募集[15],VEGF、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子誘導干細胞向內(nèi)皮細胞分化，促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移、募集，基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3在細胞遷移的前沿區(qū)域降解纖維蛋白和其他基質(zhì)成分，有利于干細胞、內(nèi)皮細胞的遷移以及管樣結構的形成。血小板衍生生長因子介導間充質(zhì)干細胞和周細胞的錨定，有助于創(chuàng)面新生毛細血管的功能和形態(tài)的維持[20]。此時，創(chuàng)面從炎癥期進入增殖期，臨床可見創(chuàng)面炎性分泌物消退，開始生長出紅潤顆粒狀肉芽組織。綜上，從創(chuàng)面巨噬細胞極化的生物效應與創(chuàng)面愈合的關系來說，M1、M2型巨噬細胞的細胞生物效應在創(chuàng)面血管生成過程中分別起抑制和促進效應。

VEGF是最強的血管生成誘導因子，其在細胞外基質(zhì)中分布的空間梯度是血管形態(tài)發(fā)生的關鍵因素。CD31是血管內(nèi)皮細胞標志物。本研究中術后1個月創(chuàng)面邊緣組織中VEGF、CD31密度均比術前增加，并且CD31陽性細胞呈細小條索狀串聯(lián)，提示術后創(chuàng)面組織中血管內(nèi)皮細胞增多，微血管的生成增多。術后1個月血管造影結果顯示創(chuàng)面微血管比術前增多，下肢血管網(wǎng)的小血管開始增加，提示糖尿病足創(chuàng)面血供改善。創(chuàng)面中血管生成有利于創(chuàng)面組織再生相關的細胞、細胞因子以及創(chuàng)面組織代謝產(chǎn)物的運輸，這是再生修復的先決條件。

綜上所述，TTT可能通過誘導M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化，促進創(chuàng)面M1、M2型巨噬細胞平衡,使創(chuàng)面M2型巨噬細胞生物效應占主導作用，促使創(chuàng)面從炎癥期進入增殖期，促進創(chuàng)面組織的微血管再生，為糖尿病足潰瘍和再生愈合提供血供基礎和良好的微環(huán)境。但TTT技術相關的生物學機制還有待不斷地深入研究，以便推動其發(fā)展和應用。