日本對蝦miR-34靶基因預(yù)測及其生物信息學(xué)分析

李 粉,劉新鶴,高銘悅,徐 晨,徐俊穎,史瑩華,崔亞壘

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,河南 鄭州 450046)

MicroRNA是一類～22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA,可以調(diào)控蛋白編碼基因-massenger RNA(mRNA)的表達(dá)[1]. miRNA的轉(zhuǎn)錄一般由RNA聚合酶II(RNA Pol II)來執(zhí)行,并受到RNA Pol II相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳的調(diào)控[2-3]. 初級miRNA(pirmary microRNA)在RNA Pol II的作用下被轉(zhuǎn)錄下來后,經(jīng)過一系列的加工過程形成成熟的miRNA. 產(chǎn)生的具有雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA(miRNA:miRNA*)組裝到Argonaute(Ago)蛋白上形成沉默復(fù)合體前體,并瞬時發(fā)生解鏈,miRNA*鏈被解離下來,形成成熟的沉默復(fù)合體,發(fā)揮基因沉默的效應(yīng)[4-5].

MiRNA在水生動物中的相關(guān)研究越來越多,鯉魚脾臟中保守miRNA的靶基因預(yù)測結(jié)果顯示,這些miRNA與免疫系統(tǒng)發(fā)育、先天性和獲得性免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子生成等諸多免疫過程相關(guān)[6]. Dang等[7]發(fā)現(xiàn)miR-155在魚類細(xì)胞系中能很好地協(xié)助細(xì)胞抑制真鯛虹彩病毒的復(fù)制,且通過抗病毒因子IFN及相關(guān)通路來誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng). 此外,研究表明,miRNA主要通過miRNA的種子序列(一般從5′端開始第2到第7個堿基)與mRNA的3′UTR(3′非編碼區(qū))區(qū)域有連續(xù)的Watson-Crick堿基配對[8]. 而miRNA的種子序列可以與約1/3的人類基因堿基配對,說明了miRNA調(diào)控范圍的廣泛性[8]. 在乳腺癌中miR-9可以通過調(diào)控6個基因的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞的增值、入侵,并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9];miR-125b至少可以靶向于10條基因,影響人神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[10];miR-34可作為乳腺癌抑制因子調(diào)控多個基因的表達(dá),引起細(xì)胞周期阻滯和削弱細(xì)胞遷移能力[11-13]. 據(jù)之前的報(bào)道,miR-34在腫瘤細(xì)胞中可促使Caspase-3的裂解,誘發(fā)Caspase調(diào)控的凋亡途徑[14],還可通過被p53激活,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與生長,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[15]. 由此可見miR-34可以參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等多個細(xì)胞過程. 此外,一些miRNA在進(jìn)化過程中具有高度保守性. 例如,let-7在脊椎動物、節(jié)肢動物和蛔蟲中的序列都是相同的[16];在病毒與宿主的相互作用中,病毒編碼的miRNA與人的miRNA具有高度同源性[17-18];有的miRNA在不同物種間其種子序列是一致的[19]. 已有研究表明,對蝦Argonaut(Ago)復(fù)合體中宿主及病毒編碼的miRNA、mRNA在病毒感染不同時間段呈現(xiàn)差異表達(dá),且日本對蝦編碼的miRNA在病毒感染前后靶向基因的數(shù)量發(fā)生變化[20]. 也有研究報(bào)道,日本對蝦miR-34(mja-miRNA-34)作用于白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)編碼的基因[21],但mja-miRNA-34對宿主基因的調(diào)控及其參與的信號通路還有待進(jìn)一步研究. 本研究根據(jù)日本對蝦miR-34靶基因的預(yù)測結(jié)果,通過數(shù)據(jù)整合和生物信息學(xué)分析方法的應(yīng)用,挖掘可能的理論結(jié)果,并對結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析和整理. 該結(jié)果可為mja-miR-34靶基因的實(shí)驗(yàn)鑒定及其生物學(xué)功能的研究提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

mja-miRNA-34:根據(jù)日本對蝦Ago復(fù)合體miRNA、mRNA測序數(shù)據(jù)[20],獲得了mja-miR-34.

不同物種的miR-34:搜索miRBase(http://www.mirbase.org/)可獲得不同動物的miR-34的成熟序列.

日本對蝦基因的3′UTR:分析獲得日本對蝦Ago復(fù)合體mRNA數(shù)據(jù)庫,從該數(shù)據(jù)庫中獲得對蝦基因的3′UTR[20]. 根據(jù)對蝦基因的3′UTR進(jìn)行后續(xù)的mja-miR-34的靶基因預(yù)測.

1.2 方法

1.2.1 miR-34的靶基因預(yù)測

采用TargetScan 5.1和miRanda預(yù)測miR-34的靶基因. TargetScan 5.1根據(jù)miR-34 的種子序列,搜索對蝦基因3′UTR上的靶位點(diǎn). miRanda軟件根據(jù)miRNA的全序列搜索可能的靶基因. miRNA與靶基因相互作用的條件為自由能<-20 kcal/mol,分值>50. 兩種預(yù)測軟件獲得的序列的交集,則有可能是miR-34的靶基因.

1.2.2 mja-miR-34的Northern blot分析

按照mirVana miRNA isolation kit說明書(Ambion,USA),提取RNA. 利用NanoDrop ND-1000 spectrophotometer進(jìn)行濃度及質(zhì)量鑒定. 用制備的15%變性聚丙烯酰胺凝膠(含有8M尿素)進(jìn)行RNA電泳分離. 把分離后的RNA轉(zhuǎn)印至Hybond-N+膜上(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,UK),1200 J紫外交聯(lián)30 s. 用Detection Buffer稀釋NBT/BCIP顯色底物,并把配制好的顯色液加入平皿中進(jìn)行顯色. 待目的條帶清楚后,棄去顯色液終止顯色. mja-miR-34地高辛標(biāo)記的探針序列為5′-ACAACCAGCTAACCACACTGCCA-3′;U6地高辛標(biāo)記的探針序列為5′-GGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTT-3′.

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)是用特異性引物序列檢測日本對蝦體內(nèi)miR-34的靶基因(serine/threoninekinase3、translationinitiationfactor、cytidinedeaminase)的表達(dá). 本試驗(yàn)收集未注射WSSV(0 h)和注射WSSV(24 h、36 h、48 h、72 h)日本對蝦的鰓、血淋巴細(xì)胞. 用Spin Column Animal Total RNA Purification Kit(Sangon Biotech,China)提取RNA. 以RNA為模板,通過Rever Tra AceTMqPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Takara,Japan)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA. 以日本對蝦β-actin(β-actin正向引物:5′-CGAGCACGGCATCGTTACTA-3′,β-actin反向引物:5′-TTGTAGAAAGTGTGATGCCAGATCT-3′)作為內(nèi)參基因. miR-34靶基因的引物序列為serine/threoninekinase3正向引物5′-GTAAAGGCTCAAAGGATAAC-3′,serine/threoninekinase3反向引物5′-TGCTGTGTAACAATGGG-3′;translationinitiationfactor正向引物 5′-CTCGGAGAAACTGCTTGA-3′,translationinitiationfactor反向引物5′-GGTAGAGACCCTCCTTGG-3′;cytidinedeaminase正向引物5′-TGCAGAGATGGGAGAGAGGT-3′,cytidinedeaminase反向引物5′-TCAGGTAGTAGTTTGCCGACG-3′. 制備總體積為20 μL,其中包含10 μL的ChamQ Universal EYBR qPCR Master MIX(Vazyme,China),0.5 μL的cDNA模板,10 μmol/L 0.4 μL的正向和反向引物,并用無菌水加至 20 μL. 進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;40次循環(huán):95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s.

1.2.4 mja-miR34在對蝦體內(nèi)的過表達(dá)

在對蝦尾節(jié)第四節(jié)注射WSSV(104個 WSSV粒子)和30 μg miR-34或miR-34-scrambled的模擬物. 注射36 h后,利用實(shí)時熒光定量PCR分析miR-34預(yù)測靶基因的表達(dá)量. miR-34模擬物Sense序列5′-UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU-3′,Antisense序列5′-ACAACCAGCUAACCACACUGCCA-3′;miR-34-scrambled的Sense序列5′-AUUUGACAGAUGCCUAGUACCAG-3′,Antisense序列5′-CUGGUACUAGGCAUCUGUCAAAU-3′.

1.2.5 GO分析和KEGG分析

TargetScan及miRanda軟件預(yù)測得到的靶基因與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,E<1e-5. 獲得匹配度最高的GO的ID,并描述這些基因和基因產(chǎn)物的屬性. 對得到的靶基因進(jìn)行KEGG Pathway分析,利用KAAS預(yù)測得到對應(yīng)的KO號,分析基因與KEGG中酶注釋的關(guān)系文件以及映射到pathway的信息.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 26中的比較平均值,對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANONA檢驗(yàn),用鄧肯法進(jìn)行事后多重比較,用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示結(jié)果. 小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 miR-34的保守性

由表1可知,日本對蝦編碼的miR-34(mja-miR-34)在人、鼠、果蠅等17個物種的成熟序列具有高度相似性,說明mja-miR-34在物種進(jìn)化過程中具有高度保守性.

表1 不同物種的miR-34的成熟序列Table 1 Mature sequences of miR-34 in different species

2.2 mja-miR-34靶基因的預(yù)測

白斑綜合癥病毒感染日本對蝦0 h、24 h、48 h后,收取對蝦血淋巴細(xì)胞,提取對蝦Ago1-RNA 復(fù)合體中的RNA,進(jìn)行RNA高通量測序[20]. 以RNA高通量測序得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為數(shù)據(jù)庫,用TargetScan及miRanda預(yù)測mja-miR-34的靶基因,選取兩種軟件靶基因預(yù)測結(jié)果的交集,共得到242個mja-miR-34的靶基因(表2). Northern blot結(jié)果顯示mja-miR-34在病毒感染不同時間段呈現(xiàn)差異表達(dá)(圖1A);同時,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示mja-miR-34的靶基因在病毒感染不同時間段呈現(xiàn)差異表達(dá)(圖1B-F),說明mja-miR-34及其靶基因可能參與病毒感染進(jìn)程. 隨機(jī)挑選3個miR-34的靶基因進(jìn)行表達(dá)量分析,結(jié)果表明,miR-34靶基因的差異表達(dá)情況與測序結(jié)果一致(圖1G-I).

表2 TargetScan及miRanda軟件預(yù)測的miR-34靶基因Table 2 miR-34 targeted genes predicted by TargetScan and miRanda software

續(xù)表2 Table 2 continued

續(xù)表2 Table 2 continued

A:mja-miR-34的靶基因在病毒感染不同時間段的表達(dá)量. B-F:TargetScan及miRanda軟件預(yù)測的靶基因及其在病毒感染不同時間段的差異表達(dá)情況. G-I:實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-34靶基因在病毒感染不同時間段(0 h、24 h、36 h、48 h)的差異表達(dá)情況. 柱形圖小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2.3 mja-miR-34靶基因的GO分析

對242個靶基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果顯示,在生物學(xué)過程層面上mja-miR-34靶基因顯著富集在細(xì)胞過程、代謝過程、單一有機(jī)體過程、生物調(diào)節(jié)等條目中;在細(xì)胞成分層面上,靶基因顯著富集在細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器、膜等條目中;在分子功能層面上,靶基因顯著富集在粘合物、催化活性、分子傳感活性、信號轉(zhuǎn)換器活性等條目中(圖2). 這些結(jié)果說明了mja-miR-34參與對蝦體內(nèi)多種生物學(xué)過程及細(xì)胞功能.

圖2 mja-miR-34預(yù)測靶基因的GO注釋分析Fig.2 GO annotation analysis of mja-miR-34 predicted target genes

2.4 mja-miR-34靶基因的KEGG分析

在GO注釋分析基礎(chǔ)上,利用現(xiàn)有的生物通路數(shù)據(jù),對基因集合中的242個基因進(jìn)行生物通路富集分析. 結(jié)果顯示,mja-miR-34的靶基因大多參與碳水化合物代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸和分解代謝等細(xì)胞過程,免疫系統(tǒng)、疾病感染及遺傳信息的折疊、篩選、降解等通路中(圖3A). 并且富集程度排名前20的信號通路中顯著富集在嘧啶代謝通路、賴氨酸降解通路、嘌呤代謝通路和果糖/甘露糖代謝等通路中(圖3B). KEGG分析結(jié)果表明,mja-miR-34參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)以及遺傳信息的調(diào)控等.

圖3 mja-miR-34預(yù)測靶基因的通路分析Fig.3 Pathway analysis of predicted target genes of mja-miR-34

2.5 mja-miR-34靶基因的初步分析

為研究mja-miR-34對其預(yù)測靶基因的調(diào)控作用,研究利用mja-miR-34的模擬物在對蝦體內(nèi)過表達(dá)mja-miR-34,并利用實(shí)時熒光定量PCR分析serine/threoninekinase3、translationinitiationfactor基因的表達(dá)量. 結(jié)果表明,mja-miR-34過表達(dá)后serine/threoninekinase3基因的表達(dá)量與WSSV組、WSSV+miR-34-scrambled組無顯著差異,而translationinitiationfactor基因的表達(dá)量顯著降低(圖4),說明serine/threoninekinase3不是mjmiR-34直接作用的靶基因,而mja-miR-34可調(diào)控translationinitiationfactor基因的表達(dá).

A:mja-miR-34對serine/threonine kinase 3基因表達(dá)量的影響. B:mja-miR-34對translation initiation factor基因表達(dá)量的影響. 小寫字母表示差異顯著(P<0.05).圖4 mja-miR-34過表達(dá)后,其預(yù)測靶基因的表達(dá)情況分析Fig.4 Expression analysis of predicted target genes of mja-miR-34 after overexpression of mja-miR-34

3 結(jié)論

miRNA種子區(qū),也就是miRNA 5′端中能與靶基因的3′端UTR區(qū)完全互補(bǔ)的第2～7位堿基序列[8]. miRNA在不同物種間具有高度保守性,例如miR-150[22]、miR-504[23]、miR-652[24]、miR-497[25]等. 不同物種間miR-34的序列顯示,miR-34在不同物種間也具有高度保守性. “種子序列”的高度保守性可能反映了miR-34在物種進(jìn)化過程中一直發(fā)揮著重要作用.

miRNA作為基因表達(dá)的理想工具,可以在不同程度上同時調(diào)控多個靶基因表達(dá). miR-155在腫瘤中通過調(diào)控SK1、CLDN-1、SMAD2等發(fā)揮抑癌作用[26]. 在乳腺癌中miR-132-3p可以通過調(diào)控N-cadherin、Vimentin、Snail和E-cadherin的表達(dá)抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[27]. miR-1290通過調(diào)控SMEK1[28]、NKD1[29]和LHX6[30]等基因?qū)δ[瘤起作用. Huh7.5.1細(xì)胞感染JFH-1病毒24 h后,miR-122的靶基因SREBF1、FASN和ACACA相對表達(dá)量低于未感染JFH-1病毒的Huh7.5.1細(xì)胞,而感染48 h、72 h、96 h后,miR-122靶基因SREBF1、FASN和ACACA的相對表達(dá)量升高并且高于未感染JFH-1病毒的Huh7.5.1細(xì)胞[31]. BHK-21細(xì)胞感染BEFV病毒24 h、48 h后,miR-3470b的表達(dá)量上升,miR-3470b的靶基因MAVS表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[32]. 本研究結(jié)果也表明,mja-miR-34及其靶基因在病毒感染不同時間段呈現(xiàn)差異表達(dá)的趨勢.

目前miR-34靶基因的研究和驗(yàn)證大多集中在高等動物中. 在人類中miR-34的靶基因有OCT4[33]、DLL1[34]、SATB2[35]、IGFBP-3[36]等. 在褐飛虱中miR-34的靶基因有NllnR1和NllnR2[37]. 在家蠶中miR-34的靶基因有BmE74和BmCPG4[38]. 在小鼠中,miR-34a可控制肥胖,主要通過代謝途徑調(diào)控[39]. 關(guān)于小兒淋巴癌病癥研究發(fā)現(xiàn),miR-34a表達(dá)過量可使小兒淋巴癌癥狀緩解,主要與DKK1和WIF-1基因有關(guān)[40]. 本研究結(jié)果表明,mja-miR-34可能靶向作用于對蝦編碼的242個宿主基因. mja-miR-34的靶基因參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)以及遺傳信息的調(diào)控. mja-miR-34與其預(yù)測靶基因的初步分析表明miR-34真正調(diào)控的靶基因還有待進(jìn)一步探索. 本研究為mja-miR-34功能的進(jìn)一步研究與完善提供了理論基礎(chǔ)和研究方向,有助于進(jìn)一步解釋mja-miR-34在宿主病毒互作中的作用,為對蝦養(yǎng)殖業(yè)中WSSV病毒的預(yù)防提供新的靶點(diǎn).