H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒的免疫防治效果評價(jià)

于海英，孫藝學(xué)，秦佳儀，王 瑋，張鵬舉，叢彥龍*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.長春大學(xué) 吉林省生物醫(yī)學(xué)工程研發(fā)中心，吉林 長春 130022； 3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物生物技術(shù)研究所，吉林 長春 130033)

馬流感是由正黏病毒科α流感病毒屬的A型流感病毒引起馬屬動物的一種常見呼吸系統(tǒng)傳染病[1]，是OIE法定報(bào)告動物疫病之一。該病傳播迅速，在歐洲、北美洲、南美洲、大洋洲、亞洲、非洲等30多個(gè)國家均有報(bào)道[2]，表現(xiàn)出全球性流行趨勢，發(fā)病率接近100%，病死率為2%[3]。近年來，隨著馬術(shù)賽事等相關(guān)行業(yè)的蓬勃發(fā)展以及養(yǎng)馬業(yè)的逐漸興起，馬流感的公共安全問題得到了廣泛關(guān)注。

馬流感病毒(equine influenza virus，EIV)包括H7N7和H3N8 2個(gè)血清亞型，分別于1956年在捷克布拉格[4]和1963年在美國邁阿密[5]首次分離或報(bào)道。自20世紀(jì)70年代末以來，H7N7亞型EIV已經(jīng)在馬群中消失，而流行于世界各國馬群中的主要是H3N8亞型EIV[6]。在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上，H3N8 EIV分化出歐亞譜系和美洲譜系。歐亞譜系毒株在2007年后幾近消失[7]；而美洲譜系演化出Florida、Kentucky和South America 3個(gè)亞系。其中，F(xiàn)lorida亞系又進(jìn)一步分化出2個(gè)具有明顯抗原差異的進(jìn)化分支[8]。基于全球的EIV流行病學(xué)數(shù)據(jù)，OIE建議自2010年起，馬流感疫苗應(yīng)當(dāng)包括Florida 2個(gè)分支的毒株[9]。疫苗接種是限制H3N8 EIV感染的最有效措施[10]。目前，已有多種市售馬流感疫苗，包括滅活疫苗、亞單位疫苗、冷適應(yīng)株減毒活疫苗和金絲雀痘病毒活載體重組疫苗[2，9-11]。

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是一種由病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成的納米級多聚蛋白復(fù)合體。它不含有任何遺傳物質(zhì)，其形態(tài)、大小類似天然病毒粒子，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。絕大多數(shù)VLPs都含有功能性的病毒膜蛋白或糖蛋白，可以被樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞優(yōu)先加工遞呈，進(jìn)而有效激活免疫應(yīng)答[12-14]。由于缺乏感染性核酸，無復(fù)制和感染能力，因此VLPs已經(jīng)成為亞單位疫苗的一種理想形式。相比于傳統(tǒng)滅活疫苗，VLP疫苗具有更好的免疫原性；而相對于弱毒疫苗，VLP疫苗則具有良好的安全性。此外，VLPs比常規(guī)的亞單位或者重組蛋白具有更好的免疫原性，能夠同時(shí)激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。與此同時(shí)，VLPs具有自體佐劑功效，無需添加佐劑即可刺激有效的免疫應(yīng)答[13，15]。目前，世界上已經(jīng)有4種VLP疫苗獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)，分別是乙肝疫苗、多價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗、H1N1流感病毒疫苗以及豬圓環(huán)病毒2型疫苗[13]。我國的戊型肝炎VLP疫苗也于2012年10月27日正式上市，由此顯示出VLPs作為疫苗的廣闊應(yīng)用前景。

流感病毒M1蛋白是形成病毒粒子的主要驅(qū)動力，而HA和NA是A型流感病毒的主要保護(hù)性蛋白，因此常見的流感VLPs通常包含M1、HA和/或NA蛋白[14]。到目前為止，組裝VLPs的系統(tǒng)主要有細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、植物和昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒等表達(dá)系統(tǒng)。其中，昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有生長快，可以大規(guī)模培養(yǎng)，翻譯后修飾功能與哺乳動物細(xì)胞類似，有利于VLPs的正確包裝，安全性好等優(yōu)勢，因而被廣泛用于VLPs的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。以昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備有囊膜的VLPs已經(jīng)成為當(dāng)前的主流技術(shù)[16]。在本研究，利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝出含有H3N8亞型EIV毒株的HA、NA和M1蛋白的VLPs，并且以VLPs作為免疫原免疫馬匹，以小鼠模型評價(jià)馬抗H3N8亞型EIV高免血清的預(yù)防和治療效果，以期為研制H3N8亞型馬流感VLP疫苗提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 重組桿狀病毒的制備與鑒定在Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞中制備A/equine/China/JL126/2018 (H3N8)(MW264992)病毒儲液。利用表1所列的基因特異性引物通過RT-PCR擴(kuò)增病毒的HA、NA和M1基因。然后，根據(jù)文獻(xiàn)[17]所報(bào)道的方法進(jìn)行重組桿狀病毒的制備。具體步驟簡述如下：將擴(kuò)增的基因與pFastBac1于25℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，分別提取HA、NA和M1重組穿梭質(zhì)粒。將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac，通過藍(lán)白斑篩選獲得3種重組桿粒。以2 μg的劑量將3種重組桿粒分別溶解于100 μL無血清昆蟲培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM(Gibco，USA)，加入8 μL X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，USA)，充分混勻后室溫放置20 min，然后緩緩滴加至70%貼壁率的Sf9細(xì)胞中，27℃培養(yǎng)4 d后，獲取第1代重組桿狀病毒，盲傳至第4代(p4)，將P4代桿狀病毒分別命名為rBV-HA、rBV-NA和rBV-M1。

表1 H3N8亞型EIV基因擴(kuò)增引物

將P1代重組桿狀病毒以1%濃度感染貼壁的Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72 h，顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。取P4代桿狀病毒感染后的細(xì)胞上清進(jìn)行Western blot分析，一抗采用本研究室制備的抗H3N8亞型EIV雞高免血清(1∶500)，4℃孵育過夜后加入HRP標(biāo)記的羊抗雞酶標(biāo)二抗(1∶5 000)，期間以PBST清洗3次，室溫孵育1 h后通過ECL顯色觀察。

1.2 VLPs的組裝與鑒定將rBV-HA、rBV-NA、rBV-M1分別以MOI=5同時(shí)接種2×106個(gè)/mL的Sf9懸浮細(xì)胞，于27℃ 120 r/min培養(yǎng)4 d。將收集的培養(yǎng)上清經(jīng)4℃ 3 500 r/min離心20 min以去除細(xì)胞及其碎片；上清經(jīng)4℃ 30 000 r/min離心1 h，棄上清，將沉淀用pH 7.2的PBS重懸并溶解過夜；將1 mL沉淀懸液加入至60%蔗糖與30%蔗糖的梯度中，24 000 r/min離心1.5 h，吸取白色云霧層經(jīng)去蔗糖處理后于-80℃保存?zhèn)溆?。取純化后的VLPs利用血凝試驗(yàn)[18]鑒定其血凝活性，并通過Western blot分析VLPs的蛋白組分[19]。同時(shí)，利用免疫電鏡觀察VLPs的形態(tài)特征。具體步驟為：將純化的VLPs滴置于封口膜表面，取銅網(wǎng)正面吸附樣品，靜置3 min，用濾紙從側(cè)面吸干后，以點(diǎn)滴方式在銅網(wǎng)表面加入1∶100稀釋倍數(shù)的雞高免血清，室溫孵育1 h后吸去溶液并用PBS清洗3次，每次5 min；以點(diǎn)滴方式在銅網(wǎng)表面加入1∶50稀釋倍數(shù)的膠體金標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，同樣吸去溶液后用PBS清洗1次，在80 kV，4萬倍視野下經(jīng)透射電鏡掃描觀察VLPs的形態(tài)特征。

1.3 馬高免血清的制備將VLPs稀釋后，按照佐劑∶VLPs=1∶2～1∶3的比例加入弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化以制備免疫原。選擇2匹4～6歲馬匹進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)免疫，共免疫5次，每次間隔7～14 d。第1，7，14，28和42天注射免疫原的劑量依次為0.5，1.5，2.0，3.0和5.0 mg/匹。當(dāng)HI抗體效價(jià)達(dá)1∶2 560以上時(shí)，按16 mL/kg采血，無菌制備高免血清。

1.4 馬高免血清的預(yù)防效果評價(jià)為了驗(yàn)證馬高免血清對H3N8亞型EIV的預(yù)防效果，將6～8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成7組，分別為病毒對照組、正常對照組、高劑量早期組、高劑量中期組、高劑量晚期組、中劑量組、低劑量組。高、中、低劑量預(yù)防組分別按0.4，0.2，0.1 mL/只經(jīng)小鼠腹腔注射高免血清進(jìn)行預(yù)防。其中，高劑量早期組在攻毒前8 d注射血清，高劑量中期組在攻毒前4 d注射血清，高劑量晚期以及中劑量、低劑量各組均在攻毒前1 d注射血清，全程僅注射1次。病毒對照組與正常對照組均在攻毒前1天腹腔注射無菌生理鹽水，0.2 mL/只。采用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉后以滴鼻方式進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為106TCID50。攻毒當(dāng)天記為第0天，攻毒后連續(xù)觀察14 d，每天記錄小鼠精神狀態(tài)、活動能力、體質(zhì)量變化等指標(biāo)。攻毒后第14天后測定小鼠肺指數(shù)。簡言之，每組小鼠在麻醉后被安樂死并稱重。采集其肺臟，經(jīng)PBS洗滌后，用濾紙吸干水分后稱重。根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法計(jì)算作為肺部水腫指標(biāo)的肺指數(shù)，其計(jì)算公式為：肺指數(shù)=(肺質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。將試驗(yàn)結(jié)果合并以GraphPad Prism v8.0.2.263統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 馬高免血清的治療效果評價(jià)為了評價(jià)馬高免血清對H3N8亞型EIV的治療效果，將6～8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成12組，分別為病毒對照組、正常對照組、高劑量早期組、高劑量中期組、高劑量晚期組、中劑量早期組、中劑量中期組、中劑量晚期組、低劑量早期組、低劑量中期組、低劑量晚期組及達(dá)菲治療組。除正常對照組外，每只小鼠攻毒劑量均為106TCID50，攻毒后開始治療。其中，早期組、中期組及晚期組分別在攻毒后24，48和72 h注射血清，高、中、低劑量治療組分別按0.8，0.4和0.2 mL/只注射血清，全程僅注射1次；達(dá)菲治療組在攻毒后24 h開始給藥，每天0.2 mg/只，連續(xù)給藥7 d；病毒對照組與正常對照組均在攻毒后24 h腹腔注射無菌生理鹽水，0.2 mL/只。攻毒當(dāng)天記為第0天。攻毒后第7天將采集的小鼠肺臟研磨后接種MDCK細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞上清利用血凝實(shí)驗(yàn)測定肺臟的病毒感染滴度。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒的鑒定將重組桿狀病毒rBV-HA、rBV-NA和rBV-M1分別感染Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72 h后，觀察細(xì)胞的病變情況。如圖1A可見，與正常細(xì)胞相比，感染重組桿狀病毒的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變大、變圓，增殖明顯變慢甚至不增殖，細(xì)胞發(fā)生脫落、裂解等病變現(xiàn)象。取重組桿狀病毒感染后的細(xì)胞上清經(jīng)Western blot鑒定分析目的蛋白的表達(dá)情況。如圖1B所示，HA、NA和M1蛋白條帶分別約為65，55和26 kDa，均與預(yù)期大小相符，說明所構(gòu)建的重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中有H3N8病毒蛋白的表達(dá)。

A.重組桿狀病毒感染后Sf9細(xì)胞病變效應(yīng)；B.重組桿狀病毒目的蛋白Western blot鑒定結(jié)果

2.2 VLPs的鑒定將rBV-HA、rBV-NA、rBV-M1分別以MOI=5接種懸浮Sf9細(xì)胞，于27℃ 120 r/min培養(yǎng)4 d。對收集的培養(yǎng)上清進(jìn)行超速離心純化，并利用血凝試驗(yàn)、Western blot和免疫透射電鏡分別鑒定VLPs的血凝活性、目的蛋白的表達(dá)情況以及VLPs的形態(tài)結(jié)構(gòu)。如圖2A所示，純化后的VLPs的血凝效價(jià)可達(dá)9log2，表明HA蛋白已經(jīng)展示于VLPs表面。Western blot所檢測到的HA、NA和M1蛋白條帶也均與預(yù)期大小相符，說明HA、NA和M1蛋白利用桿狀病毒表達(dá)后成功組裝成了VLPs(圖2B)。在透射電鏡下，可見VLPs形態(tài)為橢球形，直徑約為100 nm，且表面附有膠體金標(biāo)記的糖蛋白纖突(圖2C)。

A.VLPs血凝試驗(yàn)結(jié)果；B.VLPs中HA、NA、M1蛋白的Western blot鑒定結(jié)果；C.免疫電鏡下VLPs的形態(tài)

2.3 馬高免血清HI抗體滴度將VLPs免疫馬匹后，分別在免疫后第7，14，28，42和56天收集馬匹血清，利用血凝抑制試驗(yàn)測定血清中的HI抗體效價(jià)。由圖3可知，隨著免疫次數(shù)的增加，至免疫后第56天，HI抗體效價(jià)可達(dá)1∶2 560以上，達(dá)到了預(yù)期免疫效果。

圖3 H3N8 VLPs免疫馬匹后血清中HI抗體效價(jià)

2.4 馬高免血清對試驗(yàn)感染小鼠的預(yù)防效果評價(jià)為了鑒定所制備的馬高免血清抵御EIV感染的能力，在給小鼠注射不同劑量的高免血清后于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，通過觀察小鼠發(fā)病和肺臟指數(shù)來評價(jià)高免血清的預(yù)防效果。由表2結(jié)果可知，高劑量中期組、高劑量晚期組和中劑量組小鼠的發(fā)病率為0。病毒對照組在攻毒后第3天小鼠開始出現(xiàn)發(fā)病狀況，至攻毒后第5天病毒對照組小鼠全部發(fā)病。高劑量早期組和低劑量組小鼠分別在攻毒后第9和7天開始出現(xiàn)發(fā)病狀況。至攻毒后第14天，高劑量早期組有2只小鼠發(fā)病，低劑量組共有4只小鼠發(fā)病。

表2 血清預(yù)防試驗(yàn)各組小鼠病毒感染后不同時(shí)間的發(fā)病情況(發(fā)病數(shù)/動物總數(shù))

采集各組小鼠的肺臟進(jìn)行組間平均肺指數(shù)差異比較。由表3可知，各組小鼠的肺指數(shù)從大到小依次為病毒對照組>低劑量組>高劑量早期組>高劑量中期組>中劑量組>高劑量晚期組>正常對照組。將各試驗(yàn)組的肺指數(shù)與病毒對照組肺指數(shù)進(jìn)行兩兩方差分析，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)合血清預(yù)防組小鼠的發(fā)病狀況及其小鼠肺指數(shù)的組間差異，各試驗(yàn)組的預(yù)防效果依次為高劑量晚期組、中劑量組和高劑量中期組。

表3 血清預(yù)防試驗(yàn)各組小鼠肺指數(shù)

2.5 馬高免血清對試驗(yàn)感染小鼠的治療效果評價(jià)為了評價(jià)所制備的馬高免血清對EIV感染的治療效果，在給小鼠攻毒后于不同時(shí)間注射不同劑量的高免血清，攻毒后第7天將各組小鼠肺臟研磨后接種MDCK細(xì)胞以測定肺臟病毒感染滴度。由表4可知，低劑量晚期組小鼠的病毒檢出率為33.3%，平均病毒滴度為2.4log2，其他血清治療組的小鼠肺臟沒有引起細(xì)胞病變，而達(dá)菲治療組病毒檢出率為83.3%，平均病毒滴度為4.5log2。

表4 血清治療試驗(yàn)小鼠肺臟病毒檢出情況

3 討論

馬流感已經(jīng)成為威脅養(yǎng)馬業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最重要的傳染病之一[21]。疫苗接種是預(yù)控馬匹急性呼吸道感染的最有效方法，許多馬術(shù)當(dāng)局和進(jìn)口國都實(shí)施了對馬匹急性呼吸道傳染病的強(qiáng)制性疫苗接種[22]。目前，商業(yè)化的馬流感疫苗主要是傳統(tǒng)的滅活疫苗[23-25]和減毒疫苗[26-27]。但是，滅活疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與病毒自然感染誘導(dǎo)的應(yīng)答存在一定差異，這表明滅活疫苗的設(shè)計(jì)還需要改進(jìn)。雖然減毒疫苗在免疫后可以模擬自然感染，可以誘導(dǎo)體液、細(xì)胞和黏膜免疫反應(yīng)，達(dá)到優(yōu)異的保護(hù)效果，但是減毒疫苗存在安全性問題。此外，疫苗效力取決于疫苗種毒和流行毒株之間的抗原匹配性?？乖剖且呙缃臃N失敗的重要原因之一，解決這個(gè)問題的有效途徑就是要定期更新疫苗種毒。然而，流感疫苗的更新過程可能需要數(shù)年時(shí)間，并且成本較高。所以，選擇合適的疫苗類型是降低疫苗更新周期的考慮因素之一。目前，只有非復(fù)制性金絲雀痘病毒活載體重組馬流感疫苗可以及時(shí)更新[28]。但是，病毒載體疫苗也存在一些缺點(diǎn)，即載體對特異性免疫的干擾。因此，開發(fā)綠色、安全、高效、可以適時(shí)更新的疫苗是當(dāng)前疫苗研發(fā)的重要考慮要點(diǎn)。

鑒于VLPs具有和天然病毒相同的構(gòu)象，能夠通過和病毒感染同樣的途徑遞呈給免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生和病毒感染相同強(qiáng)度和類型的免疫保護(hù)反應(yīng)，使當(dāng)前VLPs的研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病疫苗制備[29]。本研究利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝出含有H3N8亞型EIV的HA、NA和M1蛋白的VLPs，經(jīng)電鏡觀察，所構(gòu)建的VLPs具有與天然病毒粒子相似的形態(tài)和大小，并且具有血凝活性。將純化VLPs免疫馬匹，獲得了馬源高免血清，并利用小鼠模型，探討了馬高免血清對H3N8馬流感的預(yù)防和治療效果。雖然由于給藥時(shí)間和劑量的不同，防治效果達(dá)不到100%，但是VLPs免疫馬高免血清確實(shí)起到了中和病毒的作用。這表明本研究所制備的H3N8 VLPs不僅具有良好的免疫原性，而且防治效果良好。因此，本研究充分說明了研制馬流感VLP疫苗是切實(shí)可行的。

然而，本研究還處于初步階段。首先，在制備馬高免血清過程中，本研究的免疫次數(shù)過于密集；其次，盡管弗氏佐劑能夠有效刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并增強(qiáng)輔助T細(xì)胞功能[30]，但是由于其副作用較大，不適合實(shí)際疫苗的開發(fā)；再者，用來制備VLPs的EIV毒株不屬于OIE推薦的兩個(gè)Florida EIV分支。今后，還需充分考慮這些因素。不過，已經(jīng)走上了開發(fā)馬流感VLP疫苗的正確道路。