釋氧光動力療法對根管內(nèi)糞腸球菌清除效果的體外研究

根管內(nèi)的持續(xù)性感染未得到消除是根管治療失敗的主要原因，主要由糞腸球菌等頑固性致病菌引起

。單獨使用機械儀器預備無法徹底清理根管系統(tǒng)，光動力療法（photodynamic therapy，PDT）可殺滅根管內(nèi)細菌，在根管消毒、輔助控制根管感染中效果較好

。PDT 在根管內(nèi)發(fā)揮殺菌效果，需要激光、光敏劑、氧三個重要因素共同作用，即光敏劑在根管內(nèi)均勻擴散后，通過激光一定波長的照射，在氧氣的參與下，產(chǎn)生活性氧和單線態(tài)氧，從而起到殺菌作用

。受自身解剖結(jié)構(gòu)影響，根管內(nèi)部及牙本質(zhì)小管深處不可避免存在氧不足的情況，影響了PDT 治療效果

。常用光敏劑亞甲基藍（methylene blue，MB）的光照波長為660 nm，對糞腸球菌殺菌效果較好，對MB 配方進行改性后可進一步提高PDT 殺菌能力，但目前對釋氧配方光敏劑的研究仍較少

。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建單根管離體前牙糞腸球菌根管感染模型，觀察釋氧MB 配方的PDT 對根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和材料

糞腸球菌標準菌株（ATCC29212，ATCC，美國），腦?心浸液（brain heart infusion，BHI）（海博，中國），戊二醛溶液（上海生工，中國），PBS（上海生工，中國），1%次氯酸鈉（朗力生物，中國），生理鹽水沖洗液（雙鶴，中國），MB（Sigma，美國），全氟十氫化萘（Sigma，美國），H

O

（遂成，中國），Triton?X100（上海生工，中國），N?乙?；?L?色氨酸酰胺（N?acetyl?L?tryptophan amide，NATA）（Sigma，美國），1，3?二苯基異苯并呋喃（1，3?diphenylisobenzo?furan，DPBF）（Sigma，美國）。

掃描電鏡（S3400，日立，日本），ProTaper 機用馬達和銼（登士柏，瑞士），光動力口腔治療儀（HHL?1 000，哌威，加拿大），液相色譜儀（LC?20A，島津，日本），分光光度計（UV?2600，島津，日本）。

1.2 不同配方MB 的光氧化活性和單線態(tài)氧產(chǎn)生速率測定

1.2.1 分組 參照文獻所述

，分為MB 組和釋氧MB 組，MB 組采用50 μmol/L MB 溶液，釋氧MB 組采用50 μmol/L MB 混合在釋氧乳液中（全氟十氫化萘∶H

O

∶Triton?X100=75∶24.5∶0.5）

。

1.2.2 光氧化活性測定 濃度為10 μmol/L 的熒光測定模型底物NATA與不同測試配方中的50 μmol/L MB 混合（總體積3 mL）。采用660 nm 波長，30 mW功率輻照測試溶液誘導氧化劑的產(chǎn)生，激光盡量接近測試液體表面而不接觸。利用液相色譜儀測量NATA 濃度在290 nm 波長隨著輻照時間增加的下降速率，NATA 濃度的下降速率代表了MB 或釋氧MB 的光氧化活性。檢測間隔為5 min，檢測20 min。所有實驗重復3 次。

陳豐連等[31]建立了以高效液相色譜法(HPLC)同時測定涼粉草藥材中熊果酸和齊墩果酸含量的方法，該方法簡單、準確、可靠。利用該方法可測定不同采收期、不同產(chǎn)地等不同批次的仙草熊果酸和齊墩果酸含量。冷桂華[32]利用反相高效液相層析法(RP-HPLC)測定了仙草不同部位的熊果酸和齊墩果酸含量，發(fā)現(xiàn)仙草葉的熊果酸和齊墩果酸含量均高于仙草莖和全仙草的含量；同一部位仙草的熊果酸含量明顯高于齊墩果酸含量，熊果酸含量約為齊墩果酸含量的2.5～2.8倍。

1.3 糞腸球菌根管感染模型的構(gòu)建

每組根管內(nèi)處理方法及細菌培養(yǎng)計數(shù)方法同1.4 所述。實驗及計算方法參考文獻

。

NATA 濃度的下降速率代表了光氧化活性。10 min（

= 3.570，

= 0.023）、15 min（

= 3.507，

=0.025）、20 min（

= 2.904，

= 0.044）時，釋氧MB 組NATA 濃度的下降速率高于MB 組下降速率（

＜0.05）（圖1a）。

1.4 光動力療法對根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果

取糞腸球菌根管感染的離體牙根30 個，隨機分為常規(guī)根管治療組、MB?PDT 治療組和釋氧MB?PDT 治療組，每組10 個離體牙根。同時另取10 個離體牙根不做任何處理，獲取根管內(nèi)樣本作為細菌測定基線。常規(guī)根管治療組采用1%次氯酸鈉溶液常規(guī)處理根管1 min；MB?PDT 治療組采用1%次氯酸鈉溶液處理根管后，注入50 μmol/L MB 溶液靜置1 min，采用光動力治療儀照射1 min（660 nm，30 mW），重復此步驟1 次；釋氧MB?PDT 治療組采用1%次氯酸鈉溶液處理根管后，注入50 μmol/L MB 釋氧乳化溶液靜置1 min，采用660 nm 激光照射1 min，重復此步驟1 次。

最好的檢驗方法當然是試射，但不可能把所有炮彈都拿出去射了，所以存在一個抽樣檢查的問題．類似的問題很多，例如，工廠生產(chǎn)的產(chǎn)品在上市之前一般也需要技術(shù)部門做合格鑒定，工商部門也會對市場上的商品做合格檢查，但由于這些產(chǎn)品都有包裝，一旦打開，這些產(chǎn)品就不能再賣了，所以不可能將所有產(chǎn)品都拆開檢查．即使是不需要損壞產(chǎn)品包裝，也可能由于數(shù)量的龐大，很難對每件產(chǎn)品都做檢驗，只能抽取部分產(chǎn)品做鑒定．在此基礎(chǔ)上引入簡單隨機抽樣的概念．

利用無菌紙尖在根管內(nèi)取樣，靜置60 s 后，放入盛有1 mL 無菌水的無菌離心管中并充分振蕩10 s。將細菌樣本在BHI 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)。樣本在孵育24 h 后，分別檢測每個培養(yǎng)皿上菌落形成情況并進行細菌計數(shù)。將未處理樣本的細菌數(shù)作為計算基線，按下列公式計算各組細菌的清除率：

在此種背景下，農(nóng)業(yè)的發(fā)展方式需要轉(zhuǎn)變、要從供給入手改善供給結(jié)構(gòu)，這才有了農(nóng)產(chǎn)品供給側(cè)改革。但是在今后的農(nóng)業(yè)建設(shè)與發(fā)展中，供給側(cè)改革要想得到有效的推進，除了國家的宏觀調(diào)控之外，農(nóng)民也得轉(zhuǎn)變發(fā)展觀念。通過施化肥、打農(nóng)藥、單純追求產(chǎn)量增長的生產(chǎn)方式已經(jīng)不符合時代的潮流，農(nóng)民還要調(diào)整種植結(jié)構(gòu)，多生產(chǎn)綠色有機食品，滿足消費者的需求來提升經(jīng)濟效益。

取糞腸球菌根管感染的離體牙根15 個，隨機分為常規(guī)根管治療組、MB?PDT 治療組和釋氧MB?PDT 治療組，每組5 個離體牙根，同時另取5 個離體牙根不做任何處理，獲取根管內(nèi)不同部位牙本質(zhì)小管內(nèi)樣本作為細菌測定基線。將牙根沿牙體長軸縱向劈開，將牙根三等份分為根上、根中、根下三段，采用小球鉆（直徑1 mm）在根上、根中、根下三段牙根部位的中心部位獲取深度1 000 μm 的牙本質(zhì)碎屑，為保證每個部位收集的牙本質(zhì)碎屑盡可能保持一致，應(yīng)在球鉆頭部剛好完全沒入根管內(nèi)壁時停止取樣，同時為了避免產(chǎn)熱過多，應(yīng)該間斷鉆磨，隨后用無菌水將碎屑轉(zhuǎn)移到離心管中并充分振蕩10 s。

1.5 光動力療法對不同根管部位牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌的清除效果

其中M 為基線細菌數(shù)，N 為處理后的細菌數(shù)。實驗及計算方法參考文獻［9］。

糞腸球菌的根管感染模型構(gòu)建參考以往文獻報道

，具體如下。獲取上海市口腔醫(yī)院口腔頜面外科臨床拔除的63 個根尖發(fā)育完成、單根管離體牙（審批號：滬口防倫審［2020］014 號），將牙根表面清理干凈，修整牙體，保留牙根9 mm 的長度。采用ProTaper 鎳鈦機械進行常規(guī)根管預備，根管沖洗液交替沖洗根管，沖出碎屑。離體牙根清理完成后，121 ℃高溫高壓消毒20 min，殺滅牙根內(nèi)微生物。隨后，將滅菌后的離體牙根，置于糞腸球菌BHI 肉湯中進行培養(yǎng)3 周，細菌濃度為10

CFU/mL，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 周后，取其中3 個樣本，采用高速渦輪手機沿牙體長軸縱向磨除溝槽，用骨鑿沿溝槽將牙體縱向劈開，用2.5%戊二醛固定后，脫水、干燥、噴金，隨后采用掃描電子顯微鏡觀察根管內(nèi)糞腸球菌的分布，確認根管感染模型構(gòu)建成功。

1.2.3 單線態(tài)氧產(chǎn)生速率測量 濃度為100 μmol/L的單線態(tài)氧清除劑DPBF 與不同測試配方中的50 μmol/L MB 混合（總體積3 mL）。利用光度計測定DPBF 濃度在420 nm 波長隨著輻照時間增加而降低的速率，分析不同配方MB 單線態(tài)氧產(chǎn)生的速率，檢測間隔為5 min，檢測20 min。所有實驗重復3 次。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組光氧化活性和單線態(tài)氧產(chǎn)生速率

那么如何帶動那些因病、因殘致貧，或者沒有勞動能力的重點貧困戶實現(xiàn)脫貧？為解決這一問題，石柱縣進一步探索了基金收益扶貧模式，即縣財政通過整合各類涉農(nóng)資金，建立起1億元的資產(chǎn)收益扶貧專項基金，由縣國有資產(chǎn)監(jiān)管中心委托興農(nóng)擔保公司負責管理。該基金的申請對象為農(nóng)民合作社及參與產(chǎn)業(yè)扶貧的各類企業(yè)，而收益對象為重點貧困戶，按照每帶動一戶重點貧困戶5萬元的標準計算申請借用額度，借用時限最長為5年。

DPBF 濃度的下降速率代表了單線態(tài)氧產(chǎn)生的速率。5 min（

= 6.453，

= 0.003）、10 min（

=9.166，

= 0.001）、15 min（

= 15.600，

＜0.001）、20 min（

= 10.180，

= 0.001）時，釋氧MB 組中DPBF 的下降速率高于MB 組中下降速率（

＜0.05）（圖1b）。

2.2 糞腸球菌感染根管模型的建立

經(jīng)過3 周的培養(yǎng)，采用掃描電子顯微鏡觀察根管壁表面，可以見到根管表面大量圓形的糞腸球菌附著，并侵入到牙本質(zhì)小管內(nèi)部，說明根管感染模型成功建立（圖2）。

2.3 各組根管內(nèi)糞腸球菌清除率

當代網(wǎng)絡(luò)教學資源五花八門，為了促進網(wǎng)絡(luò)教育的不斷創(chuàng)新和改革，學校和社會應(yīng)該做好網(wǎng)絡(luò)教育的先鋒和引路者，教師有責任將自己的知識無償傳授給學生，為了能讓學生更好地吸收知識，引導學生完成自主性學習，提供給學生質(zhì)量優(yōu)于市面的以取利為目的的網(wǎng)絡(luò)教學機構(gòu)或者教學平臺，學校有義務(wù)為教師的網(wǎng)絡(luò)教學活動提供平臺，社會也同樣有義務(wù)為地方網(wǎng)絡(luò)教育過程提供支持與相關(guān)所有的服務(wù)。

常規(guī)根管治療組根管內(nèi)糞腸球菌清除率為（90.43±1.43）%，MB?PDT治療組為（95.95±0.77）%，釋氧MB?PDT 治療組為（98.57 ± 1.19）%，三組根管內(nèi)糞腸球菌的清除率差異具有統(tǒng)計學意義（

=16.5，

＜0.05），釋氧MB?PDT 組糞腸球菌清除率高于MB?PDT 治療組和常規(guī)根管治療組，MB?PDT 治療組高于常規(guī)根管治療組，差異均具有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。

2.4 不同根管部位牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌清除率

三組根管不同部位（根上、根中、根下段）牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌清除率如表1 所示。根上段，三組清除率差異無統(tǒng)計學意義（

= 33.7，

＞0.05）；根中段，釋氧MB?PDT 組清除率高于常規(guī)根管治療組，差異具有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；根下段，MB?PDT 治療組清除率高于常規(guī)根管治療組，釋氧MB?PDT 組高于常規(guī)根管治療組和MB?PDT 治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。

利用Msatcommander軟件對廣西地不容的unigene序列進行SSR位點搜索。篩選標準：單堿基重復不予統(tǒng)計，二堿基至少重復6次、三至四堿基至少重復5次、五至六堿基至少重復3次。

3 討 論

糞腸球菌是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在根管內(nèi)可形成生物膜，在牙本質(zhì)小管內(nèi)的潛行深度可達1 000 μm，能夠在較為惡劣的條件下生存，可以耐受根管內(nèi)pH 值、溫度和氧張力的巨大變化，具有較強的耐藥性

。由于根管結(jié)構(gòu)的復雜性以及糞腸球菌的特點，常規(guī)根管治療方法仍然存在一定的局限性，無法完全清除根管內(nèi)的糞腸球菌感染

。PDT 作為一種新型的根管消毒方法，具有諸多優(yōu)點

：可以殺傷病原微生物而不對正常的人體細胞產(chǎn)生影響；沒有激光治療產(chǎn)熱過多損傷牙周組織的問題；光譜殺菌，無耐藥性；殺菌能力較為安全高效（無次氯酸鈉的毒性）等。但是根管內(nèi)氧不足的特點大大影響了PDT 的根管消毒能力。改善根管內(nèi)的氧環(huán)境，可以更好提高PDT在根管消毒中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用氧載體混合H

O

釋氧的配方，提高了根管消毒效果

。本研究采用了離體牙糞腸球菌根管感染模型，利用此配方進一步研究了PDT 在根管消毒中的作用。

本研究中，釋氧MB 組中的氧化活性及單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力均強于MB 組，提示該配方進一步改善了反應(yīng)中的內(nèi)在氧環(huán)境，對后續(xù)PDT 治療中進一步提高殺滅微生物的效果具有重要意義，與前期研究結(jié)果一致

。研究發(fā)現(xiàn)，PDT 與1%次氯酸鈉聯(lián)用可以起到較好的效果

，同時重復兩次PDT 治療的效果要明顯優(yōu)于單次PDT 治療的效果，殺菌率可以有效提高到95%左右

。因而，本研究在應(yīng)用1%次氯酸鈉根管消毒的基礎(chǔ)上，采用了兩次PDT 治療進行研究。結(jié)果顯示，MB?PDT 治療組的糞腸球菌清除率（95.95 ± 0.77）%高于常規(guī)根管治療組，釋氧MB?PDT 治療組的糞腸球菌的清除率（98.57±1.19）%得到進一步提高；表明改善根管內(nèi)氧環(huán)境后，提高了PDT 治療對根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌能力。

糞腸球菌可以潛伏至牙本質(zhì)小管內(nèi)1 000 μm的深度，常規(guī)根管消毒采用的次氯酸鈉等消毒溶液的滲透能力無法達到此深度

，同時因為根管結(jié)構(gòu)形態(tài)的復雜性（如根下段根管分歧、側(cè)枝等），進一步影響了根管消毒效果

。PDT 治療中，MB溶液能更好滲透進入牙本質(zhì)小管深層

，以及自由氧在根管內(nèi)不同位置充分釋放均是其發(fā)揮消毒作用的關(guān)鍵因素。因而本研究進一步研究了釋氧MB 應(yīng)用于PDT 治療在根上、根中、根下不同部位的清除效果差異。結(jié)果顯示，各組根上段糞腸球菌清除率差異無統(tǒng)計學意義；在根中段，釋氧MB?PDT 組的糞腸球菌清除率高于常規(guī)根管治療組，但與MB?PDT 治療組無明顯差異；在根下段，MB?PDT治療組的糞腸球菌清除率（91.94 ± 2.47）%高于常規(guī)根管治療組（85.44 ± 1.43）%，釋氧MB?PDT 組糞腸球菌清除率（97.87 ± 1.14）%高于MB?PDT 治療組。提示釋氧PDT 主要改善了根下段內(nèi)氧環(huán)境，并進一步提高了PDT 對根管內(nèi)糞腸球菌的輔助清除效果。

綜上，PDT 可以輔助根管治療，提高常規(guī)根管治療中根管內(nèi)糞腸球菌清除率，釋氧PDT 通過提高根管內(nèi)自由氧的含量，可進一步提高PDT 的殺菌能力，且對于根下段部分效果更加明顯。

[1] 周敏,許來俊.新型消毒方式對根管內(nèi)糞腸球菌清除作用的研究進展[J].口腔疾病防治,2020,28(9):607?612.doi:10.12016/j.issn.2096?1456.2020.09.011.Zhou M, Xu LJ. Research progress on the effect of new disinfec?tion methods on the clearance of

in the root canal[J]. J Prev Treat Stomatol Dis, 2020, 28(9): 607?612. doi:10.12016/j.issn.2096?1456.2020.09.011.

[2] Prada I, Micó?Mu?oz P, Giner?Lluesma T, et al. Influence of mi?crobiology on endodontic failure. Literature review[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2019, 24(3): e364?e372. doi: 10.4317/med?oral.22907.

[3] Bordea IR, Hanna R, Chiniforush N, et al. Evaluation of the out?come of various laser therapy applications in root canal disinfec?tion: a systematic review[J]. Photodiagnosis Photodyn Ther, 2020,29:101611.doi:10.1016/j.pdpdt.2019.101611.

[4] Stájer A,Kajári S,Gajdács M,et al.Utility of photodynamic thera?py in dentistry:current concepts[J].Dent J(Basel), 2020,8(2):43.doi:10.3390/dj8020043.

[5] Plotino G,Grande NM,Mercade M.Photodynamic therapy in end?odontics[J]. Int Endod J, 2019, 52(6): 760?774. doi: 10.1111/iej.13057.

[6] Vendramini Y, Salles A. Antimicrobial effect of photodynamic therapy on intracanal biofilm: a systematic review of

stud?ies[J]. Photodiagnosis Photodyn Ther, 2020, 32: 102025. doi: 10.1016/j.pdpdt.2020.102025.

[7] George S, Kishen A. Augmenting the antibiofilm efficacy of ad?vanced noninvasive light activated disinfection with emulsified ox?idizer and oxygen carrier[J]. J Endod, 2008, 34(9): 1119?1123.doi:10.1016/j.joen.2008.06.019.

[8] George S, Photophysical KA. Photochemical, and photobiological characterization of methylene blue formulations for light?activated root canal disinfection[J].J Biomed Opt, 2007,12(3):034029.doi:10.1117/1.2745982.

[9] 陳紅,薛凡,李巧梅,等.Er:YAG 激光聯(lián)合次氯酸鈉對根管內(nèi)壁糞腸球菌的滅除效果[J]. 口腔疾病防治, 2018, 26(12): 773?778.doi:10.12016/j.issn.2096?1456.2018.12.004.Chen H,Xue F,Li QM,et al.Effect of an Er:YAG laser combined with sodium hypochlorite on the elimination of

in the root canal[J]. J Prev Treat Stomatol Dis, 2018, 26(12):773?778.doi:10.12016/j.issn.2096?1456.2018.12.004.

[10] Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, et al.

:its role in root canal therapy failure and current concepts in rether?apy[J]. J Endod, 2006, 32(2): 93?98. doi: 10.1016/j.joen.2005.10.04.

[11] 李美美,黃紋祺,陳柯,等.光動力療法應(yīng)用于根管消毒的研究進展[J]. 口腔疾病防治, 2020, 28(11): 739?743. doi: 10.12016/j.issn.2096?1456.2020.11.011.Li MM, Huang WQ, Chen K, et al. Advances in the application of photodynamic therapy to root canal disinfection[J]. J Prev Treat Stomatol Dis, 2020, 28(11): 739?743. doi: 10.12016/j.issn.2096?1456.2020.11.011.

[12] Chiniforush N,Pourhajibagher M,Shahabi S,et al.Can antimicro?bial photodynamic therapy (aPDT) enhance the endodontic thera?py?[J]. J Lasers Med Sci, 2016, 7(2): 76?85. doi: 10.15171/jlms.2016.14.

[13] Sarda RA,Shetty RM,Tamrakar A,et al.Antimicrobial efficacy of photodynamic therapy, diodelaser, and sodium hypochlorite and their combinations on endodontic pathogens[J]. Photodiagnosis?Photodyn Ther, 2019, 28: 265?272. doi: 10.1016/j.pdpdt.2019.09.009.

[14] Prazmo EJ.GodlewskaRA,mielczarek AB.Effectiveness of repeat?ed photodynamic therapy in the elimination of intracanal

biofilm: an

study[J]. Lasers Med Sci, 2017,32(3):655?661.doi:10.1007/s10103?017?2164?3.

[15] Anagnostaki E, Mylona V, Parker S, et al. Systematic review on the role of lasers in endodontic therapy: valuable adjunct therapy?[J].Dent J(Basel),2020,8(3):63.doi:10.3390/dj8030063.

[16] Virdee SS,Seymour DW,Farnell D,et al.Efficacy of irrigant acti?vation techniques in removing intracanal smear layer and debris from mature permanent teeth:a systematic review and meta?analy?sis[J].Int Endod J,2018,51(6):605?621.doi:10.1111/iej.12877.