微波輔助提取花生紅衣和花生殼中多酚物質(zhì)及抗氧化活性對(duì)比研究

溫志英，郭清爽，劉 坤，趙 飛

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)工商管理學(xué)院，河北石家莊 050061）

花生（Arachis hypogaea L.）是全球最重要的四大油料作物（油菜、大豆、花生、芝麻）之一。我國是世界花生生產(chǎn)大國和花生加工利用強(qiáng)國[1]，2018 年花生年總產(chǎn)量1 733.2 萬t，居世界首位[2]。花生殼和紅衣是花生的副產(chǎn)物，我國年產(chǎn)花生殼約520 萬t，花生紅衣600 t，除了少部分被用作中藥、飼料和燃料外，資源浪費(fèi)極其嚴(yán)重[3-4]。

Francisco M L 等人[5]、Elsorady M E 等人[6]和Adhikari B 等人[7]研究表明花生皮、殼含有豐富的多酚類物質(zhì)（白藜蘆醇、原花色素、黃酮類等），具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等生物活性，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無毒的新型天然抗氧化劑。劉翠等人[8-9]的研究表明花生紅衣多酚還是有效的食品防腐保鮮劑。微波輔助提取（MAE）具有提取時(shí)間短、效率高、能耗低的特點(diǎn)，同時(shí)能降低熱敏性物質(zhì)降解風(fēng)險(xiǎn)，是一種環(huán)境友好的綠色提取技術(shù)[10-13]。因此，通過微波輔助工藝提取花生皮、殼中的多酚類物質(zhì)，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較研究。試驗(yàn)參考Jayaprakasha G 等人[14]的方法，以抗壞血酸當(dāng)量濃度（mg AA/g）表示花生紅衣、花生殼DPPH 自由基的清除能力，目前在國內(nèi)未見報(bào)道。研究成果對(duì)于有效利用我國豐富的花生紅衣和花生殼資源中的天然多酚活性成分，實(shí)現(xiàn)循環(huán)農(nóng)業(yè)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

花生紅衣、花生殼，市售帶殼花生手工剝殼。

1.2 試劑

沒食子酸（Gallic acid，GA），抗壞血酸（Ascorbic acid，AA），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），福林酚試劑，Sigma-Aldrich 公司提供；無水Na2CO3、無水乙醇、甲醇、硫酸亞鐵、水楊酸，均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

HH-4 型恒溫水浴鍋、RA-8 微波萃取儀、DFY-300 g 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)、SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、722E 型分光光度計(jì)、72-1 型電熱恒溫干燥箱、800 型離心沉淀器、Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 花生皮、殼預(yù)處理

花生皮、殼→50 ℃下恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥4 h→粉碎機(jī)粉碎→過40 目篩→正己烷浸提脫脂24 h→-20 ℃冰箱密封避光儲(chǔ)存，備用。

1.4.2 花生紅衣、花生殼多酚提取

花生皮殼粉末→稱量→乙醇水溶液恒溫浴振蕩（160 r/min，60 ℃）10 min→微波萃取→離心→取上清液→定容→測定吸光度→計(jì)算花生紅衣、花生殼多酚得率（以當(dāng)量沒食子酸(GA)表示）。

式中：A——吸光度；

m——稀釋倍數(shù)；

n——提取液體積，mL；

G——花生紅衣、花生殼質(zhì)量，g。

1.4.3 多酚含量的測定

多酚的含量測定采用Folin-Ciocalteu 法[15]。沒食子酸回歸方程：Y=0.006 1X+0.077 7，R2=0.999 6。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.4 花生紅衣、花生殼多酚類化合物的體外抗氧化活性研究

（1）DPPD 自由基清除能力測定。以抗壞血酸（AA，0.02 mg/mL）作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，其體外抗氧化活性作用以抗壞血酸當(dāng)量表示mg AA/g，采用Jayaprakasha G 等人[14]的方法測定DPPD 自由基清除能力測定。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）羥基自由基的清除能力測定。采用水楊酸法[16-17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）及Duncan's 多重檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以p＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)值以均質(zhì)±標(biāo)準(zhǔn)差SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取2 g 花生紅衣、花生殼粉末，料液比1∶40，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，微波功率240 W，微波提取時(shí)間30 s，其余步驟同1.4.2。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見圖3。

由圖3 可知，花生紅衣多酚在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)得率最高為137.11 mg GA/g，而花生殼多酚在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)得率最高為15.34 mg GA/g。得率先升高后下降是由于不同體積分?jǐn)?shù)乙醇極性不同，根據(jù)相似相溶原理，多酚在極性最相似的溶液中溶出最高，得率最大。由于花生紅衣與花生殼二者多酚的具體成分差異較大，花生紅衣中的酚類物質(zhì)以原兒茶酸、兒茶素、原花青素為主[9]，而花生殼中主要為木犀草素[18-19]，故而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二者的影響不同。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

2.1.2 微波功率對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

分別以80%，60%的乙醇為提取劑提取花生紅衣、花生殼多酚，微波功率為160，320，480，640，800 W，其余條件同2.1.1 進(jìn)行微波提取。

微波功率對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見圖4。

圖4 微波功率對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

由圖4 可知，隨微波功率的增大，總多酚得率增加，但繼續(xù)增大微波功率，多酚得率下降?；ㄉt衣在微波功率達(dá)到480 W 時(shí)，多酚得率最大為138.07 mg GA/g，花生殼在微波功率640 W時(shí)達(dá)到最大為18.96 mg GA/g?？赡苁且?yàn)檫m當(dāng)?shù)奈⒉üβ视欣诨ㄉt衣中多酚的溶出，但過高的微波功率則有可能破壞多酚類化合物，致使其得率下降。

2.1.3 料液比對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

花生紅衣（80%乙醇，480 W），花生殼（60%乙醇、640 W），料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，其余條件同2.1.1 進(jìn)行微波提取。

料液比對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)花生紅衣、殼多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著料液比的增加，多酚得率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，花生紅衣、花生殼多酚得率均最大，之后增加料液比，多酚得率有所下降，由此可見增大料液比有利于多酚物質(zhì)溶出，當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，多酚溶出達(dá)到最高，當(dāng)料液比繼續(xù)增大會(huì)造成雜質(zhì)過多的流出從而阻止了多酚類化合物的溶解，影響得率。料液比為1∶40 時(shí)，花生紅衣、花生殼的多酚得率分別為145.02 mg GA/g和19.82 mg GA/g。

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

花生紅衣（80%乙醇，480 W），花生殼（60%乙醇，640 W），料液比為1∶40，其他條件同2.1.1。

微波時(shí)間對(duì)花生殼多酚得率的影響見圖6。

圖6 微波時(shí)間對(duì)花生殼多酚得率的影響

由圖6 可知，在10～40 s 內(nèi)隨著微波時(shí)間增加，總多酚得率也隨之增加，在40～60 s 內(nèi)得率下降，當(dāng)微波時(shí)間為40 s 時(shí)多酚得率最高，這是因?yàn)槲⒉ㄓ欣诙喾拥娜艹觯?dāng)微波時(shí)間過長則會(huì)降解或破壞已溶出的多酚類化合物，導(dǎo)致總多酚得率下降，這與Ekezie F G 等人[10]和Zhang G 等人[12]的研究結(jié)果一致。微波時(shí)間40 s 時(shí)，花生紅衣、花生殼多酚得率分別為145.96 mg GA/g 和20.55 mg GA/g。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 花生紅衣多酚正交試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間3 個(gè)對(duì)花生紅衣多酚得率影響顯著的因素，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化提取工藝[19]。

花生紅衣多酚正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，花生紅衣正交試驗(yàn)方差分析見表2。

表1 花生紅衣多酚正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，影響花生紅衣多酚得率的因素從大到小為A＞B＞C，A 和B 對(duì)提取有極顯著影響，C對(duì)提取有顯著影響。最佳工藝條件為A2B2C2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶40，微波時(shí)間40 s。按照1.4.2 方法進(jìn)行提取，試驗(yàn)重復(fù)3 次，花生紅衣多酚得率為179.20 mg GA/g，高于李娜等人[18]報(bào)道的147.72 mg GA/g，與Francisco M L 等人[20]研究報(bào)道花生紅衣中的多酚含量在110～280 mg GA/g 試驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 花生紅衣正交試驗(yàn)方差分析

2.2.2 花生殼多酚正交試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取微波功率、料液比、微波時(shí)間為三因素，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化提取工藝。

花生殼多酚正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，花生殼正交試驗(yàn)方差分析見表4。

表3 花生殼多酚正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 花生殼正交試驗(yàn)方差分析

由表4 可知，影響花生紅衣多酚得率的因素從大到小為A'＞B'＞C'，三者對(duì)提取有極顯著影響。最佳工藝條件為A'3B'2C'2，即微波功率800 W，料液比1∶40，微波時(shí)間40 s。以60%乙醇為提取液，按照1.4.2 方法進(jìn)行提取，試驗(yàn)重復(fù)3 次，得花生殼多酚得率為20.63 mg GA/g。

2.3 花生紅衣、花生殼多酚類對(duì)DPPH 自由基的清除能力

花生紅衣、花生殼多酚抗氧化活性比較見圖7。

圖7 花生紅衣、花生殼多酚抗氧化活性比較

由圖7（a）可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL時(shí)，花生紅衣多酚、抗壞血酸、花生殼多酚DPPH自由基清除率分別為72.28%，56.40%，32.27%，花生紅衣多酚對(duì)自由基的清除能力顯著高于花生殼多酚，同時(shí)優(yōu)于抗壞血酸，具有顯著差異（p＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.007 5 mg/mL 時(shí)，花生紅衣和抗壞血酸清除率分別為85.59%和84.16%，差異不顯著（p＜0.05）。在質(zhì)量濃度為0.000 5～0.007 5 mg/mL 時(shí)，抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)性，回歸方程為Y=10 885X+1.823 3，R2=0.999 3。根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，花生紅衣多酚的當(dāng)量抗壞血酸為131.56±2.20 mg AA/g，花生殼多酚的當(dāng)量抗壞血酸為6.51±0.71 mg AA/g。因此，花生紅衣清除DPPH 自由基能力顯著高于花生殼（p＜0.05），與李娜等人[18]和Meng W 等人[21]已報(bào)道的研究成果一致。

2.4 花生紅衣、花生殼多酚對(duì)羥基自由基清除能力

由圖7（b）可知，花生紅衣、花生殼多酚對(duì)羥基自由基有清除能力均隨著花生紅衣、花生殼多酚質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為0.015 mg/mL 時(shí)，花生皮、殼多酚的·OH 清除率分別為51.86%和43.26%，花生紅衣多酚的清除羥基自由基能力顯著高于花生殼多酚（p＜0.05）。

3 結(jié)論

花生紅衣微波輔助提取多酚物質(zhì)的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶40，微波功率480 W，微波時(shí)間40 s，花生紅衣多酚得率為179.20 mg GA/g；花生殼微波輔助提取多酚物質(zhì)的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶40，微波功率800 W，微波時(shí)間40 s，花生殼多酚得率為20.63 mg GA/g。

花生紅衣的DPPH 自由基清除能力和羥基自由基清除能力均優(yōu)于花生殼?；ㄉt衣DPPH 自由基清除能力優(yōu)于抗壞血酸，其當(dāng)量抗壞血酸為131.56±2.20 mg AA/g，花生殼的當(dāng)量抗壞血酸為6.51±0.71 mg AA/g。由此可見，花生皮、殼多酚均具有抗氧化性，花生紅衣抗氧化性尤為突出，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，為開發(fā)花生皮殼等農(nóng)業(yè)廢棄物資源提供了依據(jù)。