靈芝深層液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件與營養(yǎng)條件優(yōu)化

＊邢源月 王佳琦 黃紅梅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南 410000 2.長春白求恩制藥有限公司 吉林 130000）

靈芝學(xué)名Ganoderma lucidum，又被稱為靈芝草、靈仙草。靈芝是著名的藥用真菌，兩千多年來作為中草藥和功能性食品在我國及其他亞洲國家被廣泛使用。近幾十年來，靈芝子實(shí)體中的生物活性化合物一直備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，這些與藥理作用相關(guān)的活性物質(zhì)包括多糖類、三萜類、甾醇類、蛋白類及肽類。國內(nèi)外研究學(xué)者們已證實(shí)靈芝多糖是最主要的活性物質(zhì)，靈芝多糖具有多種生理功能，包括抗氧化、抗菌、抗癌、抗衰老、消炎、保護(hù)心臟和調(diào)節(jié)免疫等。

前期研究中，以酵母菌和乳酸菌對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，可獲得具有美白功效和抗氧化活性的靈芝發(fā)酵液。據(jù)張璐等研究，控制靈芝發(fā)酵過程中的營養(yǎng)條件可顯著提高靈芝多糖的產(chǎn)量、抗氧化活性和抑菌活性。靈芝深層發(fā)酵技術(shù)相較于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)栽培具有多種優(yōu)勢(shì)：縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量及可控的產(chǎn)品質(zhì)量。因此，基于液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝中功能活性物質(zhì)已成為研究熱點(diǎn)。

本研究以靈芝為主要材料，探究發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)條件pH、溫度、轉(zhuǎn)速、通氣比和營養(yǎng)條件碳源、氮源對(duì)靈芝子實(shí)體生長情況及多糖產(chǎn)量的影響，并通過中試實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，以期為靈芝液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株為多孔菌科四川靈芝。

①主要實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、麥芽糖、乳糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、硫酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅均為（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），分析級(jí)；葡萄糖（廊坊盛泰藥業(yè)有限公司），工業(yè)級(jí)，蛋白胨（福建三和生物科技有限公司），工業(yè)級(jí)。

②主要實(shí)驗(yàn)儀器

HZQ-Q型全溫振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；BLBIO-3GC-4 3L四聯(lián)磁力攪拌發(fā)酵罐（連云港百侖生物反應(yīng)器科技有限公司）；100L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）；1000L發(fā)酵罐（長春市液壓換熱設(shè)備制造廠）；BAY70/800型板框壓濾機(jī)（吉林市眾誠分離機(jī)械制造有限公司）ZZNG-1000真空濃縮裝置（長春制藥機(jī)械廠）。

③培養(yǎng)基配方

A.固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，瓊脂24g，水1000ml。

B.液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g，蛋白胨5g，酵母浸粉2g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂1g，硫酸銨2g，水1000ml，pH值6.0。

C.發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖48g，蛋白胨3.6g，磷酸二氫鉀0.36g，維生素B120mg，氯化鈉0.6g，聚醚消泡劑0.4g，水1000ml，自然pH值。

(2)試驗(yàn)方法

①液體發(fā)酵培養(yǎng)方法

未經(jīng)優(yōu)化前的初始發(fā)酵條件為用C中的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌30min，按0.75%的接種量轉(zhuǎn)接二級(jí)搖瓶菌種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度在28℃，自然pH值，攪拌轉(zhuǎn)速50rmp，通氣比2，中途補(bǔ)料一次（補(bǔ)料培養(yǎng)基同優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基），培養(yǎng)至168h發(fā)酵結(jié)束。

用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨4g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂1g，硫酸銨2g，水1000ml，pH值6.0。經(jīng)121℃滅菌30min，按5%的接種量轉(zhuǎn)接二級(jí)搖瓶菌種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度在28±2℃，pH值自然，攪拌轉(zhuǎn)速150rmp，通氣比2，中途補(bǔ)料一次（補(bǔ)料培養(yǎng)基同優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基），培養(yǎng)至168h發(fā)酵結(jié)束。

②發(fā)酵液粗多糖的提取與測(cè)定

粗多糖提取參考張璐等的方法加以優(yōu)化。板框機(jī)經(jīng)濾布過濾分離菌絲體與發(fā)酵液，將發(fā)酵液真空懸蒸，用比重計(jì)判斷，濃縮至密度1.30以上（1.33～1.38），濃縮的倍數(shù)約為15～20倍?？偺呛繙y(cè)定：取濃縮后靈芝浸膏約1g，精密稱定至錐形瓶中，加入4N硫酸20ml，置于沸水浴中加熱水解7min，冷卻，用40%氫氧化鈉液調(diào)至中性，移入200ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1ml，置錐形瓶中，加入斐林試液甲、乙各5ml，混勻，用滴定管滴加入0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（不得過量），加熱至沸騰，繼續(xù)滴加葡萄糖液至溶液呈淺黃色，同時(shí)做空白對(duì)照；還原糖含量測(cè)定：取濃縮靈芝浸膏約1g，精密稱定至200ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，以下操作同總糖測(cè)定。多糖含量=總糖含量-還原糖含量。（標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定本品中多糖含量不得低于7%；斐林試液甲：硫酸銅15g，亞甲基藍(lán)0.05g，溶于1000ml；斐林試液乙：酒石酸鉀鈉50g，氫氧化鈉54g，亞鐵氰化鉀4g，溶于1000ml）。

2.數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS（PASW Statistics 18）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析采用進(jìn)行單因素方差分析，通過Ducan方差分析事后檢驗(yàn)判斷差異顯著性（P＜0.05）?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)3因素正交試驗(yàn)。

3.結(jié)果與討論

(1)靈芝液體深層發(fā)酵優(yōu)化

①靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖1可知不同發(fā)酵pH、溫度轉(zhuǎn)速和通氣比對(duì)多糖產(chǎn)量和菌絲干重具有顯著影響。弱酸性環(huán)境pH=6.0時(shí)發(fā)酵效果最佳，多糖含量達(dá)8.03±0.11%，菌絲干重為14.33±0.15g/100mL，pH高于或低于6.0值多糖含量和菌絲干重菌菌降低，尤其在堿性條件下（pH=8.0），菌絲干重和多糖含量迅速降低。如圖1(B)所示，靈芝發(fā)酵最適溫度為28℃，多糖產(chǎn)量最高，為（8.73±0.11%），在20～25℃時(shí)和30～32℃時(shí)，菌絲干重分別降低19.43%～32.03%和43.49%～61.43%，高溫對(duì)靈芝發(fā)酵產(chǎn)多糖影響較大，在發(fā)酵過程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵罐溫度，尤其避免溫度過高導(dǎo)致產(chǎn)量降低。攪拌轉(zhuǎn)速和通氣比影響發(fā)酵液中氧氣含量和分布，如圖1(C)(D)所示，不同轉(zhuǎn)速和通氣比對(duì)靈芝產(chǎn)多糖含量有影響，但與pH和溫度條件相比影響效果較低。攪拌速度低于150rpm時(shí)，底物與氧氣接觸不充分，菌絲形成較少，而過高轉(zhuǎn)速（200rpm）同樣給菌絲形成帶來負(fù)面影響，選擇150rpm既能保證氧氣均勻分布又不引起劇烈晃動(dòng)，適于菌絲形成圖1(C)；如圖1(D)所示，通氣量越高越利于菌絲發(fā)酵，當(dāng)通氣比為1:2時(shí)，菌絲干重13.97±0.11g/100mL，多糖含量高達(dá)7.47±0.06%。

圖1 不同初始pH、發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及通氣比條件下對(duì)靈芝發(fā)酵液多糖含量和菌絲干重的影響

②靈芝液體深層發(fā)酵營養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖2(A)可知，不同碳源對(duì)靈芝發(fā)酵液產(chǎn)多糖量影響有一定差異，但多糖含量在6.16%～7.87%，差異較小。以麥芽糖為碳源的發(fā)酵液胞外多糖產(chǎn)量最大，其次為赤砂糖和葡萄糖。雖然以葡萄糖作為培養(yǎng)基所產(chǎn)靈芝多糖略低于赤砂糖和麥芽糖，由于葡萄糖具有價(jià)格低、成分簡單，可被微生物快速利用有利于提高發(fā)酵效率，因此，選擇葡萄糖作為發(fā)酵液的碳源。如圖2(B)所示，不同氮源決定靈芝多糖產(chǎn)量，其中，以牛肉膏為氮源的發(fā)酵液胞外多糖產(chǎn)量最高，其次為蛋白胨，考綜合經(jīng)濟(jì)方面考量，選用蛋白胨為發(fā)酵液氮源。如圖2(C)(D)所示，探究不同濃度的葡萄糖濃度和蛋白胨濃度對(duì)多糖含量影響，結(jié)果顯示，2%～10%濃度的葡萄糖，濃度越高發(fā)酵液多糖產(chǎn)量越低；蛋白胨濃度在0.4%時(shí)多糖產(chǎn)量最高，高于或低于此濃度，多糖產(chǎn)量均減少。③轉(zhuǎn)種時(shí)間優(yōu)化

圖2 碳源、氮源、葡萄糖濃度和蛋白胨濃度對(duì)靈芝液態(tài)發(fā)酵液的影響

在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前，需先將靈芝菌在搖瓶內(nèi)生長壯大后才能進(jìn)行后續(xù)的中試放大，所以對(duì)于靈芝菌在搖瓶內(nèi)的定植時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如下表1和圖3所示。從生長曲線可以直觀看出，若種子搖瓶按10%接種量，在18～48h內(nèi)，菌體干重增長迅速，說明細(xì)胞快速增殖，是靈芝菌的對(duì)數(shù)生長階段，即此階段的靈芝菌生長最旺盛，菌絲活力最強(qiáng)，故24～36h為最佳轉(zhuǎn)種時(shí)機(jī)；在48～72h，菌體干重幾乎保持不變，說明細(xì)胞的生長代謝平衡，不再增長，此階段是靈芝菌菌生長的平穩(wěn)期，此時(shí)用嗅覺可聞到搖瓶開始產(chǎn)生酸味兒，圖中顯示pH值從初始狀態(tài)的5.12下降至3.75，這與48h后能聞到酸味兒現(xiàn)象一致；在72h之后，菌體干重有所下降，說明細(xì)胞的生長代謝減慢，這時(shí)候靈芝菌進(jìn)入衰亡期，此階段表現(xiàn)為靈芝菌絲細(xì)胞空心化，細(xì)胞會(huì)逐步降解，菌體干重下降，并釋放細(xì)胞內(nèi)堿性物質(zhì)使其pH略有升高。綜上說述，靈芝菌經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)選取24～36h為最佳轉(zhuǎn)種時(shí)機(jī)，將靈芝菌接種至發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。

表1 靈芝菌搖瓶定植時(shí)間優(yōu)化

圖3 靈芝菌搖瓶生長曲線

④正交試驗(yàn)優(yōu)化靈芝液體深層發(fā)酵

由①和②單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定培養(yǎng)條件和各成分之間對(duì)靈芝產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量較大影響的是pH6.0、2.0%葡萄糖、0.4%蛋白胨。根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以這三個(gè)因素為自變量，以獲得較高靈芝浸膏多糖產(chǎn)量，9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)給出的結(jié)果見表2所示。從表中可見，對(duì)靈芝浸膏多糖含量的影響因素重要性依次為：葡萄糖濃度(A)＞pH值(C)＞蛋白胨濃度(B)，靈芝浸膏多糖含量隨菌絲干重增大而增加。當(dāng)培養(yǎng)基組成為A1B2C2中葡萄糖添加量為2%，蛋白胨添加量為0.4%，pH為6.0時(shí)，多糖含量為11.2%，菌絲干重16.5g，此時(shí)多糖含量最高，因此A1B2C2組合為最優(yōu)條件組合。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

(2)中試生產(chǎn)驗(yàn)證深層培養(yǎng)靈芝菌的發(fā)酵工藝條件

中試生產(chǎn)是小試與工業(yè)化應(yīng)用的必經(jīng)之路，也是研究結(jié)果轉(zhuǎn)化的重要橋梁。中試目的是為達(dá)到小試的成果及各項(xiàng)指標(biāo)，驗(yàn)證小試提供的加工條件與原料等方面是否適合工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)3.1小試篩選出的最佳生產(chǎn)條件，進(jìn)行了三次獨(dú)立重復(fù)的中試實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見表3。三次中試結(jié)果顯示靈芝浸膏中多糖含量在10.1%～11.6%之間，菌絲干重為13.6～15.5g/100mL，該結(jié)果與小試產(chǎn)品無顯著性差異，驗(yàn)證了工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，可直接運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表3 中試生產(chǎn)試驗(yàn)條件及結(jié)果

4.結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了培養(yǎng)條件及營養(yǎng)條件，再經(jīng)過3因素優(yōu)化得到靈芝深層發(fā)酵產(chǎn)多糖的最佳條件為溫度28℃，pH值6.0，轉(zhuǎn)速150rpm，通氣比為2，葡萄糖含量2%，蛋白胨含量0.4%，培養(yǎng)時(shí)間168h。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過1t的中試實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證，未經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件發(fā)酵浸膏多糖含量為3.6%～4.2%，優(yōu)化后的多糖得率可達(dá)10.1%～10.6%，較未經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件的發(fā)酵多糖得率提高6%。