細菌對抗宿主細胞自噬策略

趙維薇 ，王 辰 ，肖 鵬，高 洪

(1.大理大學 公共衛(wèi)生學院，云南 大理 671000；2.云南農業(yè)大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；3.大理大學 工程學院，云南 大理 671000；4.云南農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，云南 昆明 650201)

自噬(autophagy)，是一種進化保守的細胞利用溶酶體降解自身胞質內物質及其受損細胞器的過程。當面臨營養(yǎng)缺乏、氧化應激、缺氧和病原體入侵等細胞壓力時，自噬可以迅速誘導細胞適應環(huán)境變化。自噬在包括細胞發(fā)育在內的眾多細胞生理過程中發(fā)揮著重要作用，比如面臨饑餓時維持氨基酸庫的平衡；同時與多種人類疾病有關，比如神經退行性變、癌癥、病原體感染、炎癥性疾病等[1-3]。當機體面臨細菌、病毒等病原體入侵時，自噬會被激活，在胞質中的細菌、囊泡或吞噬體中的細菌被清除過程中發(fā)揮重要作用[4]。經過與宿主細胞自噬系統(tǒng)的長期互作，細菌進化出各種各樣的機制來逃避、對抗自噬。現介紹細胞自噬系統(tǒng)靶向病原菌的機制，并重點探討細菌應對細胞自噬的策略。

1 自噬概述

按照自噬識別的特異性,細胞自噬分為選擇性自噬和非選擇性自噬。一般認為,營養(yǎng)缺失導致的自噬為非選擇性自噬,其作用主要是為細胞提供能量和必需品。選擇性自噬參與特異性物質的降解，包括線粒體自噬(mitophagy)、過氧化物酶體自噬(pexophagy)、異體自噬(xenophagy)、聚集體自噬(aggrephagy)、脂噬(lipophagy)等[5]。選擇性自噬需要受體(cargo receptor)與自噬體之間的識別,而非選擇性自噬沒有[6]。根據吞噬物進入溶酶體的途徑,可將細胞自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)三類[7]。巨自噬是自噬的一種經典形式，也是目前研究得最深入的一種形式，通常將巨自噬簡稱為自噬。經典的自噬過程包括幾個步驟：啟動(initiation)、成核(nucleation)、形成分隔膜及分隔膜延伸(formation and expansion of phagophore)、自噬體與溶酶體融合(fusion of autophagosome with lysosome)、自噬溶酶體內物質降解(degradation in autolysosome)[8-10]。它受到一系列信號通路的嚴格調控，涉及一系列事件，包括自噬相關(autophagy-related ，ATG)蛋白含量的改變，亞細胞定位的改變和翻譯后修飾。在酵母細胞中，研究人員鑒定了36個ATG蛋白，可以在不同的環(huán)節(jié)參與自噬反應。15個ATG核心蛋白(ATG1-10，12-14，16，18)參與自噬體生物合成，它們在哺乳動物中高度保守[11]。自噬的啟動受到細胞中兩個重要蛋白的調控，能量傳感器AMP活化激酶(AMP-activated kinase,AMPK)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)。兩個泛素化結合系統(tǒng)(ubiquitin-like conjugation systems，UBL system)控制ATG12-ATG5-ATG16L1復合物和微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)蛋白-磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)的產生，這對于自噬體的延伸和閉合非常重要[12]。不斷延展的分隔膜最終自我融合形成了一個封閉的雙層膜結構——自噬體，待降解的物質被包裹在自噬體中。最后在小GTP酶Rab7、C類空泡蛋白分揀蛋白(class C vacuolar protein sorting,VPS)、可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子黏附蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)樣蛋白以及溶酶體膜蛋白等因子的參與下，自噬體與內源溶酶體的囊泡融合，以實現對囊泡內物質的降解和循環(huán)利用[8]。

2 異體自噬

異體自噬作為細胞利用自噬清除入侵病原體的方式，需要經典自噬的核心組件，同時作為一種選擇性自噬，還不能缺少自噬受體(autophagy receptor)的參與，也被稱為自噬接頭蛋白(adaptor)[13-14]。比如，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染巨噬細胞時，被吞噬的結核分枝桿菌可以通過破壞吞噬體膜逃逸到細胞質中[15]。逃逸的細菌DNA被胞質傳感器環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS)識別，cGAS通過泛素連接酶Parkin和Smurf1激活泛素化，并招募自噬受體，如p62/SQSTM1,BRCA1基因1鄰接蛋白(neighbor of BRCA1 gene 1，NBR1),核結構域10蛋白52(nuclear domain 10 protein 52，NDP52),視神經蛋白(optineurin，OPTN)誘導異體自噬[16-19]。

不僅胞漿中游離的細菌，含有細菌并被破壞的吞噬體也能被宿主吞噬體腔內的糖鏈所靶向[20]。最終，細菌被自噬體包裹并被送到溶酶體進行降解。在這一過程中，自噬可以產生抗菌肽并將其輸送到自噬溶酶體腔室，從而促進細菌的殺滅[21-22]。

自噬受體的共同點是都包含2個重要的結構域，泛素結合域(ubiquitin-binding domain，UBD)和LC3結合域(LC3-interacting region，LIR)[23]。因此自噬受體可以通過UBD結合泛素化的病原體，再通過LIR基序將它們募集到自噬體膜上，這就是被普遍認識的異體自噬靶向病原體的泛素依賴途徑。例如上皮細胞受感染時，鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)存在于含沙門菌的囊泡中(Salmonellacontaining vacuole，SCV)。然而，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢ secretion system，T3SS)的膜穿孔活性造成SCV膜的損壞，導致細菌滲出到胞質中。其中一些細菌被泛素包被，p62、NDP52和OPTN識別泛素化的鼠傷寒沙門菌，并將它們靶向至自噬體[24]。p62和NDP52也參與了福氏志賀菌(Shigellaflexneri)的異體自噬[25]。病原菌的泛素化是在E3泛素連接酶的作用下完成的，近年來研究的較為深入鑒定出了一些E3連接酶。比如LRSAM1(leucine-rich repeat and sterile α motif-containing-1)是沙門菌感染時進行泛素化的一種重要的酶[26]。在結核分枝桿菌誘導的異體自噬中，E3連接酶Parkin和Smurf1分別是K63和K48泛素化所必須的[27-28]，其中Parkin是線粒體自噬中最主要的E3泛素連接酶。Smurf1還介導K48相關的單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)泛素化，限制李斯特菌在巨噬細胞中的增殖[27]。最近，有研究表明E3連接酶LUBAC(linear Ub chain assembly complex)在胞質鼠傷寒沙門菌表面結合M1型線性多聚泛素鏈(M1-linked linear poly-Ub patches)，進而傳遞抗菌和促炎信號[29]。

除了泛素依賴途徑，其他非泛素依賴途徑也在異體自噬的細菌靶向中發(fā)揮著重要作用，包括核苷酸結合寡聚化結構域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-containing，NOD)、半凝乳素(galectin)、甘油二酯(diacylglycerol，DAG)和補體C3蛋白(the complement protein C3)，它們在福氏志賀菌和單增李斯特菌、沙門菌等的異體自噬中發(fā)揮作用[4]。另外SUDHAKAR等[30]通過對病原菌效應蛋白進行結構生物學和生物信息學分析，認為一些細菌效應蛋白可以直接與自噬受體(如p62和NDP52)甚至自噬核心組分相互作用。

3 細菌對抗細胞自噬的方式

有些細菌會被異體自噬靶向并清除，但也有一些細菌進化出了對抗或逃避這種宿主防御系統(tǒng)的機制。異體自噬發(fā)生時，宿主體內的自噬體可以包裹多種不同的胞質內細菌或載菌囊泡，但是不同種類的細菌進化出它們獨特的機制以對抗宿主細胞自噬。CEMMA等[12]、WU等[4]以及KWON等[13]從不同的角度對細菌與宿主細胞的互作方式進行了綜述和分類，本文進一步將細菌對抗宿主細胞自噬的策略分為三大類：逃避自噬、抑制自噬和操縱自噬。

3.1 逃避自噬(evasion of autophagy)福氏志賀菌進入宿主細胞后被囊泡包裹，之后可以逃避自噬體的捕捉進入胞質中。其細菌表面毒力蛋白IcsA(也被稱為VirG)被ATG5識別后，激活異體自噬，這一過程需要宿主蛋白Tecpr1(tectonin domain-containing protein)將Atg5-靶向的細菌和WIPI2陽性吞噬體膜連接起來；與此同時，為了對抗宿主自噬防御系統(tǒng)，志賀菌分泌另一種細菌蛋白IcsB，與ATG5競爭結合IcsA，從而逃避自噬途徑的識別[31-32]。近期研究表明IcsB是一種C18脂肪?；D移酶，介導賴氨酸Nε-脂肪乙?；?。一種核內體ESCRT-Ⅲ復合物的組分CHMP5，是抗志賀菌自噬所必需的，IcsB介導的自噬抑制是CHMP5被修飾失活的一種間接結果[33]。

單增李斯特菌可以利用一種產生孔洞的毒素李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO)和兩種磷脂酶C逃離吞噬囊泡。一旦進入了細胞質中，細菌表面的毒力因子肌動蛋白A(actin A，ActA)募集肌動蛋白相關蛋白Arp2/3復合體，催化肌動蛋白在細菌表面聚合，掩蓋細菌以逃避自噬的識別[34]。李斯特菌還可以利用其表面的內化素 K(internalins K，InlK)將穹隆蛋白(major vault protein，MVP)招募到細菌表面，隨后 ActA 取代 Inlk、肌動蛋白取代MVP來修飾細菌，阻止細菌泛素化以及自噬組件的識別[35]。

一些細菌不形成保護罩，而是通過靶向自噬受體而來逃避自噬。其中的一個例子是A 群鏈球菌(group AStreptococcus，GAS)。GAS的M1T1所克隆表達的半胱氨酸蛋白酶SpeB可以在宿主細胞中降解p62、NDP52和NBR1 ，以防止被宿主自噬所識別[36]。

3.2 抑制自噬(inhibition of autophagy)結合自噬發(fā)生的過程來看，細菌對自噬的抑制主要包括抑制自噬啟動、抑制自噬體形成、抑制自噬體的成熟3種情況。

3.2.1抑制自噬啟動 一些細菌通過抑制自噬的啟動以逃脫宿主細胞自噬。一種小GTP酶Rab1A，是自噬啟動中的必要因子。鼠傷寒沙門菌分泌的效應蛋白SseF和SseG通過直接與宿主的Rab1A互作抑制自噬的啟動。這種互作影響了Rab1A 與鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)、TRAPPIII復合體的相互作用，從而阻礙Rab1A的激活，導致自噬啟動組件ULK1的募集和激活受到抑制，還降低了磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)的生物發(fā)生，最終阻礙自噬小體的形成[37]。與此類似，志賀菌T3SS效應蛋白VirA和胞外腸道致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)效應蛋白EspG含有GTP酶激活蛋白區(qū)域，能特異性地使Rab1失活，導致自噬誘導的抑制[38]。

鼠傷寒沙門菌通過調控AMPK依賴的mTOR激活途徑抑制自噬啟動。沙門菌感染通過沙門毒力島2(Salmonellapathogenicity island 2，SPI2)T3SS依賴的方式誘導溶酶體降解Sirt1、LKB1和AMPK。AMPK激活復合體被降解，導致mTOR的激活以及自噬的抑制[39]。囊泡型H+ATP酶(Vacuolar-type H+ATPase，V-ATPase)是發(fā)揮異體自噬作用所必需的，沙門菌T3SS效應蛋白SopF催化宿主載菌囊泡上V-ATPase的ADP核糖基化，解除載菌囊泡上mTORC1的功能，模仿氨基酸充盈的狀態(tài)，從而抑制異體自噬的啟動[40]。結核分枝桿菌H37Rv菌株通過其效應蛋白Eis干擾JNK-ROS信號通路抑制自噬的啟動，增強其在細胞內的存活。Eis是一種N-乙酰轉移酶，介導JNK特異性磷酸酶絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-7(mitogen-activatedprotein kinase phosphatase-7，MKP-7)的乙?；图せ?導致JNK失活[41]。

一些胞外細菌毒素通過升高胞內環(huán)狀AMP(cAMP)的水平抑制自噬的啟動，cAMP是很多細胞內活動的一種二級信使，負向調控自噬。兩種升高cAMP的毒素，炭疽桿菌的水腫毒素(edema toxin ，Edtx)和霍亂弧菌的霍亂毒素(cholera toxin ，Ctx)，都可以通過蛋白酶K(PKA)途徑抑制自噬包括抗菌自噬[42]?；魜y弧菌MARTX毒素具有PI3P特異性磷脂酶A1(PI3P specific phospholipase A1，PLA1)活性，可降低細胞內PI3P水平，抑制自噬和核內體運輸[43]。

3.2.2抑制自噬體形成 核心自噬組件對于清除細胞內的細菌是必需的，一些細菌通過直接干擾核心自噬組件以抑制自噬體的形成。

嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)利用T4SS效應蛋白RavZ抑制自噬。RavZ是一種半胱氨酸蛋白酶，可以不可逆的將LC3蛋白從PE上解離，抑制自噬體的形成[44]。RavZ通過自噬體的C端PI3P結合域和α3螺旋靶向自噬體膜，并通過其N端LC3結合域(LC3-interacting region，LIR)基序識別膜上的LC3分子[45-46]。近期的研究表明RavZ的蛋白水解活性干擾泛素向含沙門菌的囊泡募集[47]。

軍團菌的另一個效應因子Lpg1137是一種可以降解突觸融合蛋白17(syntaxin 17，Stx17)的絲氨酸蛋白酶，Stx17通過與ATG14L結合將PI3KC3復合物招募到線粒體相關的內質網膜，并參與自噬體-溶酶體融合[48]。 Lpg1137可導致Stx17的損耗以及PI3P形成的減少，說明軍團菌可以干擾自噬體生物發(fā)生的早期[49]。李斯特菌產生兩種磷脂酶PlcA和PlcB，下調PI3P水平，導致自噬前體結構產生的抑制，進而抑制異體自噬靶向胞質細菌[50]。

3.2.3抑制自噬體的成熟 自噬體包裹細菌后，還需要一個成熟的過程，包括自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，從而利用溶酶體的酸性環(huán)境和豐富的酶類將細菌降解。

結核分枝桿菌的兩種效應蛋白SapM磷酸酶和PknG激酶通過SecA2-依賴的蛋白轉運系統(tǒng)進行轉運，在抑制吞噬體和自噬體成熟、促進結核分枝桿菌在宿主細胞中生存和繁殖發(fā)揮作用。Rab5-Rab7交換對自噬體成熟很重要，但是SapM利用其磷酸酶活性抑制Rab5-Rab7交換[51]。另外，結核分枝桿菌H37Rv毒力因子PhoP和Esat-6通過抑制Rab7向含菌自噬體募集，阻斷巨噬細胞和樹突狀細胞中自噬體的成熟[52-53]。

李斯特菌表達的毒力蛋白LLO可以阻止非經典自噬途徑產生的LC3標記吞噬體的成熟[12]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)可以通過免疫顯性表面抗原B(immunodominant surface antigen B ，IsaB)蛋白的表達抑制自噬體-溶酶體融合[54]。金黃色葡萄球菌侵入HeLa細胞后，激活絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、磷酸化Atg5以及抑制自噬體與溶酶體的融合，從而逃避自噬的降解[55]。假結核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)在巨噬細胞中也可以阻止含菌自噬體的成熟，避免菌體被自噬降解[56]。這些能阻斷自噬溶酶體成熟的細菌逃避了自噬系統(tǒng)的降解作用后，還能采用多種策略在宿主細胞中生存并增殖。

3.3 操縱自噬(manipulation of autophagy)一些細菌在長期的進化過程中，進化出操縱自噬組件進行生存和繁殖的能力，它們將自噬組件如自噬體、自噬溶酶體變成其復制龕。

假結核耶爾森菌在巨噬細胞中改變自噬途徑以阻止自噬體與溶酶體的融合，細菌被包裹在LC3標記的雙層膜或者多層膜包裹的非酸性囊泡中進行復制[56]。吞噬體囊泡中的鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)募集宿主蛋白Rab4a、Rab1b、Rab11b至吞噬體膜上，被LC3標記的自噬體包裹后，宿主蛋白阻止自噬體與溶酶體的融合，從而實現菌體在非酸性自噬體中增殖[56]。與此類似，金黃色葡萄球菌也可以在LC3標記的非酸性雙層膜囊泡中存活和增殖；在李斯特菌感染的后期，細菌可以在LC3標記的單層膜含菌大吞噬泡中緩慢增殖[12]。在一些比較寬容的宿主細胞中(比如人和A/J鼠巨噬細胞)，嗜肺軍團菌可以延遲自噬的成熟至感染后4～6 h以分化成為耐酸形式，自噬體最終與溶酶體融合，而嗜肺軍團菌最終也可以在酸性環(huán)境中復制，此過程涉及多種細菌效應蛋白[57]。

除了異體自噬，近期的研究發(fā)現線粒體自噬等選擇性自噬也可能被細菌利用以促進自身的繁殖。比如李斯特菌通過LLO毒素的作用操縱宿主細胞發(fā)生線粒體自噬，從而降低線粒體產生的活性氧含量以促進自身繁殖[58]。還有一些細菌可以主動誘導宿主細胞的自噬，進而加以利用。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)感染時，利用空泡毒素(VacA)抑制mTORC1以誘導宿主自噬，并能在自噬體中增殖[59]。

細菌對宿主細胞自噬系統(tǒng)的操縱作用不一定都導致宿主細胞的損傷和死亡，也可以幫助細菌逃離宿主細胞。MIAO等[60]的研究發(fā)現尿路致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli,UPEC)感染膀胱上皮細胞后，會被自噬體靶向，隨后穿梭到多泡小體中以形成自噬內涵體，最終停留在溶酶體中。但是它們沒有在溶酶體中被降解，因為細菌可以上調溶酶體的pH值至中性，抑制溶酶體酸化。黏膜TRP通道3(mucolipin TRP channel 3，TRPML3)是溶酶體上一種瞬時受體電位陽離子通道，能觸發(fā)Ca2+流出，啟動溶酶體的外排作用，導致被外泌體包圍的細菌排出。在此過程中自噬減輕了受感染細胞的細菌負載。

4 展望

細菌病原體和宿主自噬系統(tǒng)之間是相互作用的。一方面，細菌可以被宿主自噬系統(tǒng)限制，最終被自噬清除；另一方面，病原細菌進化了很多機制對抗宿主細胞自噬，逃避、抑制甚至操縱宿主自噬組件。要解答胞內細菌如何被異體自噬靶向，細菌如何操縱宿主細胞自噬仍然需要更加深入的研究。細胞自噬系統(tǒng)對細菌感染的響應，以及細菌對自噬系統(tǒng)的調控，都涉及到細菌表達的效應蛋白，在細菌對抗自噬的諸多研究報道中可以看到研究人員已經發(fā)現了多種細菌調控自噬的效應蛋白，這是清晰闡述細菌與宿主細胞自噬系統(tǒng)相互作用過程的一個關鍵點。構建基因缺失突變菌株是研究細菌蛋白在自噬中功能的重要手段，需要綜合運用多種新的技術，比如邵峰課題組在沙門菌抑制宿主細胞自噬的研究中就運用了轉座子遺傳篩選技術和CRISPR 篩選技術[40,61]。另外，SUDHAKAR等[30]還利用結構生物學和生物信息學技術，通過識別預測含有選擇性自噬受體SQSTM1/p62，CALCOCO2/NDP52和MAP1LC3/LC3識別基序的細菌蛋白，預測了人自噬蛋白和56種病原菌效應蛋白的潛在互作關系，并通過試驗證實了沙門菌效應蛋白YhjJ和自噬組件的相互作用。繼續(xù)研究異體自噬靶向細菌的機制，發(fā)現細菌調控自噬的效應蛋白，探明其與宿主自噬系統(tǒng)的互作機理具有重要的意義，其理論可以指導靶向抗菌藥物的開發(fā)，為防控動物和人的細菌感染性疾病治療提供新的策略。

細菌對抗宿主細胞自噬示意圖