苦樹側(cè)枝不同極性部位的抗氧化活性及對肺癌細胞A549 的生長抑制作用

李金花， 曾國芳， 臧青民， 張慧曄， 李海東 ， 陳 榮，

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春130118；2．玉林師范學院， 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術(shù)重點實驗室，廣西玉林537000；3．廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州510515）

苦樹為苦木科苦樹屬植物 （Picrasma quassioides）落葉喬木樹種，自然分布于印度、不丹等國及我國黃河流域以南各省區(qū)（中國科學院中國植物志編輯委員會，1997）。 中國藥典收載的“苦木”藥材，其來源為苦樹的枝、葉，有清熱解毒、健胃殺蟲等作用， 以苦樹為原料的諸多制劑對各種感染和膿腫療效顯著（鄧延秋等，2020；朱兆儀等，1983）。在獸醫(yī)臨床上，有將苦樹自制成粉末劑、湯劑、片劑、注射劑使用的報道，對豬和牛的潰瘍清創(chuàng)、傷風感冒、豬胃腸炎、仔豬白痢、中暑等有較好的治療效果，尤其對采用抗生素治療效果不佳，反復(fù)發(fā)作的無名高熱癥，治療效果更好，這部分臨床報道以煎煮后使用為主， 采用的入藥部位分別有莖、根和葉（覃玉忠等，2013；王啟明，1995；劉富國，1986）；在飼料添加劑方面，苦木提取物能夠有效改善仔豬的消化性能， 提高免疫抗病能力及一定程度上能防止肉牛瘤胃酸中毒的產(chǎn)生（李國柱等，2014；魏吉安，2006）。

機體的新陳代謝過程以及炎癥或外界刺激等都會導致自由基產(chǎn)生， 機體中過多的氧自由基會破壞細胞結(jié)構(gòu)， 導致代謝異常、 引發(fā)疾病和衰老（張華，2013）；甚至會引起突變、誘發(fā)癌癥（左麗麗，2013）。 抗氧化劑可分為合成抗氧化劑和天然抗氧化劑兩種， 合成抗氧化劑在食品和飼料工業(yè)中被廣泛使用，但具有潛在的毒性和致癌作用，長期使用會對生命安全造成威脅， 而天然抗氧化劑更為安全， 因此篩選新的抗氧化劑和抗腫瘤的天然藥物成為研究重點（呂鳳，2021）。已報道的苦樹化學成分主要有生物堿類、 苦味素類及黃酮類等（鄧延秋等，2020）。 藥理學研究表明，苦樹具有抑菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用（趙文娜等，2019；Zhao 等，2013； 劉巖等，2010； 劉軍鋒等，2009）；但目前鮮見苦樹側(cè)枝乙醇提取物不同極性部位體外抗氧化活性研究及苦樹提取物對人肺癌細胞（A549）的藥效學研究報道。 考慮到不同極性溶劑對提取物中化學成分的影響， 以及由此帶來的藥效學差異，本試驗采用苦樹側(cè)枝為原藥材，對其乙醇提取物采用不同溶劑萃取， 探討不同極性部位提取物的抗氧化和抗腫瘤活性差異， 從而進一步明確苦樹側(cè)枝乙醇提取物不同極性部位的合理使用，且為開發(fā)利用這一天然抗氧化劑，及其在獸藥及飼料添加劑中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 苦樹側(cè)枝于2020 年7 月采于廣西河池市， 經(jīng)廣西藥用植物園高級工程師鑒定為苦木科苦樹屬植物苦樹。 人肺癌細胞（A549）由玉林師范學院嶺南中草藥質(zhì)量控制中心保存。2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼均為分析純，購自上海藍季生物；四甲基偶氮唑蘭（MTT）、細胞培養(yǎng)液、 胰酶， 由上海生工生物工程股份有限公司提供；其他化學試劑均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 主要儀器 101-1B 電熱恒溫鼓風干燥箱（紹興市易誠儀器制造有限公司）；UV-5100B 紫外分光光度儀 （上海精密科學儀器有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇區(qū)西城新瑞儀器廠）；TDL-80-2B 低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；SHB-Ш 循環(huán)水多用真空泵 （鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；RZ01C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；ATY224 型萬分之一天平（日本島津制作所）；pH-25 型pH 計（上海越平）；DMIL LED 倒置顯微鏡（萊卡）；LUX 酶標儀（賽默飛）；COP-T 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海篤特科學儀器有限公司）；SW-CJ-VS2 雙人單面超凈工作臺（無錫易純凈化設(shè)備有限公司）。

2 試驗方法

2.1 苦樹側(cè)枝乙醇粗提物的制備 苦樹側(cè)枝干燥粉碎過40 目篩后，取100 g，按料液比1∶10（g/mL）進行回流提取， 首先加入80%的乙醇500 mL，回流提取1.5 h，過濾，濾渣再加入80%的乙醇250 mL提取1 h， 過濾， 濾渣再加入80%的乙醇250 mL提取0.5 h，合并三次濾液，減壓濃縮成浸膏，加入200 mL 純水溶解浸膏， 依次用等體積的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，剩余部分為水部位， 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收各部位萃取溶劑后進行冷凍干燥處理，得到水（4.1066 g）、正丁醇（0.9362 g）、乙酸乙酯（1.0460 g）、二氯甲烷（0.6096 g）4 個萃取部位干燥品。

2.2 ABTS 法測定ABTS 自由基清除能力 參考黃小鳳等（2021）報道方法，并根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果調(diào)整后實施。具體為取苦樹不同極性部位干燥品，用50%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的供試品溶液， 備用；50%乙醇溶液配 制0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL的VC溶液，備用。 將7.4 mmol/L 的ABTS 溶液和

2.6 mmol/L 的過硫酸鉀溶液等體積混合， 室溫避光放置12 h 后即得ABTS 母液，母液用純化水稀釋45 倍作為ABTS 工作液；精密量取ABTS 工作液2 mL 及各供試品溶液1 mL， 充分搖勻室溫避光反應(yīng)30 min 后，測定734 nm 處的吸光度。供試品溶液吸光度為Ai，純化水空白對照組吸光度為A0。 根據(jù)公式計算出供試品溶液對ABTS 自由基的清除率，并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到IC50值。

2.3 DPPH 法測定DPPH 自由基清除能力 參考黃小鳳等（2021）和郭溆等（2018）并在預(yù)試驗后對報道方法進行調(diào)整。 具體為分別取不同極性部位干燥品適量，以50%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的供試品溶液，備 用； 同 樣 方 法 配 制0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL 的VC溶液備用。取上述各供試品溶液2 mL 分別加于10 mL 試管， 再各加入2 mL 濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液， 搖勻后室溫避光反應(yīng)30 min，測定517 nm 處的吸光度。 測得供試品溶液吸光度Ai，純化水空白對照組吸光度A0，無水乙醇代替DPPH 乙醇溶液的本底組吸光度Aj。根據(jù)公式計算出不同供試品溶液對DPPH 自由基的清除率，并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到IC50值。

2.4 普魯士藍法測定鐵還原能力 具體方法參考黃小鳳等（2021） 報道并根據(jù)預(yù)試驗調(diào)整后實施，取苦樹側(cè)枝不同極性部位干燥品以50%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的供試品溶液備用； 用50%乙醇溶液配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的VC做陽性對照。 供試品溶液分別各取2.5 mL 加入10 mL 試管中，再依次加入濃度為0.2 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）以及1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，充分搖勻，水浴鍋中50 ℃反應(yīng)20 min 后取出，迅速冷卻后再分別加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 并充分搖勻，3000 r/min 離心10 min 后分別吸取上清液2.5 mL 加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL 及純化水1 mL，充分搖勻后室溫靜置10 min，測定700 nm波長處吸光度。 供試品溶液吸光度記為Ai，純化水空白對照組吸光度為A0。 根據(jù)公式計算不同濃度樣品溶液的鐵還原能力并通過SPSS 統(tǒng)計分析得到半數(shù)還原能力（IC50）。

2.5 抗人肺癌腫瘤細胞活性試驗 抗腫瘤活性測定參考李慧等（2019）報道方法。 細胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基。 首先進行細胞復(fù)蘇，取出含人肺癌細胞（A549）的凍存管于37 ℃水浴鍋中快速解凍， 加37 ℃預(yù)熱的細胞培養(yǎng)液后混勻，1000 r/min 離心5 min 后棄去最上層液體， 迅速加入2 mL 細胞培養(yǎng)液，用移液槍頭輕輕地吹打細胞至完全分散后將其轉(zhuǎn)移至無菌細胞培養(yǎng)皿 （90 mm）中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長的細胞進行后續(xù)腫瘤抑制試驗。

檢測腫瘤細胞抑制率試驗時， 取苦樹側(cè)枝不同極性部位干燥品適量，以DMSO 配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的藥物溶液備用，將人肺癌細胞（A549） 以4 × 103/mL 接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μL， 在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 ～12 h。待細胞貼壁且密度約大于80%后，按50、100、200 μg/mL 的濃度加藥，同時設(shè)置調(diào)零孔組（培養(yǎng)液）和空白對照組（培養(yǎng)液+細胞），每組設(shè)置6 個重復(fù)。加藥培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液（1 mg/mL）50 μL， 繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h， 吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后，使用酶標儀于490 nm 下測定各孔的光密度值。 根據(jù)公式計算不同濃度樣品溶液的細胞活力， 并通過SPSS 統(tǒng)計分析。

抑制率/%=（藥物組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）×100。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦樹不同極性部位提取物對ABTS 自由基的清除能力 苦樹側(cè)枝各極性部位對ABTS 自由基清除結(jié)果如表1 和圖1 所示。 乙酸乙酯部位藥物濃度為0.08 mg/mL 時， 清除率為91.472%，該極性部位藥物濃度提高到0.1 mg/mL 時， 清除率為96.981%， 此兩種濃度下對ABTS 自由基清除率分別達到最高濃度Vc 清除率的92.6%和97.5% 以上， 說明苦樹側(cè)枝乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位對ABTS 自由基的清除率與Vc 相當，清除能力強；水層部位藥物濃度為0.1 mg/mL 時，清除率為88.604%， 此濃度下對ABTS 自由基清除率達到Vc 的89.2% 以上， 說明水部位的清除能力也較強。 從IC50數(shù)值來看，二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、 正丁醇部位、 水部位的IC50分別為0.061、0.026、0.072、0.057 mg/mL，各部位對ABTS自由基的清除能力順序為乙酸乙酯部位＞水部位＞二氯甲烷部位＞正丁醇部位，4 個部位間IC50差異顯著。

圖1 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物對ABTS 自由基的清除能力

表1 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物對ABTS 自由基的清除能力

3.2 苦樹側(cè)枝不同極性部位提取物對DPPH 自由基的清除能力 苦樹側(cè)枝不同極性部位提取物及Vc 分別對DPPH 自由基的清除作用及線性回歸求得各萃取物的IC50值如表2 和圖2 所示，不同極性部位不同藥物濃度間清除能力不同， 藥效隨藥物濃度的升高而增強。相同濃度時，清除能力大小順序為Vc＞乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞正丁醇部位＞水部位； 藥物濃度為0.1 mg/mL 時，乙酸乙酯部位、二氯甲烷部位、正丁醇部位和水部位的清除率分別為75.797%、40.748%、38.603%和28.860%， 此濃度下各部位對DPPH 自由基清除率分別達到Vc 的83.3%、44.8%、42.4%和31.7%；可見乙酸乙酯部位的藥效高于其他極性部位，其IC50為0.057 mg/mL，二氯甲烷部位和正丁醇部位IC50值分別為0.119、0.133 mg/mL， 水部位的藥效最弱，4 個部位間IC50差異顯著。

圖2 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物對DPPH 自由基的清除能力

表2 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物對DPPH 自由基的清除能力

3.3 苦樹側(cè)枝不同極性部位提取物對鐵的還原能力 通過普魯士藍法檢測鐵還原能力， 結(jié)果如表3 和圖3 所示， 苦樹側(cè)枝不同極性部位均表現(xiàn)出一定的鐵還原能力，且具有明顯的量效關(guān)系。乙酸乙酯部位的鐵還原能力最強， 當藥物濃度為3.0、4.0、5.0 mg/mL 時，乙酸乙酯部位的鐵還原力逐漸升高，分別為1.468、1.885 和2.099，此時對鐵的還原力分別達到Vc 最高濃度0.5 mg/mL 時鐵還原力的64.9%、91.7%、92.8%， 說明苦樹側(cè)枝乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位較高濃度給藥時，對鐵還原能力與Vc 相當，鐵還原能力強；當藥物濃度為5.0 mg/mL 時，二氯甲烷部位、正丁醇部位和水部位的鐵還原力分別為0.974、0.665 和0.606， 此濃度下各部位的鐵還原能力分別達到Vc 最高濃度時鐵還原力的43.1%、29.4%和26.8%。 各極性部位藥效大小順序為乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞水部位＞正丁醇部位， 對應(yīng)的A0.5值依次為1.115、2.345、3.893、4.086 mg/mL，各極性部位A0.5數(shù)值間差異顯著。

圖3 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物的鐵還原能力

表3 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物的鐵還原能力

3.4 苦樹側(cè)枝各極性部位提取物抗腫瘤活性試驗 本試驗采用MTT 法來測定苦樹側(cè)枝乙醇提取物不同極性部位的抗腫瘤活性， 結(jié)果如圖4 所示， 不同極性部位對人肺癌細胞A549 的增殖均存在一定的抑制作用， 就同一極性部位不同藥物濃度來看，隨藥物濃度的增加抑制效果增強。從不同極性部位來看，正丁醇部位的抑制效果最強，在200 μg/mL 濃度時抑制率達到69.764%， 此濃度下抑制率與濃度為100 μg/mL 的抑制率差異顯著， 且較其他不同部位該濃度處理均存在顯著差異， 此極性部位的IC50為100.642 μg/mL；4 個極性部位中， 二氯甲烷部位的抗腫瘤活性排在第2位，IC50為178.089 μg/mL。 乙酸乙酯部位200 μg/ml 濃度的抗腫瘤活性顯著高于100、50 μg/mL 濃度， 后兩個濃度間差異不顯著； 除乙酸乙酯部位外，其余3 個不同極性溶劑部位，均隨著藥物濃度的增加對應(yīng)的抗腫瘤活性隨之增加， 且3 個不同濃度的抗腫瘤活性均存在顯著差異。

圖4 苦樹側(cè)枝不同極性部位抗腫瘤活性

4 討論與結(jié)論

抗氧化劑可通過清除自由基及提高抗氧化酶活性等途徑發(fā)揮抗氧化作用， 從而產(chǎn)生疾病預(yù)防和治療作用，對健康尤為重要（劉賀等，2021）。 本研究通過ABTS 法、DPPH 法和普魯士藍法對苦樹側(cè)枝乙醇提取物4 個不同極性部位萃取物的抗氧化活性進行了測定分析，結(jié)果顯示，苦樹側(cè)枝各極性部位抗氧化能力存在差異； 研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位的DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力，以及鐵的還原能力均強于其他部位；當質(zhì)量濃度達到0.1 mg/mL 時， 對ABTS 自由基的清除率可達96.981%， 其次為二氯甲烷和正丁醇部位，二者的抗氧化能力差異不顯著；水部位的抗氧化能力最弱； 說明苦樹側(cè)枝乙酸乙酯萃取部位的抗氧化成分或含量較其他萃取部位要高。 韻小娟等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，厚皮樹的樹皮不同極性部位以乙酸乙酯提取部位的抗氧化活性效果最強；夜香牛全草不同極性部位的抗氧化研究結(jié)果也與本文一致（韋志英等，2020）；而在黃秋葵花不同極性部位的抗氧化報道中， 以水相提取部位的效果最佳（郭溆等，2018）；金英善等（2008）研究表明，苦樹不同溶劑的提取物均具一定的抗氧化活性，其中水提取物對超氧化陰離子的清除能力高于乙醇提取物和70%甲醇提取物。 可見，不同植物物種，其最優(yōu)的抗氧化效果，隨提取溶劑的極性變化而表現(xiàn)不同。 研究表明，苦樹乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位化學成分以生物堿為主； 生物堿類成分也有抗氧化作用（張秋裕等，2020；邱丹纓等，2015； 趙文娜等，2013）， 苦樹側(cè)枝提取物中起抗氧化作用的化合物可能以生物堿類成分為主， 具體藥效成分有待進一步研究。 Yin 等（2009） 對苦樹莖甲醇提取物的不同極性部位（水、正己烷、乙酸乙酯和正丁醇）的抗氧化活性進行了研究， 發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物對羥自由基的清除能力最高，達到53.49%，低于試驗中陽性對照的清除率96.15%； 該報道的清除率數(shù)值與本研究有一定差距，可能與原料藥材部位，或者使用的提取溶劑不同有關(guān)。

苦樹具有抑制腫瘤細胞活性，Kwon 等（2018）用MTT 法，發(fā)現(xiàn)從苦樹莖中分離純化得到的3 個生物堿對人卵巢癌細胞（A2780、SKOV3）具顯著抑制活性；Zhao 等（2019）發(fā)現(xiàn)從苦樹莖中分離鑒定的三萜化合物對人肝癌細胞（HepG2、Hep3B）具良好抑制效果；Xu 等（2016）發(fā)現(xiàn)苦樹莖中三萜化合物對人胃癌高轉(zhuǎn)移細胞（MKN-28）具有良好的抑制活性，與陽性對照順鉑活性相當。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快， 對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一， 其中又以非小細胞肺癌（A549）最為多見（呂汪霞等，2005）。 本試驗以人肺癌細胞（A549）為試驗材料，用苦樹側(cè)枝乙醇提取物不同極性部位提取物進行多濃度梯度處理，結(jié)果表明， 苦樹側(cè)枝提取物對A549 細胞的增殖有顯著抑制作用， 且隨濃度的升高抑制效果不斷增強， 不同極性部位的抑制率大小順序為正丁醇＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞水部位， 正丁醇部位對A549 的 抑 制 率 為69.764%，IC50為100.642 μg/mL； 在三脈菝葜的正丁醇部位對A549 的抑制效果報道中， 其IC50值為548.789 μg/mL （魯遇，2019）；Yin 等（2009）對苦樹莖甲醇提取物的不同極性部位（水、正己烷、乙酸乙酯和正丁醇）的抗腫瘤活性進行研究， 發(fā)現(xiàn)正丁醇部位對人胃癌細胞（NCI-N87）具有明顯的抑制作用而對人腎上皮細胞無毒性作用；李慧等（2019）研究中藥茜草的抗腫瘤活性報道中提及， 茜草根對肝癌細胞（HepG2）的抑制效果最好，抑制率為52.23%，高于順鉑陽性對照的43.11%。 可見，本研究結(jié)果與Yin 等（2009）的研究結(jié)論具有相似性，從與有關(guān)報道的數(shù)據(jù)比對來看， 苦樹正丁醇部位對人非小細胞肺癌具有較高的抑制活性， 值得進一步深入研究。

綜上，苦樹側(cè)枝乙醇提取物不同極性部位的抗氧化及抗腫瘤活性存在差異，本研究明確了乙酸乙酯部位的抗氧化活性最強，試驗中乙酸乙酯部位高濃度處理對ABTS 自由基清除能力以及鐵還原能力與VC相當； 此外發(fā)現(xiàn)正丁醇部位的抗人肺癌細胞（A549）活性最強，藥效較好。 本研究結(jié)果可為苦樹資源的合理開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。