基于IL-17/Notch軸土茯苓總黃酮對(duì)銀屑病小鼠皮膚瘙癢緩解及炎癥反應(yīng)抑制的作用機(jī)制研究*

王秀菊，周麗娟，王康民，于小璇，田中偉

（1.鄭州頤和醫(yī)院皮膚科，鄭州 450047；2.鄭州市中心醫(yī)院皮膚科，鄭州 450000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，新鄉(xiāng) 453100）

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，其主要特征為皮膚出現(xiàn)鱗屑和紅斑，主要病理表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤，角質(zhì)細(xì)胞異常增生以及細(xì)胞因子分泌異常等[1]，皮膚瘙癢是銀屑病患者常見癥狀，多于夜間發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的睡眠質(zhì)量，目前，對(duì)于其發(fā)生機(jī)制尚不明確。土茯苓是一種傳統(tǒng)中藥，記載于《本草綱目》，具有清熱解毒、除濕等作用。研究表明，中藥銀屑病一號(hào)方（其中含土茯苓15 g）治療血熱型銀屑病，可減輕患者炎癥反應(yīng)，且療效顯著，具有較高安全性[2]。土茯苓總黃酮是從土茯苓提取物中分離純化得到的活性成分，具有多種藥理學(xué)活性，研究表明，土茯苓總黃酮能改善單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎功能障礙，減輕腎間質(zhì)纖維化[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路與銀屑病角質(zhì)細(xì)胞過度增生及凋亡、炎性細(xì)胞浸潤密切相關(guān)[4]。研究表明，miR-25b通過抑制Notch信號(hào)通路，可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖能力[5]。黃葵總黃酮通過抑制Notch信號(hào)通路對(duì)IgA腎病具有治療作用[6]?；谝陨涎芯?，本研究建立銀屑病小鼠模型，探討土茯苓總黃酮通過Notch信號(hào)通路對(duì)銀屑病小鼠的炎癥抑制作用及對(duì)皮膚瘙癢癥狀的改善作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠8周齡，20～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0011，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器 土茯苓購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，將土茯苓飲片烘干，磨碎后過篩，60℃下用60%乙醇以1∶20料液比提取3 h，收集提取液，蒸至無乙醇后，加入正丁醇萃取，再次旋蒸至無正丁醇，冷凍干燥后備用。

1.3 模型制備及給藥 將50只小鼠腹腔麻醉，背部2 cm×3 cm長方形區(qū)域脫毛，按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、土茯苓總黃酮低劑量組（簡稱低劑量組）、土茯苓總黃酮高劑量組（簡稱高劑量組）和甲氨蝶呤組，每組10只。除正常組外，其余組小鼠脫毛區(qū)域每天涂抹5%咪喹莫特軟膏62.5 mg，1次/日，連續(xù)7 d，正常組小鼠用等量凡士林涂抹，與此同時(shí)，每日下午17點(diǎn)，低劑量組小鼠以300 mg/kg土茯苓總黃酮灌胃，高劑量組小鼠以500 mg/kg土茯苓總黃酮灌胃，甲氨蝶呤組小鼠以1 mg/kg甲氨蝶呤片水溶液灌胃，每日1次，連續(xù)7 d，正常組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水[7]。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[8]：出現(xiàn)與人類銀屑病相似的特征，肉眼可見暗紅斑塊，基底浸潤，表面有干燥鱗屑，病理切片可見角質(zhì)增厚，主要表現(xiàn)為角化不全，顆粒層變薄，棘層明顯增厚，嗜中性粒細(xì)胞浸潤。

1.4 評(píng)估小鼠皮膚瘙癢情況 分別在第1、3、5和7天，計(jì)數(shù)小鼠在1 h內(nèi)的抓撓次數(shù)評(píng)估皮膚瘙癢程度，每日早上7時(shí)，將小鼠置于一個(gè)透明的觀察籠中，待小鼠安靜后持續(xù)拍攝1 h，計(jì)數(shù)小鼠抓撓次數(shù)，以小鼠后爪離地，對(duì)背部涂抹部位進(jìn)行抓撓，后爪落地或舔、撕咬后爪記為1次抓撓。抓撓其他未涂咪喹莫特軟膏的部位皮膚不計(jì)數(shù)。

1.5 皮損嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分 從小鼠皮損部位的紅斑、表皮脫屑及浸潤情況3個(gè)方面進(jìn)行PASI評(píng)分：皮損部位與正常皮膚齊平，無紅斑、無表皮脫屑，記為0分；皮損部位稍高于正常皮膚，出現(xiàn)淡紅色斑、少許表皮脫屑則為輕度皮損，記為1分；皮損部位中度隆起，可見紅色斑塊、且覆有片狀的表皮脫屑則為中度皮損，記為2分；皮損部位明顯隆起，可見深紅色斑塊，且皮損表面有較厚呈層狀的表皮脫屑則為重度，記為3分；皮損處可見明顯增厚的隆起，極深紅色斑塊、且表面覆蓋有厚實(shí)呈層狀的表皮脫屑則為極重度，記為4分?？偡譃榧t斑+表皮脫屑+斑塊厚度的總和[9]。

1.6 ELISA檢測血清 IFN-γ、IL-23和 TNF-α含量 頸椎脫臼法處死所有小鼠，取皮損處皮膚用于以下實(shí)驗(yàn)，打開胸腔，主動(dòng)脈采血，3 000 r/min，離心半徑為8 cm，離心10 min，取上清液，為待測樣品。取出酶標(biāo)板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入相應(yīng)的孔中，混勻，37℃恒溫箱中孵育2 h，各孔加入300 μL洗滌液，洗5次，甩干、拍板，加入100 μL生物素抗體工作液，37℃孵育2 h，洗板，加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育2 h，洗板 5次，加入顯色劑100 μL，閉關(guān)顯色30 min，加入終止液 100 μL，反應(yīng) 5 min，置于酶標(biāo)儀上，450 nm波長處測定吸光度（A）值。

1.7 HE染色觀察小鼠皮損處皮膚的病理損傷情況 取部分皮損處皮膚，置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、石蠟包埋、切片（片厚 4 μm），烘片，行HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚病理損傷情況。

1.8 熒光定量-PCR（qRT-PCR）法檢測皮損部位皮膚組織中AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量 取部分皮膚組織置于液氮中研磨，加入Trizol試劑提取組織中的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將800 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL cDNA為模板，上下游引物各0.7 μL，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCT方法計(jì)算 AQP3和Cer基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.9 蛋白印跡法檢測皮膚組織中IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量 取100 mg皮損部位的皮膚組織，液氮中研磨后，加入1 mL裂解液，置于冰上靜置30 min，4℃12 000 r/min，離心半徑為10 cm，離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，100℃煮沸。120 V電泳2 h，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST 洗膜，室溫封閉 1 h，GAPDH、IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗（1∶5 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜，ECL法曝光，Image J分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚瘙癢情況評(píng)估 造模后第1天，抓撓次數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后第3、5和7天，抓撓次數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠抓撓次數(shù)增多（P＜0.05）；與模型組比較，低、高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠抓撓次數(shù)減少（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠抓撓次數(shù)減少（P＜0.05）；與高劑量組比較，甲氨蝶呤組小鼠抓撓次數(shù)減少（P＜0.05）。見表2。

“生態(tài)文明，美麗中國”的發(fā)展方向已經(jīng)明確，腐植酸自然“樂在其中”。我們相信，不斷推陳出新的腐植酸產(chǎn)業(yè)思想、創(chuàng)新技術(shù)、創(chuàng)新產(chǎn)品,以及“腐植酸人”孜孜不倦地努力，腐植酸新產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必將越來越旺盛，越來越陽光。

表2 各組小鼠抓撓次數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of scratching times of mice in each group（±s） 次

表2 各組小鼠抓撓次數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of scratching times of mice in each group（±s） 次

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 第1天 第3天 第5天 第7天正常組 10 11.20±3.47 12.52±2.73 11.57±4.02 13.43±5.11模型組 10 12.64±4.05 92.46±5.20* 133.84±7.28* 185.77±9.38*低劑量組 10 11.38±3.22 75.44±3.69*# 106.94±6.03*# 143.46±8.29*#高劑量組 10 13.40±3.17 43.25±4.32*#△ 81.57±5.42*#△ 110.30±8.10*#△甲氨蝶呤組 10 12.06±2.84 29.86±3.23*#△▲ 50.30±4.64*#△▲ 84.27±6.63*#△▲

2.2 各組小鼠皮損PASI評(píng)分比較 各組小鼠PASI評(píng)分組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組 PASI評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、高劑量組和甲氨蝶呤組PASI評(píng)分降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和甲氨蝶呤組 PASI評(píng)分降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，甲氨蝶呤組PASI評(píng)分降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠PASI評(píng)分比較（±s）Tab.3 Comparison of PASI score of mice in each group（±s） 分

表3 各組小鼠PASI評(píng)分比較（±s）Tab.3 Comparison of PASI score of mice in each group（±s） 分

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) PASI評(píng)分正常組 10 0.21±0.08模型組 10 6.89±1.03*#低劑量組 10 5.52±1.02*#高劑量組 10 4.05±1.27*#△甲氨蝶呤組 10 2.58±1.24*#△▲

2.3 各組小鼠炎癥因子檢測結(jié)果比較 各組小鼠IFN-γ、IL-23和TNF-α含量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組 IFN-γ、IL-23和TNF-α含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、高劑量組和甲氨蝶呤組IFN-γ、IL-23和TNF-α含量降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和甲氨蝶呤組IFN-γ、IL-23和 TNF-α含量降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，甲氨蝶呤組 IFN-γ、IL-23和 TNF-α 含量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠IFN-γ、IL-23和TNF-α含量比較（±s）Tab.4 Comparison of the content of IFN-γ，IL-23 and TNF-α of mice in each group（±s）ng/mL

表4 各組小鼠IFN-γ、IL-23和TNF-α含量比較（±s）Tab.4 Comparison of the content of IFN-γ，IL-23 and TNF-α of mice in each group（±s）ng/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) IFN-γ IL-23 TNF-α正常組 10 89.27± 9.54 36.11±5.38 12.27±3.80模型組 10 378.64±15.83* 174.57±8.36* 87.36±5.74*低劑量組 10 315.33±13.62*# 143.02±9.45*# 62.58±6.00*#高劑量組 10 256.70±14.46*#△ 99.47±8.28*#△ 43.42±5.83*#△甲氨蝶呤組 10 138.94±11.22*#△▲ 60.23±7.05*#△▲ 22.47±3.55*#△▲

2.4 各組小鼠HE染色結(jié)果 正常組小鼠表皮層薄，僅有少量炎性細(xì)胞；模型組小鼠表皮增厚，伴有角化過度或角化不全，真皮乳頭出現(xiàn)水腫，伴血管擴(kuò)張，棘層增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；低劑量組小鼠皮膚病理損傷改善狀況不明顯，高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠角化不全細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤減少，病理損傷明顯減輕。見圖1。

圖1 皮損組織HE染色（×400）Fig 1 HE staining of skin esion tissues(×400)

2.5 各組小鼠AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測結(jié)果比較 各組小鼠AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、高劑量組和甲氨蝶呤組AQP3和CermRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和甲氨蝶呤組AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，甲氨蝶呤組AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of AQP3 and Cer mRNA of mice in each group（±s）

表5 各組小鼠AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of AQP3 and Cer mRNA of mice in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) AQP3 Cer正常組 10 0.87±0.12 0.79±0.14模型組 10 0.26±0.09* 0.18±0.08*低劑量組 10 0.45±0.10*# 0.33±0.10*#高劑量組 10 0.57±0.11*#△ 0.50±0.10*#△甲氨蝶呤組 10 0.74±0.10*#△▲ 0.66±0.12*#△▲

2.6 各組小鼠蛋白印跡法檢測結(jié)果比較 各組小鼠IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、高劑量組和甲氨蝶呤組IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組和甲氨蝶呤組IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，甲氨蝶呤組IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表6，圖2。

表6 各組小鼠IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Tab.6 Comparison of the relative expression levels of IL-17，Notch，Jagged1 and Hes-1 protein of mice in each group（±s）

表6 各組小鼠IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Tab.6 Comparison of the relative expression levels of IL-17，Notch，Jagged1 and Hes-1 protein of mice in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與高劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) IL-17 Notch-1 Jagged1 Hes-1正常組 10 0.14±0.04 0.13±0.04 0.11±0.05 0.14±0.05模型組 10 1.03±0.06* 1.01±0.06* 1.01±0.05* 0.98±0.07*低劑量組 10 0.88±0.05*# 0.89±0.06*# 0.74±0.04*# 0.67±0.06*#高劑量組 10 0.60±0.04*#△ 0.57±0.05*#△ 0.53±0.03*#△ 0.41±0.04*#△甲氨蝶呤組 10 0.32±0.04*#△▲ 0.33±0.04*#△▲ 0.22±0.04*#△▲ 0.20±0.04*#△▲

圖2 各組小鼠皮膚組織中蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression level of proteins in skin tissue of mice in each group

3 討論

銀屑病是一種常見病和多發(fā)病，多累及皮膚和關(guān)節(jié)，具有頑固性及復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，因此給臨床治療帶來了巨大困難。中醫(yī)認(rèn)為，銀屑病是以血熱證、血燥癥以及血瘀證為基本證型，“辨血為主，從血論治”是其主要辨證論治規(guī)律。土茯苓是百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，是一種常用中藥，具有清熱除濕解毒等功效。西醫(yī)研究認(rèn)為銀屑病與遺傳、免疫以及感染等因素有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不明確。土茯苓總黃酮具有廣泛的抗炎作用，Zhao等[10]研究表明，土茯苓總黃酮可抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低多種炎癥因子的分泌。Wang等[11]研究表明土茯苓總黃酮通過促進(jìn)尿酸排泄，改善尿酸腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。丁瑞等[12]研究發(fā)現(xiàn)土茯苓通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體水平，同時(shí)抑制炎癥因子產(chǎn)生，從而改善高尿酸血癥小鼠的腎功能。Zhang等[13]研究表明，土茯苓總黃酮通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白及阻滯細(xì)胞周期，從而抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，可能成為治療銀屑病的潛在藥物。甲氨蝶呤是一種免疫抑制劑，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫均有抑制作用，而且具有較強(qiáng)的抗炎作用，但由于其治療劑量接近于中毒劑量，因此用藥安全方面存在一定風(fēng)險(xiǎn)，肝腎功能障礙、妊娠或哺乳期女性、貧血以及免疫缺陷等嚴(yán)重疾病時(shí)，不宜使用。而中藥具有來源廣、毒副作用小以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此中藥的治療作用受到廣泛關(guān)注。本研究通過背部涂抹咪喹莫特軟膏建立銀屑病小鼠模型，探討土茯苓總黃酮對(duì)銀屑病小鼠炎癥反應(yīng)及皮膚瘙癢的改善作用。

皮膚瘙癢是銀屑病患者常見的病癥，雖然其不對(duì)患者生命安全造成威脅，但是會(huì)嚴(yán)重影響患者的精神狀態(tài)和情緒，而且反復(fù)抓撓會(huì)造成更多炎癥介質(zhì)釋放，從而產(chǎn)生更強(qiáng)烈的瘙癢，形成瘙癢-抓撓惡性循環(huán)，給患者的生活帶來不悅[14]。

本實(shí)驗(yàn)中通過評(píng)估銀屑病小鼠1 h內(nèi)的抓撓次數(shù)判斷小鼠的瘙癢程度，結(jié)果顯示：模型組小鼠抓撓次數(shù)明顯多于正常組，低、高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠抓撓次數(shù)明顯少于模型組。AQP3是一種位于細(xì)胞膜上的水通道相關(guān)蛋白，是人皮膚細(xì)胞膜上表達(dá)最多的水通道蛋白，通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分、甘油和尿素等調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞內(nèi)外水平衡，可維持正常皮膚的屏障功能[15]。Cer是皮膚角質(zhì)層細(xì)胞之間存在的混合脂類的主要成分，對(duì)外界刺激具有防護(hù)作用，還可防止水分散發(fā)，因此能滋潤皮膚、抗過敏，同時(shí)，還可融合角質(zhì)層蛋白形成皮膚屏障功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病小鼠皮損組織中AQP3和Cer表達(dá)降低，經(jīng)治療后兩者表達(dá)升高，可改善皮膚損傷[17]。

本研究中模型組小鼠AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常組，低、高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠AQP3和Cer mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，且具有劑量依賴性。說明：土茯苓總黃酮可降低瘙癢相關(guān)分子表達(dá)，減輕瘙癢程度。本研究通過對(duì)銀屑病小鼠皮損部位進(jìn)行病理評(píng)分，結(jié)果顯示：模型組小鼠PASI評(píng)分高于正常組，低、高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠PASI評(píng)分低于模型組，且具有劑量依賴性。

同時(shí)，皮損部位HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠表皮層菲薄，僅有少量炎性細(xì)胞；模型組小鼠表皮增厚，伴有角化過度或角化不全，真皮乳頭出現(xiàn)水腫，伴血管擴(kuò)張，棘層增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；低劑量組小鼠皮膚病理損傷改善狀況不明顯，高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠角化不全細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤減少，病理損傷明顯減輕。結(jié)果表明：土茯苓總黃酮可改善銀屑病小鼠病理損傷。研究表明，免疫失調(diào)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)與銀屑病密切相關(guān)，IFN-γ由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，在銀屑病中可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞異常增生，促進(jìn)皮膚炎癥反應(yīng)[18]。TNF-α是一種多功能性的細(xì)胞因子，在組織炎癥、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在人角質(zhì)形成細(xì)胞中高表達(dá)[19]。IL-23由抗原遞呈細(xì)胞分泌，與受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖，并產(chǎn)生包括IL-17、IL-22等多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過募集中性粒細(xì)胞，從而造成炎性損傷，包括銀屑病。本研究中ELISA法檢測IL-23、TNF-α和IFN-γ含量，結(jié)果顯示：模型組小鼠血清中IL-23、TNF-α和IFN-γ含量高于正常組，低、高劑量組和甲氨蝶呤組小鼠血清中IL-23、TNF-α和IFN-γ含量低于模型組。結(jié)果表明：土茯苓總黃酮可減輕銀屑病小鼠炎癥反應(yīng)。

銀屑病是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性皮膚病，多種 T 細(xì)胞（Th1、Treg、Th2 以及 Th17）產(chǎn)生的細(xì)胞因子在銀屑病中發(fā)揮作用，IL-17大多由Th17細(xì)胞分泌，可募集和活化中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞，還可刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子，從而促進(jìn)多種炎性介質(zhì)產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[20]。Notch家族有Notch1-4 4個(gè)受體蛋白，目前，Notch-1是研究最為廣泛的受體，Notch-1在T細(xì)胞的發(fā)展中起到重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，Notch-1信號(hào)通過調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫失衡從而參與銀屑病[21]。Jagged-1是Notch受體的主要配體之一，Jagged-1通過與Notch配體細(xì)胞外結(jié)合區(qū)相結(jié)合，可誘導(dǎo)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過下游信號(hào)因子Hes-1、NF-κB等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)：在銀屑病小鼠模型中，Notch-1、Jagged-1 和 Hes-1 高表達(dá)[22]。本研究蛋白印跡法檢測小鼠皮損組織中各蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：模型組IL-17、Notch-1、Jagged-1和Hes-1蛋白表達(dá)高于正常組，低、高劑量組和甲氨蝶呤組IL-17、Notch-1、Jagged-1和 Hes-1 蛋白表達(dá)低于模型組。結(jié)果表明：土茯苓總黃酮可抑制IL-17/Notch信號(hào)通路。

綜上所述，土茯苓總黃酮可減輕銀屑病小鼠皮膚瘙癢程度，改善病理損傷，減輕炎癥反應(yīng)，其可能是通過抑制IL-17/Notch信號(hào)通路發(fā)揮作用，為臨床治療銀屑病提供理論依據(jù)。