短裸甲藻毒素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展*

吳惠娟 唐恒坤 楊敏儀 陳 睿 高燁宏 王榮智 汪世華

(1.生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

1 概述

由于生態(tài)環(huán)境的變化和人類(lèi)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的發(fā)展，全球范圍內(nèi)已記錄到的有害藻華(HABs)不斷增加。海洋中引起赤潮的藻類(lèi)多達(dá)3000多種，赤潮的發(fā)生危害生態(tài)系統(tǒng)和漁業(yè)經(jīng)濟(jì)，其特點(diǎn)是浮游植物快速增殖并產(chǎn)生大量代謝物質(zhì)，引起海水顏色的改變。目前，其形成機(jī)制尚不清楚，已有多項(xiàng)研究表明，水溫上升和過(guò)量養(yǎng)分是導(dǎo)致藻類(lèi)大量生長(zhǎng)的主要觸發(fā)因素[1]。

Brevetoxins (BTxs) 是一類(lèi)親脂性環(huán)狀聚醚神經(jīng)毒素，屬于一類(lèi)神經(jīng)性貝毒 (NSP)，目前發(fā)現(xiàn)了約70種衍生物。這類(lèi)毒素在貝類(lèi)中積累，主要以BTx-1 (A型) 和BTx-2 (B型)兩種形式存在[2]，過(guò)量攝入、皮膚接觸或氣溶膠吸入是最常見(jiàn)的中毒途徑[3-4]。接觸這類(lèi)毒素產(chǎn)生的癥狀通常在攝入后1～24h出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉、呼吸道刺激、流鼻涕、鼻子和喉嚨的燒灼感、支氣管收縮、感覺(jué)異常、頭暈、失去協(xié)調(diào)、抽筋、癱瘓等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致昏迷，但是目前還沒(méi)有可用的解毒劑[5]。已有研究表明，高濃度的毒素可能會(huì)在以浮游植物為食的其他海洋生物中積聚，并逐級(jí)傳遞到人類(lèi)身上；也有研究檢測(cè)了海水[2-3]、空氣[6-7]及其他生物體中毒素含量，揭示了其對(duì)呼吸道的刺激作用。BTxs的作用機(jī)制是通過(guò)特異性結(jié)合電壓門(mén)控Na+通道的第5位點(diǎn)，導(dǎo)致通道被持續(xù)激活，大量Na+流入使神經(jīng)元和肌肉膜去極化[8]。吸入BTxs后的癥狀會(huì)在接觸后幾分鐘到幾小時(shí) (<24h) 開(kāi)始出現(xiàn)，持續(xù)2～3天[9]。另外，還有研究指出這類(lèi)毒素可能會(huì)誘導(dǎo)DNA損傷和造成染色體畸變[10]。

產(chǎn)生此類(lèi)毒素的藻類(lèi)所引起的赤潮常在美國(guó)弗羅里達(dá)洲和墨西哥灣爆發(fā)，且近幾年報(bào)道了許多生物因BTxs中毒的事件，例如海龜[11]、綠樹(shù)蛙[12]、石蟹[13]、海豚[14]和燕鷗[15]，在歐洲其他國(guó)家和中國(guó)海岸也有檢測(cè)到此類(lèi)毒素。本文主要關(guān)注BTxs的研究現(xiàn)狀、BTxs檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和BTxs檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。

2 BTxs研究現(xiàn)狀及熱點(diǎn)

近幾年報(bào)道了多種生物死亡、擱淺的現(xiàn)象，如海龜、綠樹(shù)蛙、石蟹、海豚和燕鷗等均檢測(cè)出BTxs。還有報(bào)道提出在赤潮泛濫的沿海地區(qū)，BTxs可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]和急性發(fā)作性血管性水腫[17]有關(guān)。在澳大利亞、新西蘭和日本也有相似報(bào)道[18]。近幾年研究主要關(guān)注各種生物體BTxs的檢測(cè)和方法創(chuàng)新，以及在自然條件和實(shí)驗(yàn)室條件下成年蛤蜊在繁殖期間受BTxs的影響[19]，以及對(duì)其后代產(chǎn)生的影響。此外，還有少部分研究者關(guān)注BTxs分子對(duì)離子通道的相互作用研究[20-21]、毒素分子的代謝組學(xué)和其他組學(xué)的應(yīng)用[22-23]。有趣的是，基于BTxs暴露于神經(jīng)元的神經(jīng)再生特性，相關(guān)研究對(duì)于中風(fēng)的治療具有重要意義。雖然暴露于環(huán)境中天然存在的BTxs對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)具有強(qiáng)效炎癥效應(yīng)[24]，但是其為模擬中風(fēng)的活動(dòng)依賴性恢復(fù)[25]研究提供了理論依據(jù)。

3 BTxs檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

美國(guó)(東海岸、墨西哥灣)和新西蘭已經(jīng)制定了監(jiān)管限制，可接受的BTxs水平在活的和生的雙殼貝類(lèi)的食品法典標(biāo)準(zhǔn)為200個(gè)小鼠單位(MU)/kg[26]，或0.8 mg BTx-2當(dāng)量/kg總貝類(lèi)肉[27-28]。在歐洲，目前管制四組親脂性毒素：岡田軟海綿酸、果膠毒素、yessotoxins和氮雜螺環(huán)酸[28]。2018年，在科西嘉島(地中海)的法國(guó)貝類(lèi)中首次檢測(cè)到BTxs，同年，為監(jiān)測(cè)新出現(xiàn)的毒素，如環(huán)狀亞胺、卵毒素和BTxs等，法國(guó)海岸建立了一個(gè)名為EMERGTOX的監(jiān)測(cè)計(jì)劃。為了保護(hù)消費(fèi)者的健康，我國(guó)針對(duì)發(fā)現(xiàn)的主要海洋毒素建立了一套海產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國(guó)已經(jīng)建立了多溴二苯甲醚的分析方法，并將其應(yīng)用于雙殼類(lèi)、海水、浮游植物和沉積物樣品中的毒素檢測(cè)。

4 BTxs檢測(cè)方法研究進(jìn)展

到目前為止，BTxs檢測(cè)的方法有小鼠生物測(cè)定(MBA)、受體結(jié)合測(cè)定、ELISA法、電化學(xué)測(cè)定和LC-MS[33-34]等。

4.1 MBA法

自2013年以來(lái)，歐盟國(guó)家對(duì)于親脂性毒素的檢測(cè)均采用MBA衡量某類(lèi)物質(zhì)對(duì)于生物體的毒性[9]，通過(guò)乙醚從貝類(lèi)研磨物中提取毒素，并給小鼠注射，觀察小鼠反應(yīng)。這種測(cè)定方法在貝類(lèi)養(yǎng)殖場(chǎng)和市場(chǎng)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中應(yīng)用廣泛，對(duì)于進(jìn)一步確認(rèn)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能和確定監(jiān)管毒性水平是十分必要的。

4.2 受體結(jié)合測(cè)定

受體結(jié)合法基于毒素分子與離子通道的相互作用，BTxs與Na+特異結(jié)合。Mccall等[31]開(kāi)發(fā)了一種基于大鼠腦突觸體作為受體和BTx-2作為BTx類(lèi)似物的熒光探針的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。此外，Murata等[32]開(kāi)發(fā)了基于大鼠腦突觸體和吖啶-BTx-2的化學(xué)發(fā)光受體結(jié)合試驗(yàn)，檢測(cè)限為1.4 amol。然而，突觸體不穩(wěn)定，需要在-80°C下儲(chǔ)存，并且該測(cè)定是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程。小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞毒性試驗(yàn) (N2a-assay) 是一種靈敏、高通量的體外檢測(cè)方法，可有效檢測(cè)Na+通道特異性海洋生物毒素。Loeffler等[33]通過(guò)添加藥物哇巴因和藜蘆定來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)激活Na+通道的化合物的測(cè)定。然而，添加的藥物可能對(duì)N2a細(xì)胞有毒，并且它們?cè)跐舛炔蛔慊蜻^(guò)高的情況下應(yīng)用會(huì)降低該測(cè)定法對(duì)海洋毒素檢測(cè)的有效性。Viallon等[34]評(píng)估了N2a-assay的6個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞接種密度、生長(zhǎng)26小時(shí)后的細(xì)胞層活力、噻唑藍(lán)孵育時(shí)間、哇巴因和藜蘆苷處理以及溶劑和基質(zhì)效應(yīng)，確定了用于驗(yàn)證N2a-assay的五個(gè)可行性控制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)BTx-3的特異性檢測(cè)。該方法雖然靈敏度很高，但產(chǎn)生的結(jié)果波動(dòng)相對(duì)較大且需要18～24h才能完成。Caglayan等[35]基于適配體的檢測(cè)方法用于BTxs檢測(cè)，該法在水溶液中的檢測(cè)限分別為1.48 nM和0.80 nM。

4.3 ELISA法

ELISA法具備高特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，在海產(chǎn)品進(jìn)出口檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。Ling等[36]以BTx-1為靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)了具備高特異性、檢測(cè)限為200 ng/mL的膠體金試紙條。近幾年，研究者主要采用ELISA和LC-MS檢測(cè)方法，更側(cè)重于試劑盒的適用性評(píng)估、LC-MS的檢測(cè)優(yōu)化以及其他方法的優(yōu)化改良。比如Cunningham等[37]通過(guò)采集血液樣本評(píng)估市售最初用于定量海水和貝類(lèi)組織提取物中的BTx-3的ELISA(多克隆抗體)試劑盒，表明該試劑盒可準(zhǔn)確定量人血漿中0.0400～2.00 ng/mL的BTx-3，但對(duì)其他常見(jiàn)BTx類(lèi)似物具有不同的交叉反應(yīng)性，因此仍需要通過(guò)更有針對(duì)性的方法進(jìn)行鑒定(如LC-MS)。

4.4 電化學(xué)檢測(cè)

傳統(tǒng)的ELISA法具有局限性，而電化學(xué)方法具有高靈敏度、低成本、低功耗和高度兼容的特點(diǎn)，適用于小型傳感器和自動(dòng)檢測(cè)。研究者多采用在免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)，結(jié)合電化學(xué)方法放大信號(hào)的策略。Zhang等[38]在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的基礎(chǔ)上，使用可區(qū)分的金屬納米簇標(biāo)記分子，設(shè)計(jì)了一種新的超靈敏多重免疫測(cè)定方案，檢測(cè)限為1.8pg/mL。這種方法與傳統(tǒng)電化學(xué)標(biāo)記相比，可以產(chǎn)生非常靈敏特定的信號(hào)；相對(duì)于傳統(tǒng)的酶標(biāo)方法，金屬納米團(tuán)簇顯得簡(jiǎn)單且通用，不僅不需要酶底物，而且減少了對(duì)分析物的污染。Zhang等[39]利用聚苯乙烯微球與二氧化硅納米容器中的特定抗體結(jié)合，通過(guò)伏安法檢測(cè)納米容器內(nèi)的亞甲藍(lán)釋放量進(jìn)行快速檢測(cè)，其檢測(cè)限為6 pg/mL。Zhang等[40]建立了較常規(guī)方法更靈敏、抗體用量更少、更快速的基于毛細(xì)管電泳的免疫檢測(cè)方法(CE-IA)，檢測(cè)限為100pg/mL，是分析貝類(lèi)樣品中BTxs的有力工具。Tang等[41]基于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理，建立了一種檢測(cè)限為0.6pg/mL，基于新型石英晶體微天平(QCM)的免疫傳感策略。通過(guò)苯氧基官能化葡聚糖(DexP)組裝到石墨烯包被的QCM探針的表面上，然后通過(guò)葡聚糖結(jié)合刀豆蛋白A(ConA)標(biāo)記的小鼠單克隆抗BTx-2抗體并固定在DexP修飾的探針上，以葡萄糖淀粉酶和牛血清白蛋白-BTx-2(BTx-2-BSA)偶聯(lián)物高度官能化的金納米顆粒作為標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)。Eissa等[42]通過(guò)體外選擇高親和力DNA適配體并使用熒光和電化學(xué)阻抗譜(EIS)監(jiān)測(cè)BTx-2與適配體的結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種基于心肌細(xì)胞的便攜式生物傳感器，可以提供一種無(wú)標(biāo)記且方便的方式來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)電活動(dòng)，大大縮短了海洋毒素的檢測(cè)時(shí)間。這種適配體BT10用于構(gòu)建BTx-2的無(wú)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)性阻抗生物傳感器，檢測(cè)限為106pg/mL。

4.5 質(zhì)譜檢測(cè)

液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)結(jié)合了液相色譜的分離能力、三重四極桿質(zhì)譜的高靈敏度和選擇性質(zhì)量分析能力，具備高度的靈敏性和特異性，成為測(cè)定和定量BTxs的寶貴工具。Shin等[43]為BTx-1、BTx-2和BTx-3毒素開(kāi)發(fā)了LC-MS/MS，定量限為25μg/kg。同樣，Wunschel等[44]針對(duì)包含BTx的多種毒素開(kāi)發(fā)了一種電噴霧LC-MS/MS系統(tǒng)，每種毒素的檢測(cè)限為2.5 μg/kg。Dom等[45]建立了一個(gè)高分辨率LC-MS系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)貽貝和牡蠣中的14種毒素。然而，ELISA法或LC-MS/MS方法受到多個(gè)因素的影響，需要聯(lián)合其他現(xiàn)代技術(shù)。液相色譜—高分辨率質(zhì)譜具有高精度和高分辨率，該技術(shù)在未知化合物的發(fā)現(xiàn)和鑒定中發(fā)揮著重要作用。已有研究報(bào)道了一種快速、靈敏、可用于定量?jī)煞N雙殼貝類(lèi)基質(zhì)中的八種環(huán)亞胺和兩種BTxs類(lèi)似物的超高液相色譜—MS/MS(UHPLC-MS/MS)方法[46]。為分析環(huán)境樣品、海洋生物和水中的毒素，Onofrio等[47]開(kāi)發(fā)了兩種方法來(lái)篩選13種毒素，使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)到特定的毒素。捕集器和柱內(nèi)稀釋(ACD)技術(shù)的聯(lián)合使用具備提高檢測(cè)限、實(shí)現(xiàn)多種毒素組的共同檢測(cè)、可注入100%有機(jī)溶劑樣品、確保分析物穩(wěn)定性并消除繁雜的樣品制備步驟，進(jìn)樣體積可達(dá)1mL，從而使分析物的檢測(cè)限在0.001～0.05μg/L之間的優(yōu)點(diǎn)。液相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜 (LC-ToF-MS) 是一種常見(jiàn)的液相色譜—高分辨率質(zhì)譜類(lèi)型。液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(LC-QqQ-MS/MS)靈敏度高，有利于準(zhǔn)確檢測(cè)海洋環(huán)境中低濃度的目標(biāo)化合物。已有研究通過(guò)建立一種基于二者結(jié)合的改進(jìn)方法[48]，用于分析K.brevis產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外BTxs代謝物。該方法可用于快速鑒定和進(jìn)一步測(cè)定在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的不同生長(zhǎng)階段K.brevis的BTxs代謝物的產(chǎn)生。LC-ToF-MS和LC-QqQ-MS/MS技術(shù)相輔相成，可以對(duì)不同環(huán)境條件樣品中BTxs代謝物譜進(jìn)行全面篩選和準(zhǔn)確鑒定。

5 研究展望

如前所述，研究人員均采取ELISA法初步檢測(cè)和LC-MS/MS鑒定化合物的方法評(píng)估毒素含量。MBA法能真實(shí)反映毒素分子毒性，目前仍是許多國(guó)家進(jìn)行貝類(lèi)產(chǎn)品檢測(cè)的選擇；N2a-assay檢測(cè)基于受體特異而非毒素分子特異，因而應(yīng)用受到了限制；質(zhì)譜串聯(lián)檢測(cè)能精確鑒定毒素分子但僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)用；電化學(xué)傳感器和ELISA方法的結(jié)合應(yīng)用正在進(jìn)行大量的研究。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，采取先使用免疫測(cè)定法檢測(cè)廣泛的BTxs，然后進(jìn)行色譜確認(rèn)的檢測(cè)策略可以加快鑒定流程，然而采用此種策略對(duì)于市場(chǎng)售賣(mài)的ELISA試劑盒的精確度和特異性提出了更高要求。雖然研究者提出了許多檢測(cè)策略，但是目前還沒(méi)有統(tǒng)一、高效的BTxs檢測(cè)方法。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和大量新的、對(duì)人體有害的毒素的發(fā)現(xiàn)，僅依賴于事先確立的毒素目標(biāo)清單進(jìn)行檢測(cè)的策略已不適用。在我國(guó)，檢測(cè)也僅限于在名錄內(nèi)的毒素，對(duì)于非名錄毒素的檢測(cè)缺乏有效的檢測(cè)手段。因此，進(jìn)一步構(gòu)建一個(gè)對(duì)于BTxs和NSP的動(dòng)態(tài)預(yù)防監(jiān)測(cè)體系將有利于檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)新的毒素，為后期采取及時(shí)而有效的應(yīng)對(duì)措施提供技術(shù)支持。