酮型廣藿香MVA途徑基因表達分析及與 主要成分合成相關性研究

康大力　胡偉明　歐陽蒲月

摘要： ?廣藿香藥材以廣藿香酮含量較高的酮型廣藿香為最優(yōu)質(zhì)。而廣藿香酮為一種萜類成分，其生物合成途徑尚未明確。MVA（甲羥戊酸）途徑是萜類化合物生物合成的重要途徑。為了分析MVA途經(jīng)基因表達與化學成分的相關性從而獲得促進廣藿香酮合成的潛在基因，該文以2種酮型廣藿香栽培品種（石牌廣藿香、高要廣藿香）為材料，通過實時定量PCR分析基因表達和主要成分含量測定，并研究了供試材料不同時期的莖、葉中與甲羥戊酸代謝途徑相關的HMGR、MK、MDD基因表達及化學成分。結(jié)果表明：（1）HMGR基因在石牌廣藿香嫩葉中表達更明顯; MK基因在石牌廣藿香和高要廣藿香中表達模式相似，主要在老莖中表達;MDD基因在石牌廣藿香葉中比高要廣藿香表達量更高，在兩種廣藿香的莖中表達模式相似。（2）同屬于酮型廣藿香，石牌廣藿香與高要廣藿香的化學成分相似，老葉廣藿香醇含量最高，老莖的廣藿香酮含量更高。（3）MDD和MK基因與廣藿香酮的合成正相關。綜上結(jié)果所述，酮型廣藿香兩個栽培種MVA途徑的基因表達模式相似，MDD和MK基因可能為酮型廣藿香萜類代謝途徑的關鍵基因。

關鍵詞： 廣藿香， ?MVA途徑， 廣藿香酮， MDD基因， MK基因

中圖分類號： ?Q943文獻標識碼： ?A文章編號： ?1000-3142（2022）05-0745-08

Gene expression analysis of MVA pathway in Pogostemon

cablin and its correlation with synthesis of main components

Abstract： ?Among all the Pogostemon cablin medicinal materials， the pogostonetype one with higher content of pogostone is regarded the best. However， as a terpenoid component， the biosynthesis of pogostone is still not clear. MVA （cytoplasmic） pathway is an important pathway for terpenoid biosynthesis. In order to clarify the correlation between chemicals and related gene expression， in this study， the gene expression of HMGR， MK and MDD of cytoplasmic pathway and the chemical components in stems and leaves of two pogostonetype P. cablin cultivars （Shipai and Gaoyao） were studied， by using real time quantitative PCR to analyze gene expression and main components measurement. The results were as follows： （1） HMGR gene was more obviously expressed in the tender leaves of Shipai cultivar. The expression pattern of MK gene in Shipai cultivar and Gaoyao cultivar was similar， and MK gene was mainly expressed in old stems. MDD gene was more expressed in Shipai cultivar leaves than that of Gaoyao cultivar， but was expressed in similar patterns in the stems of Shipai cultivar and Gaoyao cultivar. （2） Both belonging to pogostonetype P. cablin， Shipai cultivar and Gaoyao cultivar had similar chemical components. Old leaves had the highest patchoulol content and old stems had the highest pogostone content. （3） MDD and MK genes were positively related to the synthesis of pogostone， which will lay a foundation for exploring key genes in P. cablin terpenoid metabolism pathway. In conclusion， the gene expression patterns of MVA pathway in two P. cablin cultivars are similar， and MDD and MK genes may be the key genes of terpenoid metabolism pathway in P. cablin.

Key words： Pogostemon cablin， MVA pathway， pogostone， MDD gene， MK geneC657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

廣藿香（Pogostemon cablin） 為唇形科刺蕊草屬植物，以全草入藥（國家藥典委員會，2020），為芳香化濕藥，是“藿香正氣散”、“抗病毒口服液”、“保濟丸”等中成藥的主要成分，也是香料、化妝品等的主要原料之一。廣藿香在新型冠狀病毒肺炎診療中也發(fā)揮了重大作用，在5種相關證的治療方案中有所應用（國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局，2020）。廣藿香揮發(fā)油的主要成分為萜類化合物（陳赫等，2018）。萜類化合物主要通過甲羥戊酸（mevalonate， MVA）途徑和甲基赤蘚醇4磷酸（methylerythritol 4phosphate， MEP）途徑合成（Yu & Utsumi， 2009），其中MVA途徑也稱為細胞質(zhì)途徑，MEP也稱為質(zhì)體途徑（Lichtenthaler， 2015）。通常，MVA途徑產(chǎn)生倍半萜，而MEP途徑將前體提供給半萜類、單萜類和二萜類成分。萜類合成途徑中的多種合成酶是MVA和MEP途徑代謝調(diào)控的重要靶點（Hemmerlin， 2012）。在MVA途徑中，三個乙酰輔酶A分子和一個3羥基3甲基戊二酰輔酶A分子最初聚集，然后中間分子參與由羥基3甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGS，EC 2.3.3.10）和3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR，EC 1.1.1.34）催化的反應。甲羥戊酸激酶（MVK，EC 2.7.1.36）、磷酸羥戊酸激酶（PMK，EC 2.7.4.2）和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MDDEC，EC 4.1.1.33）形成IPP（異戊烯焦磷酸）。之后由法尼基二磷酸合成酶（FPPS，EC 2.5.1.10）催化胞質(zhì)IPP和DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）的凝聚，形成倍半萜的中間體（圖1）。

隨著轉(zhuǎn)錄組測序和全基因組測序的興起，對廣藿香醇的生物合成途徑研究逐漸增多。Nath（2010）從廣藿香轉(zhuǎn)錄組文庫中發(fā)掘到74個萜類生物合成相關基因，并檢測其在廣藿香葉、莖和花中的表達，檢測了倍半萜生物合成途徑中與廣藿香醇合成有關酶的活性。此外，還有研究從廣藿香中克隆到了倍半萜MEP途徑的限速酶HMGR的cDNA，并做了生物信息學分析及在大腸桿菌（Escherichia coli）中的表達（Yu & Utsumi， 2009）。

廣藿香屬于十大嶺南特色“廣藥”，也是“粵八味”之一。由于地理條件的差別，不同產(chǎn)地的廣藿香具有不同的形態(tài)特征和揮發(fā)油含量。廣藿香藥材商品按產(chǎn)地主要分為石牌廣藿香、高要廣藿香、湛江廣藿香、海南廣藿香四種（徐頌軍等，2003）。根據(jù)廣藿香酮（pogostone）和廣藿香醇（patchoulol）相對含量可將廣藿香藥材分成醇型廣藿香和酮型廣藿香。醇型廣藿香包括湛江廣藿香、海南廣藿香;酮型廣藿香則包括石牌廣藿香、高要廣藿香。石牌廣藿香原產(chǎn)于廣州石牌一帶，傳統(tǒng)認為，石牌廣藿香為廣藿香的道地品種，質(zhì)量最優(yōu)。但隨著城市化的進程，市場上石牌廣藿香已十分少見，逐漸被高要廣藿香所取代。廣藿香酮已被證明具有多種功能，包括抗胃潰瘍（Chen et al.， 2015）、阻止增殖（Su et al.， 2015）和抗菌活性（Yi et al.， 2013）等。因此，與醇型廣藿香主要應用于化妝品和香料行業(yè)不同，酮型廣藿香更多被應用于中醫(yī)藥領域。

廣藿香酮屬于萜類物質(zhì)衍生物，MVA是通路萜類物質(zhì)的上游合成代謝途徑，莖和葉是廣藿香藥材的主要取材組織部位。因此，明確代謝途徑基因的時空表達模式，不同生長時期莖葉的有效成分含量以及與基因表達的相關性，對于闡明廣藿香酮在高要廣藿香和石牌廣藿香中的合成途徑和提高藥材質(zhì)量具有重要意義，是有效利用廣藿香的重要前提。作者前期的研究中，已經(jīng)將兩種醇型廣藿香（海南廣藿香和印尼廣藿香）進行了萜類代謝途徑表達分析（Ouyang et al.， 2016），研究結(jié)果顯示兩種醇型廣藿香不同部位不同生長階段的萜類代謝相關基因表達類似，挖掘了廣藿香醇合成相關候選基因，為醇型廣藿香的應用提供了基礎。目前，在石牌廣藿香和高要廣藿香的萜類代謝途徑及葉、莖部分的表達差異比較方面還是空白。對萜類代謝途徑進行表達分析，能夠?qū)ν蛷V藿香和醇型廣藿香的差異提供分子基礎。同時，將基因表達與成分含量進行相關性分析，可發(fā)掘提高有效成分含量的潛在基因。對酮型廣藿香兩個栽培種的代謝途徑及各部位的揮發(fā)油含量及成分進行比較，也可促進對廣藿香藥材種質(zhì)資源的有效評估。

1材料與方法

1.1 植物材料

石牌廣藿香和高要廣藿香采自于廣州天河龍洞嶺南中藥園廣藿香種植地（113°22′ E， 23°12′ N，海拔39 m）。由廣東食品藥品職業(yè)學院莫小路教授鑒定。取兩個品種的幼葉進行全長基因的克隆。實時定量PCR（RTqPCR）分析材料根據(jù)葉片的大小及葉在莖上的位置將廣藿香的葉和莖分為三個時期（Yu et al.， 2015）（圖2）：嫩葉（莖頂端剛出來的第一對葉）;成熟葉（第四至第五個節(jié)葉）;老葉;嫩莖（莖頂端）;成熟莖（未木質(zhì)化）;老莖（木質(zhì)化）。每個樣品采集約1 g，在液氮中冷凍，在-80 ℃保存。

1.2 RNA提取和RTqPCR分析

按照文獻（Ouyang et al.， 2016）的方法進行。在對RNA的質(zhì)量和完整性進行檢查后，將高質(zhì)量的RNA用于基因分離或基因表達的測定。RTqPCR方法如文獻所述（Ouyang et al.， 2016），每個反應重復三次。RTqPCR引物見表1，數(shù)據(jù)以三個生物重復的平均值±標準差表示。根據(jù)文獻（Livak & Schmittgen， 2001）計算基因表達水平。

1.3 化學試劑

廣藿香酮對照品（批號：G055180710， 成都

瑞芬思生物科技有限公司）;廣藿香醇對照品（批號：B037180122，成都瑞芬思生物科技有限公司）;正十八烷（SIGMA公司）;乙腈色譜純（德國默克公司）;甲酸（德國默克公司）;無水乙醇、乙醚、甲醇、無水硫酸鈉等試劑均為分析純。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

1.4 儀器設備

Agileng1200高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、自動進樣器、PDA檢測器、在線脫氣機，美國安捷倫公司）;Agilent7892A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）;色譜柱為HP5石英毛細管柱（0.25 μm × 30.0 m × 250 μm）;BT 125D十萬分之一分析天平（德國賽多利斯）;超純水為milliQ超純水機制備（美國Millipore公司）;揮發(fā)油提取器;水分測定儀。

1.5 廣藿香化學成分的分析

1.5.1 揮發(fā)油的提取采集石牌廣藿香與高要廣藿香成熟莖、老莖、成熟葉、老葉（石牌廣藿香與高要廣藿香的嫩莖及嫩葉揮發(fā)油含量太低，無法提取，本研究不進行這兩個時期的數(shù)據(jù)測定）。樣品放至通風處室溫陰干，切成1～2 cm的小段，備用。取干燥的廣藿香藥材200 g，置于5 000 mL圓底燒瓶中，加3 000 mL蒸餾水浸泡1 h后開始提取。提取方法見《中國藥典》（國家藥典委員會，2020）通則2204項規(guī)定方法（甲法）。

1.5.2 廣藿香醇含量測定對照品溶液及供試品溶液的制備：均按文獻（陳瑜珍等，2020）的方法進行。氣相色譜條件：初始溫度180 ℃，停留2 min，以每5℃的速率升溫至230 ℃;進樣口溫度280 ℃，輔助溫度280 ℃，分流進樣，分流比為10∶1。離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度150 ℃，全掃描方式，NIST14.1質(zhì)譜庫揮發(fā)油中廣藿香醇GCMS分析（圖3）。

1.5.3 廣藿香酮含量測定對照品溶液、供試品溶液制備：均按文獻（陳瑜珍等，2020）的方法進行。色譜條件色譜柱：Phenomenex，Gemini 5 μ C18（250 mm × 4.60 mm）。流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液（65%∶35%），等度洗脫，流速0.8 μg·min1，柱溫30 ℃，檢測波長310 nm，進樣體積10 μL。運行時間15 min，色譜圖見圖4。線性關系考察：按照色譜條件，精密吸取不同濃度廣藿香酮標準品溶液10 μL，注入HPLC色譜儀，檢測峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸（圖5），回歸方程為Y=18.35X-47.19，R2=0.999 9，線性范圍為6.25～200 μg·mL1。穩(wěn)定性試驗：取配制好的供試品溶液任一種，制備后在不同時間對樣品按色譜條件進樣分析，共分析6次（制備后2、4、6、8、12、24 h），測定廣藿香酮峰面積，結(jié)果表明相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.05%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。精密度實驗：取50 μg·mL1對照品溶液，按色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，廣藿香酮峰面積的RSD為0.63%，表明高效液相色譜這套儀器的精密度良好，實驗數(shù)據(jù)可信。重復性試驗：取同一批廣藿香油6份，每份0.15 g，精密稱定，按照步驟2方法配制后，按色譜條件測定。結(jié)果，樣品中廣藿香酮峰面積的RSD為0.86%，表明該方法的重復性良好。數(shù)據(jù)分析方法：揮發(fā)油含量分析均使用LSD法進行多重比較;R 3.6軟件以及agricolae包進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1 酮型廣藿香萜類代謝MVA途徑中HGMR、MK、MDD基因在莖葉不同時期的表達

為了比較石牌廣藿香和高要廣藿香次生代謝相關基因的時空表達模式，本研究對MVA途徑中三個關鍵酶基因（HGMR、MK、MDD）在葉片和莖中的表達量進行了檢測（圖6）。結(jié)果表明：在石牌廣藿香葉片生長發(fā)育過程中， HGMR、MDD、MK表達下降，但當葉片衰老后，表達則又增高;莖發(fā)育過程中，HMGR、MDD、MK表達均呈增高趨勢，在老莖中表達最高。在高要廣藿香中，發(fā)現(xiàn)了相似的基因表達模式;唯有HGMR在葉中表達趨勢與石牌廣藿香不同，其在成熟葉片中高表達，幼葉次之，老葉最低（圖6）。

2.2 廣藿香醇和廣藿香酮的含量與相關基因表達的關系

為了進一步確定廣藿香在藥材商品中最佳的藥用部位，本研究測定了酮型廣藿香在成熟莖、老莖、成熟葉、 老葉四個部位的廣藿香醇和廣藿香酮的含量。結(jié)果表明：石牌廣藿香的老莖廣藿香酮含量最高，為301 μg·g1，而成熟莖為233 μg·1，二者差異較大;而高要廣藿香的老莖和成熟莖中廣藿香酮的含量差異不大，老莖為242 μg·g1，成熟莖為239 μg·g1（圖7）。石牌廣藿香和高要廣藿香嫩莖和嫩葉揮發(fā)油含量過低，本研究未對其進行測定。同樣，廣藿香醇在老莖和成熟莖的揮發(fā)油太少，也未能檢測到其含量。兩種酮型廣藿香的廣藿香醇含量，老葉均比成熟葉高，其中石牌廣藿香的老葉廣藿香醇的含量為559 μg·g1，成熟葉為403 μg·g1;高要廣藿香的老葉廣藿香醇的含量為445 μg·g1，成熟葉為415 μg·g1。

為了進一步評價基因與植物化學物質(zhì)之間的關系，使用XLSTAT將不同部位與采收時期廣藿香醇和廣藿香酮的含量以及相對應基因的表達水平進行相關性分析，估計Pearson相關系數(shù)。結(jié)果表明，MK （R2=0.758， P<0.05）和MDD （R2=0.758， P<0.05）的表達加速了廣藿香酮的積累。

3討論與結(jié)論

廣藿香藥材的道地品種屬于酮型廣藿香如高要廣藿香，而石牌廣藿香在市場上卻因為產(chǎn)量低而少見。qPCR被認為是檢測RNA水平最靈敏、高效快捷的方法，常用于單個或多個基因的表達分析。本研究分析結(jié)果顯示，MVA途徑3個基因的表達模式在石牌和高要兩個栽培種間高度相似。在遺傳學中，基因表達是以環(huán)境依賴方式連接基因型和表型的基本因素（Nevozhay et al.， 2012）。這可能從分子水平上解釋了高要廣藿香和石牌廣藿香同屬一個化學型的原因，為市場上用高要廣藿香代替石牌廣藿香提供了理論支持。石牌廣藿香在宋代就從印度尼西亞傳入，并移植到中國廣東省的高要等地區(qū)。目前，廣藿香的種植主要是靠扦插繁殖和組織培養(yǎng)。因此，酮型廣藿香的基因變異和物種分化有限，不利于物種變異（徐頌軍等，2003;吳友根等，2007）。這可能是高要廣藿香的MVA途徑基因表達模式與石牌廣藿香相似的原因。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

植物中萜類化合物的產(chǎn)生和積累具有組織特異性特點，它們的增加與發(fā)育階段有關（Yu et al.， 2015）。本研究發(fā)現(xiàn)，在石牌廣藿香和高要廣藿香兩個品種葉片的三個發(fā)育階段廣藿香酮含量都非常低，而在兩個品種的衰老莖中，廣藿香酮含量增加。因此，廣藿香酮的生物合成也具有組織特異性和生長周期依賴性，在種植酮型廣藿香時，莖應受到更多的關注。

從廣藿香藥材質(zhì)量優(yōu)良評價來看，廣藿香酮含量是廣藿香質(zhì)量的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)MK和MDD基因可能是影響廣藿香中廣藿香酮含量的重要基因，為通過代謝工程轉(zhuǎn)基因方法提高廣藿香中廣藿香酮的含量提供了研究思路。此外，二者在廣藿香酮生物合成中的作用還需要進一步通過轉(zhuǎn)基因等分子生物學和代謝工程手段驗證。

人們普遍認為，道地藥材是藥用植物長期適應環(huán)境的結(jié)果，遺傳因素可能是道地藥材與非道地藥材化學成分差異顯著的根本原因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高要廣藿香和石牌廣藿香的MK和MDD基因表達模式相似，在石牌廣藿香和高要廣藿香中，廣藿香酮的含量均較高，表明高要廣藿香能夠代替石牌廣藿香具有合理性。MVA途徑的MK和MDD基因與廣藿香酮合成正相關，本研究結(jié)果闡明了廣藿香的基因表達和化學成分相關性，將有助于萜類產(chǎn)物生物合成的提高，為更好地利用廣藿香奠定了基礎。

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（責任編輯周翠鳴）

收稿日期： ?2021-03-24

基金項目： ?浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2019RC270）;寧波市自然科學基金（2019A610372）;廣東省科技計劃項目（2019B030316019）;廣東省自然科學基金（2018A030313255）

第一作者： 康大力（1981-），博士，副主任中藥師，研究方向為中藥藥理與中藥生物技術(shù)，（Email） dlkang500@163.com。

通信作者： ?歐陽蒲月，博士，副教授，研究方向為藥用植物生物技術(shù)，（Email）ouyangpy@gdyzy.edu.cn。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0