PRL 和O2 對HC11 細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下乳蛋白合成的影響

田 青 ， Alexander Jonathan Spitzer， ZHAO Fengqi

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.佛蒙特大學(xué)，伯靈頓05405）

氧化應(yīng)激是促氧化物和抗氧化物之間的不平衡所致。Saeidnia 和Abdollahi（2013）研究表明，奶牛圍產(chǎn)期間隨著代謝需求增加， 尤其是氧氣需求的增加會導(dǎo)致活性氧（ROS）產(chǎn)量的增加，尤其是奶牛乳腺，作為乳汁合成的主要部位，其所承擔(dān)的代謝壓力更易發(fā)生氧化應(yīng)激。 研究表明， 持續(xù)的氧化應(yīng)激將誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化， 繼而引起線粒體損傷，造成細胞凋亡，降低機體免疫功能和炎癥應(yīng)答能力 （Ma 等，2018；Sordillolm 等，2005）。 Ma 等（2019）研究表明，氧化應(yīng)激對免疫系統(tǒng)和炎性應(yīng)答的影響可使奶牛對疾病的易感性增加，酮血癥、脂肪肝、卵巢疾病、低血鈣、低血鎂等患病率隨之升高。 研究表明， 奶牛分娩后乳腺代謝活躍而使高產(chǎn)奶牛乳腺產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），而過量的ROS 會誘導(dǎo)隱性乳房炎的發(fā)生（Ma 等，2018；Mulligan 等，2008）。 同時，Ma 等（2018）研究還發(fā)現(xiàn)， 乳腺的密集生長和牛奶的合成也是乳腺產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥的原因。 促炎作用的發(fā)揮則主要通過有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt （AKT） 和核因子kappa B （NFκB）介導(dǎo)，即過量的ROS 首先激活MAPK 和AKT信號通路，隨后NF-κβ 通路被激活，繼而引發(fā)炎癥因子的高表達， 炎癥反應(yīng)程度和進程加重和延長，乳腺細胞開始受損傷，細胞開始凋亡，乳蛋白基因表達受阻， 乳品質(zhì)變差， 甚至停乳（Abuelo等，2015；Liu 等，2012；Cargnello 等，2011）。 Ma 等（2018）指出，血紅素氧化酶-1（HO-1）和磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1（NQO-1）是兩種重要的II 相解毒酶， 可促進細胞的抗氧化能力，硫氧還蛋白還原酶-1（TXNRD1）是一種重要的奶?？寡趸鞍祝琗CT 是一種控制細胞內(nèi)谷脯甘化合成來源的重要轉(zhuǎn)運載體， 他們是參與機體抗氧化的關(guān)鍵基因， 這四種基因的表達受到Nrf2-ARE 的調(diào)控。 奶牛泌乳、代謝增強、氧化應(yīng)激、炎癥損傷往往相伴而生，但又相互影響，甚至?xí)绊懩膛．a(chǎn)奶和乳品質(zhì)， 給奶業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。 氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生既與代謝中氧氣需求增加有關(guān)，又與機體本身抗氧化能力有關(guān)，因此，

本文假設(shè)如果減少氧氣的供應(yīng)， 或者激活機體抗氧化基因表達，就會對氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)有一定的緩解作用。 本試驗旨在以體外培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞（HC11） 為載體， 探討催乳素和氧氣對HC11 細胞中參與抗氧化的關(guān)鍵基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞模型 HC11 細胞來自于妊娠中期BALB/c 大鼠的細胞系，由美國佛蒙特大學(xué)提供。

1.2 試驗設(shè)計 采用隨機分組試驗設(shè)計，將細胞分為2 組，每組4 個處理，每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)4 個孔， 研究有氧和缺氧狀態(tài)下催乳素對H2O2誘導(dǎo)HC11 細胞乳蛋白相關(guān)基因、 葡萄糖轉(zhuǎn)運因子和細胞因子基因表達的影響。 試驗設(shè)計方案見表1。

表1 試驗設(shè)計

1.3 試驗方法 復(fù)蘇后的HC11 細胞以2 ×105個/孔等密度接種于6 孔板， 先用生長培養(yǎng)基CGM（DMEM/F12，10% FBS，100 U/mL 雙抗，5 μg/mL 胰島素，10 ng/mL EGF，所有試劑均來自美國Gibco公司）培養(yǎng)至細胞80%貼壁后，從培養(yǎng)箱取出細胞，用PBS 清洗細胞3 次，換用前激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基PIM （10% charcoal-treated 馬血清） 培養(yǎng)24 h后，再用PBS 清洗細胞3 次，再換用激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基HIM（0.1 μmol 地塞米松，5 μg/mL 催乳素）分常氧組 （5% CO2培養(yǎng)箱） （0 μg/mL PRL+0 μmol H2O2，5 μg/mL PRL+0 μmol H2O2，5 μg/mL PRL+

0.01 μmol H2O2和5 μg/mL PRL+0.2 μmol H2O2）和缺氧組（缺氧培養(yǎng)箱，O2<6%）（0 μg/mL PRL+0 μmol H2O2，5 μg/mL PRL+0 μmol H2O2，5 μg/mL PRL+0.01 μmol H2O2和5 μg/mL PRL+0.2 μmol H2O2）分別培養(yǎng)3 h 后收獲細胞，用于測定各基因表達。

總RNA 的提取采用RNeasy Plus Kit （Qiagen）試劑盒并按說明書進行，RNA 的轉(zhuǎn)錄采用Super-ScriptTMIII Reverse Transcriptase （Invitrogen）試劑盒并按說明書進行，以GAPDH、β-actin 和HPRT為內(nèi)參，采用SYBR green 試劑盒并按說明書對各基因mRNA 表達量進行分析，基因表達量用2-ΔΔCT法進行計算。 各個基因引物信息詳見表2。

表2 基因引物信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有原始數(shù)據(jù)用SAS 9.1 中TUKEY 單因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05 表示差異顯著。

2 試驗結(jié)果

2.1 有氧和缺氧狀態(tài)下催乳素對HC11 細胞蛋白質(zhì)相關(guān)基因表達的影響 由表3 可見， 在有氧狀態(tài)下， 與對照組相比， 催乳素均顯著誘發(fā)了CSN2、CSN1S1 和α-LA 基因的表達（P< 0.05），且隨著H2O2濃度的增加， 三種蛋白基因的表達量顯著下降（P<0.05）。 在缺氧狀態(tài)下，催乳素顯著誘發(fā)了CSN2、CSN1S1 和α-LA 基因的表達 （P<0.05），隨著H2O2濃度的增加，CSN2、CSN1S1 基因的表達量顯著下降（P< 0.05）。但對α-LA 基因而言，隨著H2O2濃度的增加，其表達量反而顯著上升（P< 0.05）。 與有氧狀態(tài)相比，在缺氧狀態(tài)下，不管有無催乳素作用， 也不管H2O2濃度高低，CSN2和CSN1S1 基因表達量均顯著降低（P< 0.05），而α-LA 基因的表達量則顯著上升（P<0.05）。

表3 有氧和缺氧狀態(tài)下PRL 對HC11 細胞乳蛋白相關(guān)基因表達的影響

2.2 有氧和缺氧狀態(tài)下催乳素對HC11 細胞抗氧化基因表達的影響 由表4 可見， 與對照組相比，在不使用H2O2的條件下，不管有氧還是缺氧，催乳素對抗氧化基因的表達影響差異不顯著（P>0.05）。 但在有氧且使用H2O2的條件下，與對照組相比，HO-1、XCT、TXNRD1 基因的表達量顯著增加， 且隨著H2O2劑量的增加而顯著增加（P<0.05）；對NQO-1 基因，其表達量卻顯著降低（P<0.05）， 隨著H2O2劑量的增加其表達量顯著減少（P< 0.05）。 在缺氧并使用H2O2的條件下，XCT、TXNRD1、NQO-1 和HO-1 基因的表達量與有氧狀態(tài)下的變化趨勢一致（P< 0.05），即在有催乳素作用的基礎(chǔ)上，與有氧狀態(tài)相比，缺氧顯著誘發(fā)了抗氧化基因XCT、TXNRD1 和NQO-1 的表達，并呈顯著的劑量效應(yīng)（P< 0.05），但對TXNRD1 基因，其表達量的變化卻正好相反（P< 0.05）。

表4 有氧和缺氧狀態(tài)下PRL 對HC11 細胞氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)基因表達的影響

2.3 有氧和缺氧狀態(tài)下催乳素對HC11 細胞GLUTs 和炎癥因子基因表達的影響 由表5 可見，在有氧狀態(tài)下，催乳素對GLUTs 基因的表達影響差異不顯著（P> 0.05），卻顯著降低了炎癥因子IL-1β 的基因表達量（P< 0.05）；當(dāng)有氧并使用H2O2的條件下，GLUT8 基因的表達量顯著降低， 且有明顯的H2O2劑量效應(yīng) （P< 0.05），但GLUT1 基因表達變化不明顯（P> 0.05）。 對于炎癥因子，催乳素顯著降低了IL-1基因表達量，且其表達量隨著H2O2劑量的增加而增加 （P<0.05）。 在缺氧狀態(tài)下，催乳素顯著增加了葡萄糖轉(zhuǎn)運因子GLUT1 和GLUT8 基因的表達 （P<0.05）， 也顯著增加了IL-1 基因的表達 （P<0.05）。 但在有氧并使用H2O2的條件下，低劑量的H2O2顯著增加了GLUT1 基因的表達量， 高劑量卻顯著降低了其表達量 （P< 0.05）；H2O2均顯著增加了GLUT8 基因的表達量，且隨著劑量的增加而增加（P< 0.05）。 對于炎癥因子，H2O2顯著增加了IL-1基因表達量，且均隨著H2O2劑量的增加而增加（P< 0.05）。

表5 有氧狀態(tài)下PRL 對HC11 細胞GLUTs和炎癥因子基因表達的影響

3 分析與討論

3.1 有氧和缺氧狀態(tài)下催乳素對HC11 細胞蛋白質(zhì)相關(guān)基因表達的影響 本試驗在有氧和缺氧狀態(tài)下采用不同濃度的H2O2對HC11 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有氧狀態(tài)下，與未經(jīng)H2O2誘導(dǎo)組相比， 催乳素顯著誘發(fā)了CSN2、CSN1S1 和α-LA 基因的表達。當(dāng)HC11 細胞被誘導(dǎo)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時，其CSN2、CSN1S1 和α-LA 基因的表達依然顯著高于未添加PRL 組，這說明催乳素在泌乳和乳蛋白合成方面的作用明顯。 但常氧狀態(tài)下隨著H2O2濃度的增加，三種蛋白基因的表達量也顯著下降， 說明氧化應(yīng)激的確是奶牛養(yǎng)殖業(yè)和奶業(yè)生產(chǎn)中的一個重要問題， 雖然催乳素的存在對泌乳和乳蛋白的合成有一定的保護作用，但也不能完全抵擋氧化應(yīng)激本身造成的損傷。 研究表明，PRL 是雌性動物乳腺生長發(fā)育、啟動和維持泌乳必不可少的激素。在乳腺中，PRL 發(fā)揮作用主要通過JAK/Stat 和PI3K-mTORC2 信號通路調(diào)控乳蛋白的合成（丁洛陽等，2016）。金亞亞等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，100 ~ 400 μg/L 催乳素可以促進BMECs 增殖。200 μg/L 催乳素對BMECs 酪蛋白合成相關(guān)基因表達具有較好的促進效果。 100 μg/L催乳素在翻譯水平上對促進酪蛋白合成效果最好（Lee 等，2015）。 這和本試驗結(jié)果基本一致。 由此可見， 催乳素對乳腺蛋白質(zhì)合成的積極作用是基本得到定論的。

泌乳期奶牛需氧量增大， 導(dǎo)致活性氧產(chǎn)量的增加，進而導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，而減少氧氣的攝入是否會緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的氧化損傷鮮見報道， 因此本試驗同時開展了缺氧狀態(tài)下的研究。 研究表明，在缺氧狀態(tài)下，催乳素顯著誘發(fā)了CSN2、CSN1S1 和α-LA 基因的表達，但隨著H2O2濃度的增加，CSN2、CSN1S1 基因的表達量也顯著下降，這與有氧狀態(tài)下的趨勢一致。與有氧組相比，不管是在對照組還是催乳素誘導(dǎo)組，也不管是在低濃度還是高濃度的H2O2誘導(dǎo)組，其CSN2 和CSN1S1 基因表達量均顯著降低。 這說明， 缺氧狀態(tài)下催乳素雖然可以緩解氧化應(yīng)激帶來的損傷，但是緩解的能力非常有限，氧氣不足更加劇了氧化應(yīng)激造成的損傷， 對乳腺泌乳和乳蛋白合成的影響更大。 這一點可以由本試驗中得到的在缺氧和氧化損傷狀態(tài)下α-LA 基因的表達量的顯著上升來解釋，氧化損傷也嚴(yán)重，機體為了對抗損傷， 就需要動員諸如α-LA 等具有免疫功能的基因來參與損傷的修復(fù)， 進而盡可能的保持乳腺健康和正常泌乳功能。

3.2 有氧和缺氧狀態(tài)下催乳素對HC11 細胞氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)基因表達的影響 郭詠梅（2020）研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期和泌乳前期的高產(chǎn)奶牛代謝水平明顯增強，機體抗氧化功能顯著降低，很容易誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致疾病易感性增加，如乳腺炎、酸中毒、酮癥等。因此，除了泌乳激素調(diào)控， 如何動員機體的抗氧化基因來對抗氧化應(yīng)激而維持機體的代謝平衡也很關(guān)鍵。

抗氧化系統(tǒng)主要包括酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑， 兩者協(xié)同保護細胞免受自由基誘導(dǎo)的氧化損傷。 Lee 等（2015）研究表明，TrxR1 是細胞質(zhì)中一種重要的硒蛋白，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2快速地易位入核并與EpRE、ARE 結(jié)合，EpRE、ARE 存在于其目標(biāo)抗氧化酶 （HO-1，NQO-1、GCLC 和TrxR1 等） 基因的啟動子區(qū)域并誘發(fā)其轉(zhuǎn)錄。本試驗研究表明，不管在有氧還是缺氧狀態(tài)下，催乳素對抗氧化基因的表達影響不大。但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下， 催乳素顯著增加了HO-1、XCT、TXNRD1 基因的表達量，且隨著H2O2劑量的增加而顯著增加。 說明當(dāng)機體受到氧化應(yīng)激損傷時，HO-1、XCT、TXNRD1 基因表達就會被激活，從而提高機體抗氧化應(yīng)激的能力， 這與李前輝等（2021）的研究結(jié)果一致。

Abd 等（2021）試驗還發(fā)現(xiàn)，NQO-1 基因的表達量顯著降低，且隨著H2O2劑量的增加而顯著減少。 研究表明，NQO-1 參與抗氧化活性和應(yīng)激下關(guān)鍵調(diào)控蛋白的穩(wěn)定， 對于本試驗中NQO-1 基因的表達量顯著降低，且隨著H2O2劑量的增加而顯著減少的結(jié)果與前人的研究結(jié)果不太一致，其原因可能是氧化應(yīng)激狀態(tài)造成了NQO-1 基因的損傷，也有可能與NQO-1 基因的多態(tài)性有關(guān)，同樣的矛盾結(jié)果也有報道。 據(jù)報道，NQO1 基因缺失，易使小鼠受到氧化應(yīng)激的影響，發(fā)展為腫瘤；但也有報道稱NQO1 敲除可減少膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖， 而過度表達則增加細胞增殖（Dinkova等，2010）。除了酶活性、抗氧化活性和應(yīng)激下關(guān)鍵調(diào)控蛋白的穩(wěn)定作用之外，已有證據(jù)表明NQO-1在癌癥生物學(xué)中具有雙重效應(yīng)， 既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為腫瘤促進因子，因此，產(chǎn)生此結(jié)果的具體原因還有待進一步研究。

本試驗研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)， 在缺氧并處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HC11 細胞中HO-1、XCT、TXNRD1和NQO-1 基因的表達量均顯著上調(diào)， 且隨著劑量的增加而顯著增加。在有催乳素作用的基礎(chǔ)上，與有氧狀態(tài)相比， 缺氧顯著誘發(fā)了抗氧化基因XCT、TXNRD1 和NQO-1 的表達， 并呈顯著的劑量效應(yīng)，說明缺氧更加誘發(fā)了氧化應(yīng)激損傷，為了對抗這種損傷，機體會動員抗氧化基因的表達，進而增強機體的抗氧化能力。

3.3 有氧或缺氧狀態(tài)下催乳素對HC11 細胞GLUTs 和炎癥因子基因表達的影響 本試驗研究結(jié)果表明， 在常氧狀態(tài)下， 催乳素顯著增加了GLUTs 基因的表達量，卻顯著降低了炎癥因子的基 因 表 達 量 （P< 0.05）。 H2O2均 顯 著 降 低 了GLUT8 基因的表達量（P< 0.05）。 葡萄糖轉(zhuǎn)運因子（GLUTs）是一類調(diào)控細胞外葡萄糖進入細胞內(nèi)的跨膜蛋白家族，參與糖代謝、炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答等過程。 張青玲 （2020） 研究表明，GLUT1 和GLUT8 轉(zhuǎn)運蛋白在乳腺發(fā)育過程中表達增加，泌乳時GLUT1 mRNA 表達增加20 倍，GLUT8 蛋白表達增加2 倍。說明在未發(fā)生氧化應(yīng)激的乳腺中，PRL 有利于增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運能力而為乳腺提供能量，此時炎癥因子處于低表達狀態(tài)；而在機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激時，炎癥基因表達逐漸增強，說明氧化應(yīng)激狀態(tài)下炎癥反應(yīng)同步開始。本試驗中，常氧狀態(tài)下， 在存在PRL 的前提下，GLUT1 表達差異不顯著，GLUT8 在氧化應(yīng)激狀態(tài)下表達量顯著降低；催乳素顯著降低了IL-1基因表達量，但隨著H2O2劑量的增加而增加，這也正好說明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，葡萄糖的轉(zhuǎn)運受阻，炎癥反應(yīng)加強，機體的主要機能由泌乳和乳成分合成向抗炎轉(zhuǎn)變。這一推測在缺氧狀態(tài)下表現(xiàn)的更為明顯。 本試驗結(jié)果中，在缺氧狀態(tài)下，催乳素顯著誘導(dǎo)了葡萄糖轉(zhuǎn)運因子GLUT1 和GLUT8 基因的表達， 低劑量的H2O2顯著增加了GLUTs 基因的表達量， 高劑量GLUTs 表達量與低劑量相比開始顯著降低；H2O2均顯著增加了GLUT8 基因的表達量， 且隨著劑量的增加而增加。 H2O2顯著增加了IL-1β 基因表達量，且均隨著H2O2劑量的增加而增加（P<0.05）。 這說明缺氧加劇了機體對抗炎癥時對能量的消耗，但隨著氧化應(yīng)激的持續(xù)加劇，機體功能開始紊亂，炎癥反應(yīng)持續(xù)增強，組織開始損傷。 本試驗中GLUT1 和GLUT8 的比例關(guān)系的改變和對于炎癥因子基因表達的持續(xù)增加就說明了這一點。

IL-1β 又稱淋巴細胞活化因子， 也是由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生， 在組織炎癥狀態(tài)下發(fā)揮著重要功能。 Dinkova 等（2010）研究結(jié)果表明，不同濃度LPS 刺激奶牛乳腺上皮細胞24 h 后，細胞中IL-1β、IL-6 和IL-8 的mRNA 相對表達水平隨著LPS 刺激濃度的增加而增加，說明IL-1β、IL-6 在炎癥反應(yīng)中會被激活以起到抗炎作用， 這也進一步驗證了本試驗結(jié)果及其相關(guān)推測。

4 結(jié)論

催乳素有利于改善氧化應(yīng)激對乳腺乳蛋白基因表達的影響， 其作用是通過增加抗氧化基因的表達、 激活炎癥因子的表達和維持葡萄糖轉(zhuǎn)運因子的正常運轉(zhuǎn)而實現(xiàn)的。