兔源多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

王佳佳，劉玉梅，徐靖怡，朱欣妍，位 蘭，朱雪敏，張自強(qiáng)

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471000)

兔巴氏桿菌病和兔克雷伯菌病是兔的常發(fā)病。兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種兔的傳染病，該病無明顯季節(jié)性，但冷熱交替的春、秋季多發(fā)，各年齡段的兔均可感染發(fā)病，臨床上以呼吸道癥狀為主要特征，偶見中耳炎和結(jié)膜炎[1-3]。兔克雷伯菌病是由肺炎克雷伯菌引起的以肺炎和器官化膿性炎癥為主要特征的傳染病[4-5]。

目前，多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌已被廣泛關(guān)注，但是河南省兔多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌混合感染的報(bào)道相對較少。本研究從河南省某長毛兔養(yǎng)殖場采集了8份打噴嚏、咳嗽等呼吸道癥狀的兔肝臟、肺臟、氣管和脾臟樣品，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，分離出了8株多殺性巴氏桿菌和8株肺炎克雷伯氏桿菌，并分別對其進(jìn)行了敏感藥物篩選試驗(yàn)。為確定常用抗菌藥的耐藥譜，并為臨床治療兔多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌病的藥物篩選提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源2021年1月，河南省某兔場成年毛兔，出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽等呼吸道癥狀，病兔大量死亡。無菌采集8份病死兔肝臟、肺臟、氣管、脾臟組織，進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)及耐藥鑒定。

1.2 主要試劑與儀器LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、血清瓊脂培養(yǎng)基(含5%新生胎牛血清)購自北京索萊寶科技有限公司。Premix TaqTM(E× TaqTMVersion 2.0 plus dye)購自寶生物工程(大連)有限公司。DL2000 DNA Marker購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。Proteinase K、細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。藥敏紙片、微量生化反應(yīng)管購自杭州微生物試劑有限公司。試驗(yàn)用主要儀器包括臺式冷凍高速離心機(jī)(Beckman Coulter)、普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)、凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)、電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 病原菌的分離純化無菌采集病兔肝臟、肺臟、氣管、脾臟組織，分別接種于LB固體培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基(含5%新生胎牛血清)，37℃培養(yǎng)24～36 h后，觀察菌落的生長情況。挑取疑似單個(gè)菌落進(jìn)行分離純化并進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。

1.4 生化試驗(yàn)將純化培養(yǎng)的細(xì)菌分別接入微量生化管后封口，37℃培養(yǎng)24～72 h，觀察記錄結(jié)果。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成參照GenBank中登錄的多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因序列，利用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對引物。引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成，引物序列及預(yù)期片段的大小見表1。

表1 引物序列

1.6 分子生物學(xué)鑒定取分離純化后的菌液，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。以細(xì)菌基因組DNA為模板，分別進(jìn)行多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌16S rRNA基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：DNA模板 1 μL，上、下游引物各1 μL ，Premix TaqTM12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃變性 4 min；94℃ 30 s；57℃ 30 s；72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。目的基因片段用2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果與GenBank中登錄的菌株進(jìn)行同源性比對，并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 分離菌的小鼠致病性試驗(yàn)將2種分離菌于37℃培養(yǎng)24 h后，用平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，稀釋菌液濃度至108CFU/mL。將15只SPF級KM小鼠(體質(zhì)量在 20 g 左右)隨機(jī)分為對照組、試驗(yàn)1,2組，每組5只。試驗(yàn)1，2組小鼠按0.2 mL/只劑量分別經(jīng)腹腔注射2種分離菌，對照組注射相同劑量滅菌PBS。相同環(huán)境下隔離飼養(yǎng)，觀察記錄小鼠狀況，同時(shí)對發(fā)病死亡小鼠進(jìn)行剖檢及PCR檢測。

1.8 藥敏試驗(yàn)按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的K-B紙片法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷[6]?？股丶埰ǎ杭t霉素、慶大霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素 、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、麥迪霉素、卡那霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氯霉素、頭孢哌酮、頭孢唑啉。

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢臨床剖檢發(fā)現(xiàn)病死兔肺充血出血，并有膿腫和灰白色小結(jié)節(jié)病灶，肺胸膜與心包胸膜有纖維素附著，肝臟淤血、腫大可見出血斑點(diǎn)，心內(nèi)、外膜有出血斑點(diǎn)(圖1 A～C)；膽囊腫大，充滿膽汁(圖1 D)；脾臟出血腫大(圖1 E)；腎臟腫大，并伴有出血點(diǎn)(圖1 F)。

A～C.胸腔、肝臟；D.膽囊；E.脾；F.腎

2.2 形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)，我們從8只病兔肝臟、肺臟、氣管、脾臟組織中分離得到16株細(xì)菌，且8株的形態(tài)特征、生化特性和藥物敏感性一致，另8株同樣一致，可見此次為2種不同細(xì)菌的混合感染。經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌1在血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落光滑、邊緣整齊，呈半透明、露珠樣小的菌落(圖2A)，革蘭染色鏡檢可見革蘭陰性，單個(gè)或成雙存在的短小球桿菌(圖2B)。細(xì)菌2在LB固體培養(yǎng)基上長出乳白色、濕潤、閃光、凸起豐厚黏稠的大菌落(圖2C)，革蘭染色鏡檢可見短粗呈卵圓形的革蘭陰性桿菌(圖2D)。

2.3 生化試驗(yàn)分離菌的生化鑒定結(jié)果顯示，細(xì)菌1和細(xì)菌2分別符合多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌的生化特性(表2)。根據(jù)分離菌的形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察及生化試驗(yàn)分析，初步判定此次分離菌為多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌，分別命名為HN-W01和LY-W05株。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分子生物學(xué)鑒定以提取的HN-W01和LY-W05菌株的基因組為模板，采用16S rRNA基因引物，經(jīng)PCR鑒定。結(jié)果顯示，獲得片段大小約為643，1 494 bp(圖3A,B)，與預(yù)期相符。將分離測序后的HN-W01和LY-W05菌株的16S rRNA基因進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果顯示，分離得到的HN-W01菌株與參考菌株的同源性為82.45%～99.32%，與參考菌株AY604234.1基因序列同源性最高，同源性為99.32%；分離得到的LY-W05菌株與參考菌株的同源性為99.86%～100%，與參考菌株AY540111.1同源性最高，為100%。16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示，HN-W01株與菌株AY604234.1在同一進(jìn)化分支上，為多殺性巴氏桿菌(圖4A)；LY-W05株與菌株AY540111.1、MN548367.1、HQ407264.1、AB513734.1、MT12-3506.1、MN032380.1處于進(jìn)化樹同一簇中，且與其中菌株AY540111.1親緣關(guān)系最近，屬于肺炎克雷伯菌(圖4B)。

A.細(xì)菌1在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.細(xì)菌1革蘭染色(1 000×)；C.細(xì)菌2在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；D.細(xì)菌2革蘭染色(1 000×)

2.5 分離菌的小鼠致病性試驗(yàn)用2株分離菌攻毒后，試驗(yàn)1,2組小鼠均表現(xiàn)為精神不振，食欲下降，48 h內(nèi)試驗(yàn)組全部死亡，空白對照組小鼠正常。剖檢病死小鼠發(fā)現(xiàn)注射巴氏桿菌組小鼠心外膜有出血點(diǎn)；肺臟嚴(yán)重出血；肝臟,脾臟淤血、腫大；腸道,腸系膜等出血。注射肺炎克雷伯菌組小鼠肺臟,肝臟,脾臟出血、腫大；腸道內(nèi)有黃綠色內(nèi)容物。選取死亡小鼠肺臟、肝臟、脾臟、心臟等組織病料接種LB固體培養(yǎng)基和血清瓊脂培養(yǎng)基，分離的菌落特征、染色鏡檢、生化鑒定結(jié)果均與原分離菌株一致，PCR鑒定證實(shí)序列與原分離株相同。

A.多殺性巴氏桿菌;B.肺炎克雷伯菌;M.DL2000 DNA Marker；1.肝臟；2.肺臟；3.氣管；4.脾臟

2.6 藥敏試驗(yàn)將該多殺性巴氏桿菌與肺炎克雷伯菌分別接種到含抗生素的培養(yǎng)基上，測量抑制圈的直徑。多殺性巴氏桿菌與肺炎克雷伯菌對不同藥物的敏感性見表3。由表3可知，多殺性巴氏桿菌對慶大霉素、多西環(huán)素、多粘菌素B和氯霉素4種藥物敏感，對紅霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、頭孢哌酮不敏感，對新霉素、四環(huán)素、麥迪霉素、卡那霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、頭孢唑林7種藥物有較強(qiáng)抗性；肺炎克雷伯菌對多粘菌素和氯霉素2種藥物敏感，對卡那霉素和頭孢唑林不敏感，對紅霉素、慶大霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、麥迪霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢唑酮11種藥物有較強(qiáng)抗性。

A.多殺性巴氏桿菌；B.肺炎克雷伯菌

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，居民對動(dòng)物性產(chǎn)品的需求持續(xù)增長，對食品的營養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量也越發(fā)重視。相較其他肉類，兔肉以其高蛋白、高礦物質(zhì)、高消化率以及低脂肪、低膽固醇、低能量的特性著稱，具有很高的營養(yǎng)和食用價(jià)值，已成為人們的一種新選擇。目前，我國養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展盛況空前，規(guī)?；脠隹焖僭黾?。但當(dāng)前疾病問題仍舊突出，特別是傳染性鼻炎、肺炎，流行性腹脹腹瀉以及球蟲病的發(fā)病率和死亡率仍然較高，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展[7-10]。

目前，在家兔呼吸道傳染病中，兔多殺性巴氏桿菌和兔肺炎克雷伯菌病流行廣泛且嚴(yán)重。以往的報(bào)道顯示，多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌在哺乳動(dòng)物和禽類中均可寄生，可引起機(jī)體受到嚴(yán)重危害[11-12]。王錦祥等[3]從患結(jié)膜炎的病兔中發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌感染；韓坤等[13]從腹瀉和呼吸道癥狀的藍(lán)狐病料中分離出肺炎克雷伯菌；薛念宇等[14]從體溫升高、呼吸困難、不食、流涎、急性胃腸炎和急性死亡為特征的病牛中分離得到多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌。但關(guān)于多殺性巴氏桿菌與肺炎克雷伯菌混合感染兔的報(bào)道卻較少見。本研究通過病原菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、分子生物學(xué)鑒定及動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法，分離得到了多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌。為了進(jìn)一步確認(rèn)兩種病菌，我們對其進(jìn)行了序列測定，最終證實(shí)該地區(qū)送檢的病兔為多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌混合感染。

家兔感染后具有很強(qiáng)的傳染性，因此快速有效地使用相應(yīng)藥物控制疾病的發(fā)生十分重要。本次對分離株進(jìn)行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌多粘菌素B和氯霉素敏感，對其他藥物有不同程度的耐藥性。此次，我們選用多粘菌素B和慶大霉素對感染兔進(jìn)行了治療，病情得到良好控制。這為我國兔源多殺性巴氏桿菌和肺炎克雷伯菌的預(yù)防和治療提供了科學(xué)參考。