馬鈴薯StCDPK8 基因功能預(yù)測與分析

張 瑩 ，楊志堅 ，王一好 ，張文鵬 ，白江平 ，畢真真 *

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

近年來，非生物脅迫是制約馬鈴薯生產(chǎn)的因子之一，其中干旱脅迫造成的馬鈴薯產(chǎn)量損失位居第一[1]。干旱脅迫通常發(fā)生在土壤水分不充足，難以維持植物正常生活和蒸發(fā)過度充足的地區(qū)[2]。水分缺乏是限制植物伸長和擴(kuò)張生長的限制因素，也是影響植物生長發(fā)育的主要因素[3-4]，并且加速土壤營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的失衡，從根本上導(dǎo)致了作物生育周期中每一個環(huán)節(jié)受到影響[5]。

馬鈴薯是第四大糧食作物，也是一種典型的對水敏感的溫帶性作物，干旱生理脅迫嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯的生長發(fā)育[6]。馬鈴薯生長在低溫冷涼的環(huán)境下，對缺水比較敏感，缺乏有效的耐旱性機(jī)制[7]。由于全球氣候的變化，馬鈴薯培育基地旱情日益嚴(yán)重，水分短缺極度限制馬鈴薯生長，造成減產(chǎn)。干旱加劇使葉片出現(xiàn)發(fā)黃、逐漸萎蔫、脫落等現(xiàn)象，對馬鈴薯植株造成不可逆?zhèn)?，進(jìn)而影響馬鈴薯品種和產(chǎn)量，研究馬鈴薯抗旱基因的抗旱機(jī)理對選育馬鈴薯耐旱品種的選育和擴(kuò)大推廣具有指導(dǎo)意義。

CDPKs 最初在豌豆中被發(fā)現(xiàn)[8]，是一類存在于某些植物中專有的與逆境信號傳遞關(guān)系最密切的蛋白激酶[9]，在調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫的耐受性以及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[10]。崔喜艷等[11]和牛娟等[12]的研究證實了在干旱脅迫條件下CDPK 基因在擬南芥、羊草和大豆中的表達(dá)各有所不同，在植物遭受干旱脅迫反應(yīng)時起到使CDPK 基因的表達(dá)增強(qiáng)的重要的作用[13]。馬鈴薯StCDPKs 基因家族基因結(jié)構(gòu)是相似的，EF-hand 在區(qū)域內(nèi)高度保守[14]。StCDPKs在不同組織中遭受逆境脅迫有不同的表達(dá)模式。模式植物擬南芥AtCDPK1 基因在抗非生物脅迫反應(yīng)過程中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用并可以誘導(dǎo)表達(dá)，通過NCBI 網(wǎng)站BLAST 比對找到AtCDPK1 基因在馬鈴薯中的同源基因是StCDPK8。本試驗通過生物信息學(xué)分析推測馬鈴薯StCDPK8 基因的功能，同時分析抗旱性不同的2 種馬鈴薯品種中StCDPK8 基因的瞬時表達(dá)量，以期為馬鈴薯抗逆種質(zhì)資源基于植物基因工程上的改良提供實驗依據(jù)，同時為馬鈴薯CDPK 蛋白生物學(xué)功能和抗旱育種的全面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯干旱敏感型品種大西洋（Atl）和耐旱型品種青薯9 號（QS9）2 種試驗材料均由甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室以及甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供。

MS 液體培養(yǎng)基，200 mm 甘露醇，植物總RNA 提取試劑盒，1%的瓊脂糖凝膠電泳，成像分析系統(tǒng)，TOYOBO 牌反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR 儀，熒光定量儀，超微核酸蛋白分析儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過在線網(wǎng)站對StCDPK8基因進(jìn)行信息學(xué)在線分析解析StCDPK8 基因功能（表 1）。

表1 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及功能

1.2.2 干旱脅迫瞬時處理 在配制好的MS 液體培養(yǎng)基中將種抗旱性不同的馬鈴薯試管苗進(jìn)行干旱短期處理：干旱敏感型品種大西洋（Atl）和耐旱型品種青薯9 號（QS9）培養(yǎng)25 d，然后將馬鈴薯試管苗放置在濃度為200 mM PEG 的MS 液體培養(yǎng)基中做瞬時處理，分別于 0 h（CK）、1 h、3 h、6 h、12 h 進(jìn)行取樣。

1.2.3 RNA 提取與檢測 提取干旱脅迫瞬時處理后的馬鈴薯樣品的RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量[15]、純度[16]。

1.2.4 qPCR 檢測 使用TOYOBO 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成 cDNA，根據(jù) SYBR qPCR MIX（Takala）操作規(guī)程說明書建立20 μl 的熒光定量PCR 反應(yīng)體系，在實時定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。最后應(yīng)用2-ΔΔCT相對定量法[17]計算StCDPK8 基因的相對表達(dá)量。

所用基因引物序列：

StCDPK8-F:5’-GCTAATGGGTATAGGGCAGGAA-3’

StCDPK8-R:5’-ACAGTAACAGGAACAGGGTGGG-3’

內(nèi)參基因引物序列：

actin-F:5’-AGGAGCATCCTGTCCTCCTAA-3’

actin-R:5’-CACCATCACCAGAGTCCAACA-3’

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子順式調(diào)控元件

利用Lantcare 分析StCDPK8 基因上游1 500 bp中含有的相關(guān)順式作用元件（表2），結(jié)果表明：StCDPK8 基因啟動子區(qū)含有啟動子核心元件、瞬時順式作用調(diào)控元件、啟動子，增強(qiáng)子常見順式作用元件和脫落酸反應(yīng)元件等其他與脅迫調(diào)控有關(guān)的順式作用調(diào)控元件。因此，StCDPK8 可能在馬鈴薯植株遭受干旱等逆境脅迫時發(fā)揮調(diào)控作用。

表2 StCDPK8 基因啟動子順式調(diào)控元件分析

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

通過InterPro 對馬鈴薯StCDPK8 的蛋白序列進(jìn)行分析。由表3 可知，馬鈴薯StCDPK8 蛋白序列包含2 個結(jié)構(gòu)域、1 個活性位點、2 個超同源家族以及3 個結(jié)合位點。

表3 StCDPK8 蛋白序列分析

2.3 蛋白理化特性分析

ExPASy 網(wǎng)站分析結(jié)果表明（表 4）：StCDPK8 基因編碼581 個氨基酸，且氨基酸組分中數(shù)目最多，含量最高的是甘氨酸（Gly），含量達(dá)8.4%；色氨酸（Trp）含量最低，達(dá)0.9%。該蛋白的理論等電點（pl）為5.54，相對分子量為64.5 kD。同時，氨基酸親水性分析顯示，StCDPK8 蛋白序列的N 末端是甲硫氨酸（Met），其不穩(wěn)定系數(shù)（II）是 36.41，為穩(wěn)定性蛋白；理論半衰期30 h；脂肪酸指數(shù)為77.33；蛋白質(zhì)的親水性平均值GRAVY 為-0.420，為親水性蛋白質(zhì)：StCDPK8 氨基酸親疏水性分析結(jié)果圖中峰值“＞0”部分是疏水區(qū)域，“＜0”部分則為親水區(qū)域，該序列在 305 至 315 處存在最高峰（圖 1），StCDPK8 氨基酸疏水性達(dá)到最大。

圖1 StCDPK8 氨基酸親疏水性分析

表4 StCDPK8 蛋白氨基酸序列分析

2.4 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)Plantcare 分析結(jié)果預(yù)測到：α 螺旋和無規(guī)則卷曲是StCDPK8 蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要成分，還包括β 折疊和延伸鏈以及其他已知的結(jié)構(gòu)域（圖2、圖3）。通過SOPMA-蛋白質(zhì)二級預(yù)測結(jié)果顯示，α螺旋占比42.51%，無規(guī)則卷曲占比39.24%，β 折疊占比8.61%，延伸鏈占比9.64%。通過分析馬鈴薯StCDPK8 蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖 4），結(jié)果表明：α- 螺旋和無規(guī)則卷曲是該三級結(jié)構(gòu)的主要組成部分。因此，馬鈴薯StCDPK8 蛋白的大部分氨基酸序列都為螺旋形狀。同時，基于同源建模三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：StCDPK8 蛋白可能含有較大的疏水結(jié)構(gòu)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測形式吻合。

圖2 StCDPK8 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

圖3 StCDPK8 蛋白的二級結(jié)構(gòu)峰圖

圖4 StCDPK8 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型

2.5 StCDPK8 基因表達(dá)量分析

對甘露醇模擬干旱脅迫處理后的幼苗進(jìn)行qPCR 分析，由圖5 可看出：干旱處理后，2 個馬鈴薯品種中StCDPK8 表達(dá)量均迅速升高，并在1 h 時達(dá)到最高；且耐旱型品種QS9 的表達(dá)量整體高于干旱敏感型品種Atl。干旱處理使StCDPK8 基因的表達(dá)量在抗旱性不同的馬鈴薯中表現(xiàn)出品種特異性，根據(jù)該基因表達(dá)量的品種差異性推測馬鈴薯StCDPK8基因與馬鈴薯干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)。

圖5 干旱脅迫處理下2 種馬鈴薯中StCDPK8基因表達(dá)量變化

3 討論

植物中的CDPKs（鈣依賴蛋白激酶）作為一個正向調(diào)節(jié)因子調(diào)控干旱等逆境反應(yīng)，能快速適應(yīng)非生物脅迫，與植物的脅迫響應(yīng)有著密切關(guān)系。CDPKs 是一類參與植物天然免疫反應(yīng)的鈣離子感受器，它還是一種通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因表達(dá)情況的抗性基因[18]。已有研究證實[19]，在干旱等非生物逆境脅迫下擬南芥AtCDPK1（AT5G04870）基因被誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而激活其過量表達(dá)以顯著提高植物對非生物脅迫的耐受能力。馬鈴薯抗旱性是一種需要從與抗旱脅迫響應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行發(fā)掘的研究，它作為一種由復(fù)合的多基因控制的數(shù)量遺傳特征為馬鈴薯抗旱品種在干旱脅迫下的培育提供一定實驗基礎(chǔ)，減少干旱造成的損失。

本試驗通過NCBI BLAST 比對找到馬鈴薯中的擬南芥AtCDPK1 同源基因StCDPK8，初步推測StCDPK8 基因與AtCDPK1 基因功能在受干旱、高鹽等逆境脅迫誘導(dǎo)時表達(dá)相似，并且在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中與馬鈴薯的生長發(fā)育響應(yīng)。目前對馬鈴薯干旱相關(guān)鈣依賴蛋白激酶的研究較少，本試驗通過生物信息學(xué)手段和基因表達(dá)分析對StCDPK8 進(jìn)行初步功能預(yù)測，以期為馬鈴薯干旱相關(guān)CDPKs 進(jìn)行進(jìn)一步功能解析提供參考。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，StCDPK8 蛋白作為穩(wěn)定性蛋白，其啟動子上游序列主要參與植物逆境反應(yīng)，包括與免疫應(yīng)答和激素信號傳導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的順式作用元件，表明StCDPK8 可能參與植物逆境應(yīng)激反應(yīng)[9]。模擬干旱脅迫下抗旱性不同的馬鈴薯品種中StCDPK8 基因的表達(dá)水平有顯著差異，推測StCDPK8 基因可能在馬鈴薯干旱響應(yīng)過程發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步解析馬鈴薯StCDPK8 基因響應(yīng)干旱脅迫的信號通路和調(diào)控機(jī)理提供了理論依據(jù)，為馬鈴薯CDPKs蛋白生物學(xué)功能的深入研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)對馬鈴薯StCDPK8 基因的生物信息學(xué)在線分析結(jié)果顯示，StCDPK8 基因啟動子上游序列中含有與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等相關(guān)的順式作用元件，表明馬鈴薯StCDPK8 基因可能參與植物脅迫逆境響應(yīng)。干旱脅迫瞬時處理后，抗旱性不同馬鈴薯品種中StCDPK8 基因表達(dá)量差異顯著，推測該基因與馬鈴薯干旱逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果可為基于植物基因工程上的改良提供實驗依據(jù)，同時為馬鈴薯CDPKs 蛋白生物學(xué)功能和抗旱育種的全面研究提供參考。