超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測定水果中17種對羥基苯甲酸酯

岑建斌，周朗君，方厚托，林茵茵，區(qū)碩俊，黨 華，何敏恒，黃嘉樂，李秀英

（廣州檢驗檢測認證集團有限公司，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447）

對羥基苯甲酸酯（Parabens），又稱尼泊金酯，因其具有酚羥基結(jié)構(gòu)，屬酚類防腐劑，其作用機制是破壞微生物的細胞膜，導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，并可抑制微生物細胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，具有良好的抑菌作用，是一種廣譜型抗菌防腐劑［1］。對羥基苯甲酸酯的烷基碳鏈越長，菌體對尼泊金酯的吸附量越大，因而抗菌活性也越大［2］。有研究表明，對羥基苯甲酸酯具有雌激素活性［3-5］，在人體中，從胃腸道和血液中迅速吸收，水解為對羥基苯甲酸，偶聯(lián)并從尿液中排出［6］。接觸對羥基苯甲酸酯可干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)［7］，且對人體細胞有一定毒性［8］，從而對人類健康產(chǎn)生有害后果。我國允許部分該類物質(zhì)（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯）作為防腐劑在食品和藥品的生產(chǎn)過程中使用［6］。其中GB 2760-2014 對經(jīng)表面處理的鮮水果中的對羥基苯甲酸酯類（甲酯、乙酯）及其鈉鹽做出明確限量，要求以對羥基苯甲酸計不得大于0.012 g/kg［9］。而國際上歐洲經(jīng)濟共同體（EEC）規(guī)定，以對羥基苯甲酸計，食品中對羥基苯甲酸酯的最高允許含量為0.1%；當(dāng)幾種對羥基苯甲酸酯復(fù)配使用時，其總量不得超過0.1%［10］。因此，有必要對除甲酯、乙酯外的對羥基苯甲酸酯類物質(zhì)進行定量研究。

目前測定對羥基苯甲酸酯的方法主要有液相色譜法［10-13］、薄層色譜法［14］、毛細管電泳法［15］、氣相色譜法［16-18］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［19-20］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［21-22］、合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［23］等。其中，液相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法具有前處理步驟繁瑣，分析圖譜易受到雜質(zhì)的影響，以及方法靈敏度較低的特點，對于ppb 級的目標(biāo)化合物，難以準確測定，易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對目標(biāo)物具有更高的選擇性，靈敏度較高，且分析圖譜受雜質(zhì)的影響較小，對于同時測定多種化合物，具有高效定性定量的優(yōu)點，且前處理無需過多凈化或衍生即可準確測定，分析時間較短。近年來，相較于上述分析方法，高分辨質(zhì)譜（HRMS）由于能測定精確質(zhì)量數(shù)，因此具有更強的定性能力，在食品殘留及污染物的快速檢測和篩查中得到一定的應(yīng)用［24-26］。本文以不同水果和17種對羥基苯甲酸酯為研究對象，借助超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS），建立了快速測定不同水果中17 種對羥基苯甲酸酯類化合物的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Vanquish UHPLC 超高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific 公司）；Thermo Q-Exactive Orbitrap 高分辨質(zhì)譜儀，配有電噴霧（H-ESI）離子源（美國Thermo Scientific 公司）；KDC-40 低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；IKA MS3 混勻振蕩器（德國IKA 公司）；ML204T 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

3，5-二氯對羥基苯甲酸甲酯（純度97%）、對羥基苯甲酸癸酯（純度95%），上海源葉生物科技有限公司；對羥基苯甲酸甲酯（純度99.7%）、對羥基苯甲酸乙酯（純度99.0%）、對羥基苯甲酸丙酯（純度＞95%）、對羥基苯甲酸異丁酯（純度＞95%）、對羥基苯甲酸丁酯（純度99.9%）、對羥基苯甲酸庚酯（純度99.9%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；對羥基苯甲酸異丙酯（純度100%）、對羥基苯甲酸異辛酯（純度≥98%），上海安譜實驗科技股份有限公司；對羥基苯甲酸苯酯（純度98%）、對羥基苯甲酸正戊酯（純度97%），加拿大Toronto Research Chemicals 公司；對羥基苯甲酸芐酯（純度100%，美國AccuStandard 公司）；對羥基苯甲酸異戊酯（純度99.6%，廣州佳途科技股份有限公司）；對羥基苯甲酸己酯（純度≥98%）、對羥基苯甲酸壬酯（純度≥98%），東京化成工業(yè)株式會社；對羥基苯甲酸正辛酯（純度98%，阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司）；甲醇（HPLC 級，德國Merck 公司）；甲酸銨（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理取適量水果，按照GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》附錄A［27］測定部位要求制備試樣，混合均勻，稱取1.0 g（精確至0.001 g）樣品于15 mL 離心管中，準確加入10 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲20 min。4 000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm尼龍膜，備用，待測。

1.2.2 標(biāo)準溶液的配制標(biāo)準儲備液：分別準確稱取適量17 種對羥基苯甲酸酯標(biāo)準物質(zhì)，用甲醇溶解后定容，折算濃度后，得到1 000 mg/L 標(biāo)準儲備液，于-20 ℃保存。標(biāo)準中間液：分別取上述標(biāo)準儲備液100 μL于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到10 mg/L混合標(biāo)準中間液。工作曲線：分別使用甲醇和空白基質(zhì)液（選取陰性樣品按“1.2.1”處理后得到），將標(biāo)準中間液逐級稀釋至2、3、4、5、10、50、100、200 μg/L。

1.2.3 液相色譜條件色譜柱：Agilent EclipsePlus C18RRHD（3.0 mm × 150 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司）；流動相：A 為5 mmol/L 甲酸銨水；B 為5 mmol/L 甲酸銨甲醇。梯度洗脫：-3 ～0 min，5%B；0 ～0.5 min，5%B；0.5 ～30 min，5%～80%B；30 ～32 min，80%～95%B；32 ～41 min，95%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI）；離子源電壓：4.5 kV；透鏡電壓50 V；鞘氣流速（Sheath gas）（氮氣）：45 unit；輔助氣（Auxiliary gas）（氮氣）：8 unit；吹掃氣（Sweep gas）：1 unit；離子傳輸管溫度（Capillary temperature）：320 ℃；輔助氣加熱溫度（Auxiliary gas heater temperature）：400 ℃；掃描模式：Full MS/dd-MS2Confirmation，采集范圍100 ～600m/z，負離子掃描模式；一級質(zhì)譜分辨率（R）：70 000；二級質(zhì)譜分辨率為17 500；歸一化碰撞能量（NCE）：10、30、50 eV：測量數(shù)據(jù)采用賽默飛TraceFinder Software 4.1（美國Thermo Scientific公司）進行采集和處理。17種對羥基苯甲酸酯類化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)列于表1。

表1 17種對羥基苯甲酸酯標(biāo)準物質(zhì)及其方法參數(shù)Table 1 Method parameters of 17 parabens standards

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜-色譜條件的優(yōu)化

通過對17種對羥基苯甲酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)進行研究，發(fā)現(xiàn)17種化合物均含有羥基和羰基，其在ESI 離子源電離時既可脫去氫離子顯示電負性，又可帶氫離子顯示電正性。分別在電噴霧正、負模式下對17 種單標(biāo)溶液（1 mg/L）進行質(zhì)譜掃描，結(jié)果顯示7 種分析物在負模式［M-H］-下響應(yīng)較高，宜采用負模式進行測定。

分別對比了5 mmol/L 甲酸銨甲醇-5 mmol/L 甲酸銨溶液、5 mmol/L 甲酸銨乙腈-5 mmol/L 甲酸銨溶液作為流動相時的色譜分離效果。結(jié)果表明，使用5 mmol/L 甲酸銨甲醇-5 mmol/L 甲酸銨體系作流動相時，色譜峰形較好，17 種化合物均可達到基線分離；使用5 mmol/L 甲酸銨乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液體系時，部分色譜峰變形，影響定量分析。因此最終選擇5 mmol/L 甲酸銨甲醇-5 mmol/L 甲酸銨溶液體系作為流動相。優(yōu)化色譜條件后17 種化合物標(biāo)準溶液的提取離子流圖見圖1。

圖1 17種對羥基苯甲酸酯標(biāo)準溶液的提取離子流圖（200 μg/L）Fig.1 XIC chromatograms of 17 parabens standard solutions（200 μg/L）the number denoted was the same as that in Table 1

2.2 提取溶劑種類的選擇

分別稱取1 g陰性蘋果樣品作為測試基質(zhì)，加入500 μg/kg的17種對羥基苯甲酸酯，同時配制空白基質(zhì)標(biāo)準曲線用于定量分析。分別加入4種不同的提取溶劑（30%乙腈、乙腈、丙酮、甲醇）10 mL，超聲20 min，實驗重復(fù)6 次（n=6），以平均回收率作為參考指標(biāo)，考察不同溶劑對回收率的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，甲醇的提取效率總體最好，回收率為88.1%～100%；采用30%乙腈水溶液提取時，由于對羥基苯甲酸酯類化合物的水溶性差，其回收率較低且沉淀效果差；使用乙腈提取時，對羥基苯甲酸酯類化合物的色譜峰形不佳，使用丙酮提取時，對羥基苯甲酸酯類化合物的回收率為62.3% ～88.3%。由于對羥基苯甲酸酯類化合物具有羥基，相比于乙腈、丙酮兩種非質(zhì)子溶劑，含有O—H鍵的質(zhì)子性溶劑甲醇具有更強的提取效果，因此對羥基苯甲酸酯使用甲醇提取更適合。

2.3 提取溶劑用量的優(yōu)化

由于水果的基質(zhì)較復(fù)雜，目標(biāo)物的提取效率易受水果中其他成分的影響，當(dāng)提取溶劑用量低時，基質(zhì)效應(yīng)增強，提取溶劑用量大時，則方法的靈敏度降低，因此需對提取溶劑的用量進行優(yōu)化。在同樣條件下，考察了不同甲醇溶劑用量（5、10、15、20 mL）對17種化合物提取率（回收率）的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)提取溶劑用量在10 mL 時，17 種化合物的整體提取率較高；當(dāng)用量低于10 mL 時，整體提取率偏低，且以對羥基苯甲酸甲酯、丙酯、正戊酯、異戊酯、庚酯、正辛酯、異辛酯、癸酯以及3，5-二氯對羥基苯甲酸甲酯受影響最大，回收率較10 mL 低10%以上，可能由于基質(zhì)在溶劑中的濃度較高，影響了對羥基苯甲酸酯類化合物的提?。划?dāng)提取溶劑大于10 mL，對羥基苯甲酸酯類化合物的回收率隨著溶劑量的增加呈下降趨勢（見圖2），且由于溶劑用量增加，稀釋倍數(shù)增加，方法的靈敏度也隨之下降。

圖2 不同溶劑及用量對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Influences of different solvents and dosages on recoveries of analytes the number denoted was the same as that in Table 1

2.4 化合物裂解途徑分析

根據(jù)具體測得的化合物碎片，推斷了17種對羥基苯甲酸酯的質(zhì)譜裂解途徑及主要碎片的具體結(jié)構(gòu)（見圖3）。17 種對羥基苯甲酸酯的分子式差異主要為R1、R2和R3基團的不同，除了3，5-二氯對羥基苯甲酸甲酯，其他化合物失去R1基團后，一般可產(chǎn)生m/z136 碎片，該碎片經(jīng)過二次或三次碎裂，可得到m/z108 和m/z93，其余的碎片主要來源于［R1-O］-，但響應(yīng)較低，因此在必要時，可考慮作為化合物自身的特征碎片進行匹配定性。另外，部分化合物m/z61的碎片響應(yīng)較高，該碎片可能是通過苯環(huán)碎裂后生成的，同樣，部分質(zhì)荷比大于93 的碎片也可能存在苯環(huán)碎裂形成的情況，但響應(yīng)均較低，因此不作深入探討。

圖3 化合物的質(zhì)譜裂解途徑分析圖Fig.3 MS fragmentation pathways of analytes

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的探究

考察了獼猴桃、葡萄、草莓、藍莓、梨、蘋果、油桃、棗、橙子、柑橘、柚子、荔枝、龍眼、火龍果、香蕉、芒果、菠蘿、青橄欖、無花果、蓮霧、西瓜、哈密瓜共22種水果基質(zhì)效應(yīng)的影響，覆蓋了GB 2763-2021 對水果的所有分類，包括較具代表性的仁果類水果、核果類水果、漿果和其他小型類水果、熱帶和亞熱帶類水果、瓜果類水果［27］。采用“1.2.1”前處理方法，得到空白基質(zhì)液，配制上機濃度為50 μg/L基質(zhì)標(biāo)準溶液，將基質(zhì)標(biāo)準溶液的峰面積與相應(yīng)濃度甲醇配制的混合標(biāo)準溶液所得峰面積相比，得到比值K。當(dāng)K＜0.8 時表示存在基質(zhì)抑制現(xiàn)象，當(dāng)K＞1.2 時表示存在基質(zhì)增強現(xiàn)象。結(jié)果表明，大部分對羥基苯甲酸酯類化合物K值在0.8 ～1.2之間，其中部分水果對應(yīng)相關(guān)化合物呈基質(zhì)抑制現(xiàn)象，如柚子中3，5-二氯對羥基苯甲酸甲酯的基質(zhì)效應(yīng)為0.758；無花果中對羥基苯甲酸甲酯的基質(zhì)效應(yīng)為0.660；菠蘿、青橄欖、柚子中對羥基苯甲酸異丁酯的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.742、0.717、0.751；青橄欖中對羥基苯甲酸正丁酯的基質(zhì)效應(yīng)為0.739。部分呈現(xiàn)基質(zhì)增強作用，如油桃、橙子中對羥基苯甲酸異辛酯的基質(zhì)效應(yīng)分別為1.286、1.291；對羥基苯甲酸正辛酯、對羥基苯甲酸正壬酯、對羥基苯甲酸癸酯在大部分水果中存在基質(zhì)增強現(xiàn)象，基質(zhì)效應(yīng)在0.871 ～3.150之間。結(jié)果顯示，隨著對羥基苯甲酸酯類化合物碳鏈增長或給電子能力變強，其基質(zhì)增強效應(yīng)整體呈上升趨勢，可能原因為水果中普遍存在的成分協(xié)同使得給電子能力更強的化合物去質(zhì)子效果更好，引起基質(zhì)增強作用。因此當(dāng)檢出基質(zhì)效應(yīng)較強物質(zhì)時，應(yīng)使用基質(zhì)標(biāo)準曲線定量。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

選取22 種不同水果經(jīng)過本方法前處理后，配制混合標(biāo)準基質(zhì)曲線，以分析物的質(zhì)量濃度為X，以其相應(yīng)峰面積為Y，擬合線性方程，獲得17種對羥基苯甲酸酯的線性范圍（見表2）。取基質(zhì)混合標(biāo)準溶液，以本方法的儀器條件進行測定，由于部分對羥基苯甲酸酯類化合物在高分辨質(zhì)譜無基線噪音，因此無法采用S/N計算方法檢出限和定量下限。本方法采用陰性獼猴桃、葡萄、草莓、藍莓、梨、蘋果、油桃、棗、橙子、柑橘、柚子、荔枝、龍眼、火龍果、香蕉、芒果、菠蘿、青橄欖、無花果、蓮霧、西瓜、哈密瓜共22種水果基質(zhì)，通過添加不同水平的17種對羥基苯甲酸酯類化合物，測得可獲得碎片離子的最低質(zhì)量濃度作為定量下限，并以定量下限最高的水果基質(zhì)表示方法定量下限。確定定量下限后，以約1/3質(zhì)量濃度對相對應(yīng)的基質(zhì)進樣，當(dāng)出現(xiàn)1個以上碎片，定義為檢出限。測定結(jié)果見表2，17種對羥基苯甲酸酯的方法檢出限為5 ～30 μg/kg，方法定量下限為20 ～100 μg/kg。

表2 17種對羥基苯甲酸酯的線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限（LOD）及定量下限（LOQ）Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of 17 parabens

2.7 回收率與相對標(biāo)準偏差

為驗證方法的回收率和穩(wěn)定性，選擇17種目標(biāo)物均呈陰性的22種水果為樣品，添加標(biāo)準溶液，最終樣品中的加標(biāo)濃度為1倍、2倍和5倍定量下限。按本方法對加標(biāo)樣品進行處理，并于同一日內(nèi)進行6個平行樣品測定（n=6），實驗結(jié)果見表3。在22種水果中，17種對羥基苯甲酸酯的回收率為70.7%～117%，相對標(biāo)準偏差（RSD）為1.5%～4.8%。除了個別基質(zhì)或某一加標(biāo)水平的結(jié)果存在偏差，以基質(zhì)標(biāo)準曲線定量，方法的回收率和RSD基本能滿足方法學(xué)的驗證要求，可用于日常實驗室的批量測定。

表3 17種對羥基苯甲酸酯的回收率及相對標(biāo)準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 17 parabens（n=6）

(續(xù)表3)

2.8 實際樣品的測定

為進一步驗證方法可行性，隨機選取實驗室的上述22 種水果樣品進行測定，每種水果10 個，共220 個。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包括1 個荔枝、1 個龍眼、1 個奇異果、1 個獼猴桃和2 個芒果在內(nèi)的6 個樣品中檢出對羥基苯甲酸甲酯，含量分別為105、242、169、108、234、845 μg/kg。另外還有1個芒果樣品，對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯均有檢出，含量分別為233、220 μg/kg（如圖4）。其余樣品均未檢出。

圖4 陽性芒果樣品中對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯的提取離子流圖Fig.4 Selected ion chromatograms of methylparaben and ethylparaben in a mango positive sample

3 結(jié) 論

本文基于直接溶劑超聲提取的方式，對不同水果中的17種對羥基苯甲酸酯進行快速測定；采用基質(zhì)標(biāo)準曲線校正結(jié)果，回收率滿足分析測定要求；使用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 進行分析測定，精確測得目標(biāo)物母離子及子離子的分子量，大大降低了假陽性的可能，并通過碎片分子量推斷出目標(biāo)物的質(zhì)譜裂解途徑；該方法建立了17種對羥基苯甲酸酯的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，可有效實現(xiàn)不同水果中對羥基苯甲酸酯類化合物的快速檢測。方法操作簡便，靈敏度高，回收率和精密度良好，可為水果中防腐劑的快速檢測提供參考。