人參糖蛋白對少弱精癥小鼠生精障礙的改善作用

單夢瑤,王維綱,董金香,田建明,宋蓮蓮,陳英紅,房曉雪,邱智東,羅浩銘,朱迪夫

（1.長春中醫(yī)藥大學藥學院中藥藥劑實驗室，吉林 長春 130117；2.吉林醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，吉林 吉林 132013；3.吉林省中醫(yī)藥科學院中藥二所，吉林 長春 130012；4.長春中醫(yī)藥大學藥學院藥物化學與中藥化學教研室，吉林 長春 130117；5.長春中醫(yī)藥大學藥學院生物制藥與保健食品教研室，吉林 長春 130117）

少弱精癥是近年來臨床常見的病癥，多導致男性不育癥，已占男性不育病因的75%。因環(huán)境污染和生活壓力帶來的影響日益加劇，男性患有少弱精癥的人數(shù)逐年升高，發(fā)病率呈上升趨勢［1-2］，主要表現(xiàn)在精子總數(shù)與精子質量的明顯下降。目前，少弱精癥的病因病機尚不明確，致病因素較多且臨床缺少特效治療藥物［3］。現(xiàn)階段臨床上常采用經驗性藥物治療，例如采用促性腺激素和促性腺激素釋放激素等激素療法，或采用L-肉堿和維生素E治療，以及采用輔助生殖技術和手術治療提高生育率?，F(xiàn)有藥物單用療效并不顯著，臨床常采用聯(lián)合用藥的方式，藥物帶來了多種不良反應，且輔助生殖技術要求高、成功率低且價格昂貴，因此經驗性藥物及輔助技術在臨床推廣受到一定限制［4-7］。近年來，中醫(yī)藥治療少弱精癥優(yōu)勢較為明顯，市場已有的中成藥生精膠囊和麒麟丸均顯示出了獨特的療效［8-9］。

人參（Panax ginseng C.A.Mey）被譽為百草之王，具有補氣固脫、健脾補肺和安神益智的作用［10-12］。研 究［13-16］顯 示：人 參 具 有 改 善 男 性 性 功能障礙的作用，其作用機制可能與睪丸中誘導精子生成并激活和增加精原干細胞中膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF）的表達有關，也可能與以內皮細胞和血管神經為介導的一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放有關，或是人參中有效成分影響Cyp11a1基因的表達，增強睪丸功能，影響器官形態(tài)與生殖系統(tǒng)發(fā)育。因此，人參在改善生精障礙和治療少弱精癥方面有很好的開發(fā)前景。

本課題組針對人參糖蛋白（Panax ginsengglycoproteins，PGG）進行研究。本課題組［17］檢測PGG熒光標記后的小鼠體內藥物的組織分布和靶向效率結果顯示：PGG在小鼠腦組織和睪丸組織有明顯的靶向性趨勢，具有透過血腦屏障和血睪屏障的可能性。為探討PGG對少弱精癥的治療作用，本研究采用環(huán)磷酰胺建立小鼠少弱精癥模型，在此基礎上給予小鼠PGG，在體內研究PGG促進小鼠生殖功能的生物活性，并初步探討其作用機制。本實驗旨在為深度開發(fā)PGG提供依據(jù)，為少弱精癥治療藥物的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器昆明種小鼠60只，均為雄性，體質量（20±1）g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001。PGG（長春中醫(yī)藥大學自制），生精膠囊（遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司），注射用環(huán)磷酰胺（德國Baxter Oncology GmbH公司），小鼠ELISA試劑盒（江蘇綠葉生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）試劑盒（山東西亞化學股份有限公司），生理鹽水（石家莊四藥有限公司），甲醇（天津市富宇精細化工有限公司）。Olympus BX51光學顯微鏡（日本Olympus公司），NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon公司），BI2000圖像分析儀（成都泰盟科技有限責任公司），i30計數(shù)器（廣東省深圳市海天地科技有限公司），Leica RM 2255型石蠟切片機和Leica EG1140石蠟包埋機（德國Leica公司）。

1.2 PGG理化性質測定和結構分析按文獻［18］的方法測定PGG的中性糖構成比、酸性糖構成比和蛋白質構成比，進行相對分子質量分布測定、組成糖分析、氨基酸分析和甲基化分析。

1.3 PGG在小鼠睪丸組織中分布檢測按文獻［17］方法對PGG進行熒光標記，觀察其在小鼠臟器組織中的分布情況。采集小鼠睪丸組織，并置于－20℃冰箱中凍存20 min后，將組織連續(xù)切片，置于載玻片上，放入動物熒光成像儀中，觀察小鼠睪丸組織中熒光分布情況。拍攝條件：拍攝像素：2×2，F(xiàn)OV：10，激發(fā)波長：480 nm，發(fā)射波長：535 nm，曝光時間：2 s。

1.4 生精膠囊和PGG劑量設計陽性對照藥物：生精膠囊，臨床用量為0.4 g/?！?2粒/人/日，折算成小鼠的等效劑量為700 mg·kg－1；根據(jù)文獻［19-20］，PGG的低、中和高劑量分別設為100、200和400 mg·kg－1。

1.5 小鼠少弱精癥模型制備［21］取60只雄性小鼠，隨機選取10只小鼠作為正常組，腹腔注射生理鹽水10 mL·kg－1，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg·kg－1，每日1次，連續(xù)7 d，建立小鼠少弱精癥模型。與正常組比較，造模小鼠精子總數(shù)、精子活率和精子活力明顯降低，精子畸形率明顯升高，則表明造模成功。

1.6 動物分組和給藥處理將小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（生精膠囊，700 mg·kg－1）、低劑量PGG組（100 mg·kg－1PGG）、中劑量PGG組（200 mg·kg－1PGG） 和 高 劑 量PGG組（400 mg·kg－1PGG），每組10只。正常組和模型組小鼠灌胃等體積純凈水，其他各組小鼠分別灌胃相應藥液，每日1次，連續(xù)給藥28 d。

1.7 各組小鼠精子檢查給藥結束次日取材，稱量小鼠體質量、脫臼處死，打開腹腔，取出雙側睪丸，分離兩側附睪組織，置入含有提前預熱至37℃、1 mL生理鹽水的小平皿中，采用眼科剪刀剪碎，靜置5 min，吸管吹打均勻。取懸液滴于細胞計數(shù)板中，立即置于顯微鏡下計精子總數(shù)、活精子數(shù)、畸形精子數(shù)、前進運動精子數(shù)（a級精子數(shù)+b級精子數(shù)），a級精子：表示精子快速直線向前運動，直線運動；b級精子：表示精子緩慢或呆滯向前移動，緩慢運動；并計算精子活率、精子畸形率和精子活力。精子活率=活精子數(shù)/精子總數(shù)×100%；精子畸形率=（頭、尾斷裂的精子數(shù)）/精子總數(shù)×100%；精子活力=（a級精子數(shù)+b級精子數(shù)）/精子總數(shù)×100%。另取50μL懸液滴至載玻片上，蓋玻片縱向涂一線條，均勻涂片。置室溫自然干燥，甲醇固定5 min，干燥，1%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥，獲得各組小鼠精子觀察圖。

1.8 各組小鼠臟器系數(shù)測定取小鼠睪丸（雙）、前列腺+貯精囊（雙）、包皮腺（雙）和提肛肌稱質量，分別計算睪丸、前列腺+貯精囊、包皮腺和提肛肌臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=（臟器質量或臟器平均質量/小鼠體質量）×100%，單位均為mg·100 g－1。

1.9 HE染色檢測各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)取小鼠右側睪丸組織，4%多聚甲醛溶液固定24 h，進行梯度乙醇脫水透明。將固定后的組織橫切，取0.5 cm組織塊，采用石蠟包埋，制備5μm切片，組織切片置于60℃烘箱中烘烤1 h，冷卻至室溫。

將組織切片浸入二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min，采用100%、95%、90%和80%梯度乙醇水化，水沖洗，水化后的切片置入蘇木精染液中浸泡5～20 min，細胞核染成紫藍色，水沖洗3～5 min，1%鹽酸酒精分化5～30 s，水沖洗1～3 min，弱堿性水溶液返藍30～60 s，水充分沖洗5～10 min，充分水化后的切片直接入伊紅染色液中浸泡5～15 min，細胞質染成粉紅色，蒸餾水稍洗，采用90%、95%和100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。觀察各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.10 各組小鼠生精小管形態(tài)指標測量測量各組小鼠睪丸組織中12個生精小管內生精細胞層厚度，取平均值。生精細胞層厚度反映生精細胞分化成熟程度，厚度值越高，生精細胞分化層級越高，生精細胞數(shù)量越多，精子生成和成熟進程越高。

測量各組小鼠睪丸組織中5個類圓形生精小管切面內生精細胞層橫截面的面積，取平均值。生精細胞層橫截面面積反映動物生精能力，橫截面面積越大，生精細胞數(shù)量越多，生精能力越強，生成精子總數(shù)越多。

1.11 各組小鼠血清性激素水平檢測末次給藥1 h后，小鼠眼眶采血，將血樣以3 000 r·min－1離心10 min，分離血清，采用ELISA法檢測各組小鼠血清睪酮（testosterone，T）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和 催 乳 素（prolactin，PRL）水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.12 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠精子總數(shù)、臟器系數(shù)、生精小管中生精細胞層厚度和生精細胞層橫截面面積及血清性激素水平經正態(tài)性檢驗呈正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。精子活率、精子畸形率和精子活力組間兩兩比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PGG的理化性質和結構分析PGG是相對分子質量為12 690（100%）的大分子混合物，中性糖、酸性糖和蛋白質構成比分別為45.4%、4.3%和51.1%。PGG單糖組成為甘露糖（21.01%）、葡萄糖（26.53%）、N-乙酰葡萄糖或N-乙酰半乳糖（12.17%）、半乳糖（28.23%）和巖藻糖（9.78%）。氨基酸檢測結果顯示：PGG主要含有15種氨基酸，其中谷氨酸（13.724%）、精氨酸（6.227%）和賴氨酸（6.19%）居多［17］。甲基化分析和單糖組成分析結果表明：PGG的主鏈部分是由→2）-Man-（1→，→4）-Rha-（1→，→4）-Fuc-（1→，→6）-Gal-（1→，→3）-Gal-（1→，→4）-GalA-（1→，→4）-GlcNAc-（1→，→4）-GalNAc-（1→組成，支鏈主要由→3，6）-Man-（1→，2，6）-Man-（1→，2，5）-Man-（1→組成，末端主要由1→）-Fuc，1→）-Glc，1→）GlcNAc or 1→）-GalNAc組成。

2.2 PGG在小鼠睪丸組織中的分布PGG在小鼠睪丸組織處大量富集，睪丸組織的生精小管內有較強熒光信號表達，主要集中在生精小管內生精細胞表面。見圖1。

圖1 PGG在小鼠睪丸組織中的熒光分布Fig.1 Fluorescence distribution of PGG in testis tissue of mice

2.3 各組小鼠精子總數(shù)、精子活率、精子畸形率和精子活力與正常組比較，模型組小鼠精子總數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，生精膠囊組、中和高劑量PGG組小鼠精子總數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠精子活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，生精膠囊組、中劑量PGG組和高劑量PGG組精子活率明顯升高（P＜0.01）。與正常組比較，模型組小鼠精子畸形率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，生精膠囊組、中劑量PGG組和高劑量PGG組小鼠精子畸形率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與正常組比較，模型組小鼠精子活力明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，生精膠囊組、中劑量PGG組和高劑量PGG組精子活力明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表1和圖2。

圖2 各組小鼠精子形態(tài)表現(xiàn)（×100）Fig.2 Morphology of sperm of mice in various groups(×100)

表1 各組小鼠精子總數(shù)、精子活率、精子畸形率和精子活力Tab.1 Total number of sperm，survival rates of sperm,malformation rates of sperm,and motilities of sperm of mice in various groups (n=10，±s）

表1 各組小鼠精子總數(shù)、精子活率、精子畸形率和精子活力Tab.1 Total number of sperm，survival rates of sperm,malformation rates of sperm,and motilities of sperm of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.01 compared with normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Survival rate of sperm（η/%）F P Normal Model Shengjing capsule PGG Low dose Medium dose High dose Total number of sperm（×104 mL－1）148.10±35.86 94.10±27.67*126.30±27.26△76.84±6.69 55.70±10.11*74.51±9.66△△11.419 7.197＜0.01＜0.01 99.90±24.29 127.90±32.00△136.60±44.17△67.28±14.43 72.70±7.95△△74.66±3.14△△2.779 6.908 7.353＞0.05＜0.01＜0.01 Group F P F P Normal Model Shengjing capsule PGG Low dose Medium dose High dose Malformation rate of sperm（η/%）18.03±5.72 41.87±6.24*27.82±8.26△△19.270 7.197＜0.01＜0.01 Motility of sperm（η/%）68.45±7.31 47.57±7.47*66.61±9.78△△10.369 7.001＜0.01＜0.01＞0.05＜0.05＜0.01 36.95±4.20 30.73±6.40△26.67±3.94△△0.624 3.936 6.690＞0.05＜0.05＜0.01 54.83±9.54 62.83±7.41△65.89±8.32△△1.265 4.063 7.064

2.4 各組小鼠各類臟器系數(shù)與正常組比較，模型組小鼠睪丸和前列腺+貯精囊臟器系數(shù)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），包皮腺和提肛肌臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，生精膠囊組和各劑量PGG組小鼠睪丸、前列腺+貯精囊、包皮腺和提肛肌臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠各類臟器系數(shù)T ab.2 Different kinds of organ coefficients of mice in various groups [n=10，±s，w B/(mg·100 g－1)]

表2 各組小鼠各類臟器系數(shù)T ab.2 Different kinds of organ coefficients of mice in various groups [n=10，±s，w B/(mg·100 g－1)]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with normal group.

2.5 各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)各組小鼠睪丸組織病理學結果顯示：正常組小鼠睪丸組織生精細胞排列具有層次，所占面積較大，各級生精細胞數(shù)量豐富，精子分化形成過程中的各級細胞均易見，管腔內可見較多精子。與正常組比較，模型組小鼠睪丸組織生精上皮變薄，生精細胞層次和結構疏松、排列紊亂，生精過程中的各級細胞受損，分化異常，管腔內見少量精子或未見精子。與模型組比較，生精膠囊組和各劑量PGG組小鼠睪丸組織生精上皮表現(xiàn)為生精障礙的程度得到有效緩解，生精細胞層增厚，多見生精過程中的各級細胞，精子分化形成過程得到明顯改善，管腔內精子總數(shù)增加，隨著PGG劑量增加效果越明顯。見圖3。

圖3 各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.3 Pathomorphology of testis tissue of mice in various groups(HE，×400)

2.6 各組小鼠生精小管中生精細胞層厚度和生精細胞層橫截面面積與正常組比較，模型組小鼠生精小管中生精細胞層厚度和生精細胞層橫截面面積明顯減小（P＜0.01）。與模型組比較，生精膠囊組和各劑量PGG組小鼠生精小管中生精細胞層厚度和生精細胞層橫截面面積明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠生精小管內生精細胞層厚度和橫截面面積Tab.3 Spermatogenic cell layer thickness and spermatogenic cell layer cross-sectional areas in seminiferous tubules of mice in various groups (n=10，x±s）

2.7 各組小鼠血清性激素水平與正常組比較，模型組小鼠血清T、FSH和PRL水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，生精膠囊組、中劑量PGG組和高劑量PGG組小鼠血清T水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），生精膠囊組和各劑量PGG組小鼠血清FSH水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），各劑量PGG組小鼠血清PRL水平明顯升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠血清性激素水平Tab.4 Levels of sex hormones in serum of mice in various groups （n=10，±s）

表4 各組小鼠血清性激素水平Tab.4 Levels of sex hormones in serum of mice in various groups （n=10，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group T Normal Model Shengjing capsule PGG Low dose Medium dose High dose[cB/(nmol·L－1)]241.89±63.93 149.99±46.10**FSH[λB/(U·L－1)]22.18±9.73 12.22±4.76*PRL[ρB/(mg·L－1)]7.61±1.08 6.11±1.23*203.62±51.15△25.39±11.00△7.29±0.71 8.75±0.68△△9.23±0.58△△11.59±2.86△△198.03±44.08 210.35±48.75△235.89±79.25△△26.96±8.65△△21.92±5.32△△32.32±6.37△△

3 討 論

近年來，隨著人們對人參多糖及其復合物的研究不斷系統(tǒng)和深入，對PGG的生物活性有了新的認識。前期研究［22-24］證實：PGG具有改善睡眠、增強學習記憶功能、鎮(zhèn)靜催眠和鎮(zhèn)痛等多方面的作用。生精障礙即精子發(fā)生障礙，是引發(fā)男性不育的重要原因，其致病因素多樣，一些無精子癥或少精子癥等大部分是由生精障礙引起的。本研究結果顯示：PGG可提高精子數(shù)量和質量，提高小鼠血清T、FSH和PRL水平，可有效改善少弱精癥小鼠的生精障礙。

環(huán)磷酰胺是常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，具有生殖毒性，可對生精干細胞進行破壞，影響p53和Fas/FasL等途徑，從而誘導生殖細胞畸形、遺傳物突變和凋亡［25］。研究［26］顯示：環(huán)磷酰胺可引起無精癥或少精癥，導致不育或畸形的發(fā)生。本研究采用環(huán)磷酰胺建立小鼠少弱精癥模型，探討PGG對少弱精癥小鼠生精障礙的改善作用。與正常組比較，模型組小鼠的精子總數(shù)、精子活率和精子活力降低，精子畸形率升高，以上結果說明造模成功。小鼠精子總數(shù)、精子活率、精子畸形率和精子活力實驗結果顯示：生精膠囊組和各劑量PGG組小鼠上述指標均有改善，且具有劑量依賴性，即中和高劑量PGG對少弱精癥具有明顯的治療作用，表明PGG可促進精子發(fā)生，增強精子質量。小鼠臟器系數(shù)反映生殖器官的發(fā)育情況及損害情況［27］，與模型組比較，生精膠囊組和各劑量PGG組小鼠睪丸、前列腺+貯精囊、包皮腺和提肛肌臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，結果表明PGG對臟器無明顯毒害或修復損傷作用。睪丸組織病理形態(tài)結果需要結合精子檢查的相關指標綜合分析，因細胞不能明確分層，造模后會出現(xiàn)細胞成分、種類、形態(tài)復雜，排列紊亂等情況，不利于客觀評價結果。為最大可能排除干擾，減小誤差，本研究采用計算生精小管中生精細胞層厚度和生精細胞層橫截面面積的方式進行評價。本研究結果顯示：經生精膠囊和各劑量PGG治療后，小鼠睪丸組織中生精障礙均得到有效改善，且對PGG具有劑量依賴性，表明PGG可恢復生精上皮細胞形態(tài)和結構，推動細胞分化進程，逐步恢復分化秩序和功能，增加精子數(shù)量，有效改善少弱精癥。

T是雄性激素的重要組成部分，其水平與睪丸生精功能密切相關，具有促進精子生成與成熟，提升精子數(shù)量與質量的作用［28-29］。FSH作用于支持細胞分泌T，PRL雖然不被認為是一種“經典”的性激素，但其可能在男性內分泌控制中發(fā)揮作用。本研究結果顯示：模型組小鼠血清T、FSH和PRL水平明顯低于正常組，經各劑量PGG治療后，小鼠血清性激素水平提高，且具有劑量依賴性，高劑量PGG組小鼠血清T、FSH和PRL水平高于中劑量PGG組和低劑量PGG組。PGG可能是通過提高血清性激素水平從而改善少弱精癥小鼠生精障礙，但其對性激素作用的機制需要進一步的研究和探討。

綜上所述，PGG對少弱精癥小鼠的生精障礙具有明顯的改善作用，本研究結果為研究改善生精狀況、提高精子活力和提高生殖質量提供了實驗依據(jù)。