植物乳桿菌防治雞白痢沙門菌感染的效果評價

呂文亮， 張?zhí)鹛穑?林顯華， 鹿 瑤， 徐海燕， 谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司/山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東泰安271000）

雞白痢是一種常見的禽類疾病，不同品種雞都易感，2 ~ 3 周齡發(fā)病率和死亡率最高，嚴(yán)重時病死率可達(dá)100%（孟繁新，2020），給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的損失。以前使用抗生素是臨床常見的預(yù)防和治療白痢沙門菌感染的方法，然而，這也同時造成了越來越嚴(yán)重的沙門菌耐藥性。 自從2020年7 月1 日我國飼料施行全面禁抗以來，畜禽養(yǎng)殖面臨著巨大地挑戰(zhàn)，人們迫切需要安全、綠色、有效的產(chǎn)品替代抗生素。 研究證實，益生菌是對宿主健康發(fā)揮有益作用的微生物，可有效抑制家禽腸道病原菌，提高生長性能，調(diào)節(jié)腸道菌群，刺激機體免疫功能（閆一博等，2021；于明等，2021；蔣磊等，2019；Jae 等，2013；Akira 等，1990）。許多報道證實乳桿菌對雞白痢沙門菌具有很好的作用。 羅伊氏乳桿菌ATCC 55730 可顯著提高沙門菌誘導(dǎo)的雛雞雞白痢疾病模型的存活率（Zhang等，2012）；干酪乳桿菌DBN023 可減少雞白痢沙門菌CMCC-533 對腸道的損傷， 保護腸道組織（Wang 等，2019）。 已有研究表明， 乳桿菌LB-9703 制劑治療雞白痢沙門菌的效果與抗生素功效相同， 可用于替代抗生素治療雞白痢沙門菌（ 郭 延 軍，2001）。 植 物 乳 桿 菌（Lactobacillus plantarum） 是目前報道較多的對沙門菌屬（Salmonella spp.）有拮抗作用的益生菌物種之一（Sofyan 等，2019；Varmuzova 等，2016；Yin 等，2015）。 本研究選用植物乳桿菌BLCC2-0410（以下稱植物乳桿菌0410），應(yīng)用人工感染雞白痢沙門菌的雛雞，研究其對雛雞死亡率、臟器沙門菌載菌量、腸道乳酸菌數(shù)量、血液生化指標(biāo)、免疫球蛋白和炎癥因子的影響， 來評估該植物乳桿菌BLCC2-0410 對雛雞沙門菌感染的防治效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 益生菌株 植物乳桿菌0410 （BLCC2-0410）， 由山東寶來利來生物工程股份有限公司，生物工程研究院菌種資源保藏中心提供。

1.1.2 攻毒菌株 雞白痢沙門菌CVCC533，購買自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要試劑與儀器 MRS 培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計， 葡萄糖2.0%、 檸檬酸銨0.2%、 乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、吐溫－80 0.1%，pH 6.0， 固體培養(yǎng)基需要加1.5%瓊脂粉。 LBS 瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。 免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白IgM、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。 Thermo 酶標(biāo)儀，購自賽默飛世爾上海儀器有限公司。DHP－9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。 全自動生化分析儀（KHB卓越330），購自科華生物。

1.2 試驗設(shè)計 1 日齡健康海蘭褐雛雞120 只，購自泰安東岳種禽有限公司。 經(jīng)腸道菌群和平板凝集試驗檢測，雛雞未攜帶雞白痢沙門菌。逐只稱重，按體重平均分配到12 組中，10 只/組，每組雛雞的平均體重基本一致， 設(shè)置空白對照組（CK組）、感染組（S 組）、益生菌組（R 組）3 個處理組，每個處理組4 個重復(fù)。

1.2.1 益生菌制劑的飼喂 自1 日齡開始飼喂雛雞益生菌制劑，采用自由飲用的方式，每只雞平均飲用2 mL/d，0 ~ 3 日齡雛雞飲水中活菌濃度為1.0×1010cfu/mL，4 ~ 7 日齡雛雞飲水中活菌濃度為1.0×109cfu/mL，8 ~ 10 日齡雛雞飲水中活菌濃度為1.0×108cfu/mL。

1.2.2 攻菌菌液制備 將雞白痢沙門菌CVCC533 接種到TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h， 將菌液轉(zhuǎn)至無菌離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌泥，用無菌生理鹽水重懸，制成4.0×109cfu/mL 濃度的攻毒菌液。

1.2.3 人工感染試驗 3 日齡開始進(jìn)行雞白痢沙門菌感染， 經(jīng)口灌喂上述雞白痢沙門菌菌液，0.5 mL/只，共進(jìn)行兩次。 第1 次攻菌前停飼16 h，斷水0.5 h，攻菌后0.5 h 恢復(fù)飲食飲水；第2 次攻菌前0.5 h 停飼停水，攻菌后0.5 h 恢復(fù)飲食飲水。 2 次攻菌在24 h 內(nèi)完成。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 死亡率 從試驗開始到試驗結(jié)束， 每天統(tǒng)計雛雞死亡只數(shù)，最后計算雛雞死亡率。

1.3.2 臟器沙門菌載菌量 試驗結(jié)束后， 每處理組取3 只未死亡雛雞，心臟采血后處死，無菌取肝臟、脾臟和腎臟，分別制備成10%（m/m）的組織勻漿液，經(jīng)10 倍倍比稀釋，通過平板計數(shù)法測定臟器沙門菌載菌量。

1.3.3 腸道乳酸菌數(shù)量 取0.5 g 腸道內(nèi)容物溶于4.5 mL 生理鹽水中進(jìn)行10 倍倍比稀釋， 選擇合適的稀釋梯度進(jìn)行菌群數(shù)量測定。 使用平板計數(shù)法測定腸道內(nèi)容物中乳酸菌數(shù)量。

1.3.4 血清免疫指標(biāo) 試驗結(jié)束后， 每處理組取3 只未死亡雛雞，心臟采血，分離血清。 按試劑盒說明書進(jìn)行IgA、IgM、IgG 的測定。

1.3.5 血清炎癥因子檢測 按試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β、IFN-γ 及TNF-α 的測定

1.3.6 血液生化指標(biāo) 用全自動生化分析儀 （卓越330）檢測血清球蛋白、白蛋白、總蛋白及谷草轉(zhuǎn)氨酶含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)用Excel 2010 初步整理， 使用SPSS 13.0 進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，組間數(shù)據(jù)用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌制劑對雛雞死亡率的影響 由表1可知， 感染組和益生菌組雛雞發(fā)病死亡率分別為82.5%、32.5%， 植物乳桿菌可降低雛雞相對死亡率，較感染組降低60.6%，飼喂植物乳桿菌0410可有效的降低雞白痢沙門菌感染雛雞死亡率。

表1 各組雛雞死亡率

2.2 臟器沙門菌載菌量 由表2 可知， 感染組（S）雛雞肝臟、脾臟和腎臟上都檢測到沙門菌，而益生菌組和空白對照組未檢測到沙門菌。 從沙門菌檢測結(jié)果來看， 應(yīng)用植物乳桿菌后可有效防止雞白痢沙門菌在機體內(nèi)的侵染。

表2 臟器沙門菌數(shù)量cfu/g（×102）

2.3 腸道乳酸菌數(shù)量 從表3 可以看出，益生菌組雛雞腸道乳酸菌數(shù)量較空白對照組和感染組分別提高3.32 倍和11.12 倍（P＜0.05），感染組雛雞腸道中乳酸菌數(shù)量最少， 說明飼喂植物乳桿菌可增加攻毒后雛雞腸道內(nèi)乳酸菌數(shù)量。

表3 腸道乳酸菌數(shù)量cfu/g（×102）

2.4 免疫球蛋白 如表4 所示，雛雞飼喂植物乳桿菌0410 后血清中IgG 含量增加，分別較感染組和空白對照組提高6.69%和2.03%； 血清中IgM含量較感染組降低14.63%（P＜0.05）， 較空白對照組降低0.64%（P＞0.05）；益生菌組血清中IgA含量較空白對照組提高7.08%（P＜0.05），較感染組降低4.42%（P＞0.05）。

表4 雛雞血清中免疫球蛋白分析μg/mL

2.5 炎癥因子 如表5 所示， 益生菌組血清中IFN-γ 含量較感染組升高3.94%（P＞0.05），TNFα 含量較感染組升高3.37%（P＞0.05），益生菌組血清中IL-1β 的含量較感染組降低11.29%（P＜0.05）。 益生菌組血清中IL-1β、IFN-γ 和TNF-α含量較空白對照組分別升高7.29%、11.21%（P＜0.05）和6.96%（P＞0.05）。

表5 雛雞血清中炎癥因子分析pg/mL

2.6 生化指標(biāo)檢測 從表6 中可以看出，益生菌組谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST） 濃度較于感染組降低36.06%（P＜0.05），益生菌組白蛋白、球蛋白和總蛋白濃度較感染組分別提高22.75%、27.91%和24.29%（P＞0.05）。 感染雞白痢沙門菌后AST 濃度增高， 而飼喂益生菌可使其濃度降到與空白對照組幾乎相同的水平。 飼喂益生菌后可以提高感染雛雞的蛋白水平， 而幾種蛋白可以反映機體的抵抗力。 表明飼喂益生菌可以提高感染雛雞的抗病力。

表6 生化指標(biāo)檢測

3 討論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)， 用益生菌制劑預(yù)防雞白痢沙門菌有較好的效果。 用屎腸球菌J96 對肉雞進(jìn)行預(yù)處理， 可將雞白痢沙門菌引起的死亡率從50%降低到25%（Carina 等，2000）。 感染雞白痢沙門菌前飼喂干酪乳桿菌DBN023 可將雛雞死亡率由24%將至8%（（Wang 等，2019））。 根據(jù)乳酸桿菌表現(xiàn)出的許多關(guān)鍵特性， 如對酸和膽汁的高耐受性、黏附腸道表面的能力、耐低pH、胃液（抗菌活性）、 抗抗生素、 產(chǎn)生胞外多糖和去除膽固醇（Ruiz 等，2013；Tulumoglu 等，2013）等，其對雞白痢沙門菌應(yīng)具有較好效果。 植物乳桿菌BLCC2-0410 和雞白痢沙門氏菌CVCC533 共培養(yǎng)24 h的體外試驗研究發(fā)現(xiàn)， 雞白痢沙門菌數(shù)量降低了約3 個對數(shù)值（張?zhí)鹛鸬龋?021）。 乳酸桿菌KL1和植物乳桿菌Zhang-LL 混合益生菌有效地降低了雞白痢的死亡率（Chen 等，2020）。 本研究結(jié)果表明， 使用植物乳桿菌BLCC2-0410 后可降低雛雞相對死亡率達(dá)到60.6%。

因益生菌對宿主健康的益生特性， 現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于防治動物疾病。乳酸菌具有的耐酸、耐膽鹽特性， 可以使其在家禽胃腸道內(nèi)發(fā)揮很好的作用。 如乳酸菌可以競爭性消除沙門菌在腸上皮細(xì)胞定植 （Salehizadeh 等，2020；Thirabunyanon 等，2012），保護腸道組織結(jié)構(gòu)完整性，防止細(xì)菌移位而減少臟器的載菌量。本試驗結(jié)果表明，飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 可降低雛雞臟器載菌量，這與一些研究的結(jié)果一致。 有研究證明， 在雞感染模型中，乳酸菌混菌處理后肝臟、脾臟中沙門菌載量降低（Yang 等，2014）。也有研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌WLPL01 艾草發(fā)酵液，能減少肝臟、脾臟中鼠傷寒沙門菌的數(shù)量（詹暉等，2019）。

益生菌的作用可以通過免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子表達(dá)來介導(dǎo)。細(xì)胞因子在宿主防御、 炎癥反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的疾病等方面起重要作用。 TNF-α 是一種多功能細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和急性期反應(yīng)時起著非常重要的作用（Akira等，1990）。IFN-γ 是細(xì)胞免疫的一個常見標(biāo)志物，其含量高低與腸道感染的保護性免疫應(yīng)答相關(guān)（Lee 等，2008）。 腫瘤壞死因子超家族的成員在先天免疫和適應(yīng)性免疫，包括炎癥、凋亡和細(xì)胞增殖中起著至關(guān)重要的作用（Kaiser 等，2014）。使用益生菌可以調(diào)節(jié)雞沙門菌介導(dǎo)的細(xì)胞因子， 包括促炎細(xì)胞因子、T 輔助 （Th）1 細(xì)胞因子和Th2 細(xì)胞因子。 將三周齡雞的微生物群轉(zhuǎn)移至一日齡雛雞的胃腸道可刺激細(xì)胞因子如IL1β、IL8、IL17、IL22和IL18 的表達(dá)（Varmuzova 等，2016）。 本試驗中，飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 后感染白痢沙門菌雛雞血清中炎癥因子TNF-α 和IFN-γ 含量升高，而血清中炎癥因子IL-1β 含量降低，這可能與飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 會影響感染雛雞炎癥反應(yīng)有關(guān)。

在臨床實踐中， 通常通過測定血清免疫球蛋白含量評價機體免疫水平。 受感染的雞可以產(chǎn)生三 種 主 要 的 抗 體：IgG、IgA 和IgM （Ayaz 等，2008）。本研究感染組血清中IgA 濃度高于益生菌組，這與Park 等（2017）研究結(jié)果飼糧中加入枯草芽孢桿菌（T1，T2)免疫球蛋白IgA 濃度顯著提高（P< 0.05）不一致，可能與所使用菌株不同，益生菌可以減緩雞白痢沙門菌感染后免疫球蛋白IgA的升高有關(guān)。有研究證明，乳酸菌制劑提高了鼠傷寒沙門菌感染肉仔雞血清中IgG 和sIgA 含量（鄭江平等，2020）。 本試驗中植物乳桿菌BLCC2-0410 可提高感染白痢沙門菌雛雞血清中IgG 含量與上述研究結(jié)果一致， 提示飼喂植物乳桿菌BLCC2-0410 可提高感染雛雞的免疫功能。

血液生化指標(biāo)可以反映動物機體內(nèi)部代謝水平和健康狀況，球蛋白（GLB）可以增強機體免疫力，白蛋白（ALB）可以維持血液膠體滲透壓（孟競堯等，2021）。 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）是評定動物肝臟功能的重要指標(biāo)， 通常肝細(xì)胞受損會導(dǎo)致血液中轉(zhuǎn)氨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高（許金根等，2020）。益生菌可以顯著影響動物血液生化指標(biāo)。 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可顯著影響不同天數(shù)斷奶山羊球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及總蛋白 （TP） 等生化指標(biāo)， 其中第30 天血清中AST 含量顯著降低（盧佳偉等，2021）。本試驗飼喂植物乳桿菌可使AST 含量顯著降低，基本恢復(fù)到與空白對照組相當(dāng)水平， 可有效防止雞白痢沙門菌對肝臟的侵染。 同時有研究發(fā)現(xiàn)， 日糧中添加0.2%乳桿菌或酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌的復(fù)合微生物制劑均可提高血清中總蛋白水平（劉乃芝等，2012；趙建文，2011；劉淑嬌等，2019）。 在本試驗中使用植物乳桿菌BLCC2-0410 后可增加感染白痢沙門菌雛雞血清中ALB、GLB 和TP 含量，有效提高了機體對雞白痢沙門菌抵抗力。結(jié)果說明，植物乳桿菌BLCC2-0410 可降低白痢沙門菌對肝臟的損傷，提高雛雞抗病能力，有效防治雞白痢沙門菌感染。

4 結(jié)論

通過雞白痢沙門菌感染試驗和飼喂植物乳桿菌0410（BLCC2-0410）的效果評價，飼喂植物乳桿菌0410（BLCC2-0410）對防治雞白痢沙門菌感染具有較好的作用。