肝素結(jié)合性表皮生長因子在糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化中的作用

張芬 吳杰 董揚

糖尿病是全球患病率和死亡率最高的疾病之一，并且呈逐年上升趨勢[1-2]。我國約有1.096 億成年人患有糖尿病[3]。糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是指糖尿病患者在長期高糖環(huán)境下出現(xiàn)心臟微血管、大血管以及自主神經(jīng)病變而引發(fā)的一種心臟病，會誘發(fā)心肌結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致心肌細胞排列紊亂、壞死，從而引起心肌纖維化、心室壁增厚，收縮舒張功能障礙等改變[4-6]，是糖尿病導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。肝素結(jié)合性表皮生長因子（heparin binding epidermal growth factor，HB-EGF）是表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）家族的成員之一[7]。大鼠和人HB-EGF 基因位于第1 號和第5 號染色體[8]。HB-EGF 是纖維母細胞、血管平滑肌細胞以及角化細胞的有絲分裂原，并涉及許多病理生理過程，包括傷口愈合、心臟肥大、平滑肌細胞增生、肺動脈高壓等[9-11]。本實驗通過經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）及高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠DCM 模型，探討HB-EGF 在DCM 心肌纖維化中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 選擇8 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠20 只，體重（300±40）g，購于浙江省實驗動物中心，動物飼養(yǎng)于SPF 級動物房。所有動物經(jīng)過金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院實驗動物關(guān)愛和使用委員會批準，并嚴格執(zhí)行實驗動物倫理條例。STZ、檸檬酸、檸檬酸三鈉購于武漢晶美公司，二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑、免疫組化鼠兔通用二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Cocktail 蛋白酶抑制劑為美國Selleck 公司產(chǎn)品，聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品，預(yù)制膠、蛋白凝膠電泳試劑及緩沖劑（10×sample reducing agent、4×loading buffer）為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品，磷酸鹽牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）為美國Biorad 公司產(chǎn)品，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜為美國Millipore 公司產(chǎn)品，RIPA 蛋白裂解液為中國碧云天公司產(chǎn)品，HB-EGF 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品，HB-EGF 抗體（批號：ab185555）為美國Abcam 公司產(chǎn)品，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為杭州達文生物公司產(chǎn)品，Trizol試劑為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水為德國QIAGEN 公司產(chǎn)品,TaKaRaPrimeScriptTMRT 試劑盒為日本TAKARA 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DCM 大鼠模型建立 將20 只8 周齡健康SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為DCM 組和對照組，每組各10 只。DCM 組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至第6 周，經(jīng)腹腔注射1%STZ 溶液40 mg/kg，72 h 后測量餐后2 h 末梢血糖，血糖≥16.8 mmol/L 判定為2 型糖尿病；若血糖未達標，則1 周內(nèi)繼續(xù)檢測2 次餐后2 h 末梢血糖，如仍＜16.8 mmol/L 則予以剔除。DCM 組繼續(xù)以高脂高糖飼料喂養(yǎng)至14 周。對照組以相同體積經(jīng)腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液（由0.1 mol/L檸檬酸母液和0.1 mol/L 檸檬酸三鈉母液混合配制，1∶1.32，pH 為4.2），以普通飼料喂養(yǎng)。分別在實驗第8、12、14 周每組各處死1 只大鼠，觀察大鼠左心室大小及心肌纖維化演變情況，第14 周心臟超聲檢查提示左心室擴大，病理提示心肌纖維化認為DCM造模成功，14 周后處死其他大鼠觀察各項實驗指標。

1.2.2 大鼠血糖及體重檢測 實驗期間（第7～14周），所有大鼠均測定餐后2 h 末梢血糖，2 次/周，稱量清晨空腹體重。

1.2.3 大鼠心臟超聲檢查 予大鼠吸入2%異氟醚和氧氣麻醉，仰臥位固定，左心前區(qū)備皮，經(jīng)胸骨旁左心室長軸切面及左心室乳頭肌短軸切面進行超聲檢查并采集圖像，取4～6 個心動周期數(shù)據(jù)計算平均值，所有檢查由超聲醫(yī)師完成。測量參數(shù)包括：左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESd）、左心室舒張末期內(nèi)徑（1eft ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）?？紤]到體重大小對心腔大小的影響，本研究對左心室內(nèi)徑進行校正，計算方法：左心室收縮末期內(nèi)徑指數(shù)（LVESd index）=LVESd/ 體重，左心室舒張末期內(nèi)徑指數(shù)（LVEDd index）=LVEDd/體重。

1.2.4 大鼠心肌組織活檢 處死大鼠后，快速取出心臟組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，吸干并稱重。沿垂直于心臟長軸方向切開心臟，取一小部分于福爾馬林中固定24 h 后，脫水、包埋并切片至厚度3 mm 備用。HE 染色或Masson 染色后顯微鏡下觀察大鼠心肌組織。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法及酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測HB-EGF 蛋白表達 取心肌組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組蛋白進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入HB-EGF 一抗和內(nèi)參GAPDH以及辣根過氧化物酶標記的二抗，曝光后洗片，計算光密度，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值作為相應(yīng)目的蛋白的表達量。留取血液標本，根據(jù)操作流程加入標準品或樣本到對應(yīng)的微孔中，加入HB-EGF 酶標物，最后加入HB-EGF 試劑，反應(yīng)時間結(jié)束，加入終止液檢測。將一部分心肌組織剪成約3 mm×3 mm 大小的組織塊，保存于液氮中，采用蛋白質(zhì)印跡法提取蛋白，電泳后截取相應(yīng)條帶，檢測HB-EGF 蛋白的表達，選取GAPDH 作為內(nèi)參；留取血液標本，采用人HB-EGF 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測血漿HB-EGF 水平。

1.2.6 大鼠心肌HB-EGF mRNA 水平測定 將冰凍心肌標本切取約0.2 cm 大小，研磨后，采用Trizol試劑常規(guī)提取RNA。以1 ml Trizol 試劑裂解，吹打混勻，靜置離心，干燥，加入適量DEPC 水，溶解RNA 沉淀。利用TaKaRaPrimeScriptTMRT 試劑盒進行RNA 逆轉(zhuǎn)錄（RT）和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），HBEGF 特異性上下游引物序列為：HBEGF-fwd：5'-CTGTCTTCGGTCTGCCTCCTT-3'，HBEGF-rev：5'-AGACCGAAGACAGCACCAC-3'。95℃預(yù)變性30 s；95 ℃，5 s；55 ℃，30 s；72 ℃，34 s。擴增40 個循環(huán)。選取GAPDH 作為內(nèi)參，比較HB-EGF mRNA 與GADPH mRNA 相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 DCM 組大鼠中，1 只大鼠因基礎(chǔ)條件差導(dǎo)致死亡而剔除，其余大鼠均出現(xiàn)糖尿病癥狀，第14 周超聲提示左心室增大，病理檢查提示心肌纖維化，說明DCM 造模成功，9 只大鼠入組。

2.2 兩組大鼠血糖、體重及心功能指標比較 DCM組大鼠較對照組大鼠血糖顯著升高，體重減輕，LVEDd index 及LVESd index 增大，LVEF 及FS 降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠血糖、體重及心功能指標比較

2.3 兩組大鼠心肌HE 染色及Masson 染色結(jié)果HE 染色、Masson 染色均提示，對照組大鼠心肌細胞排列整齊，胞核均一，細胞間緊密連接；DCM 組大鼠心肌細胞腫脹、排列紊亂，膠原組織顯著增生，纖維化明顯，見圖1。

圖1 兩組大鼠心肌HE 及Masson 染色結(jié)果（a：DCM 組，b：對照組，×400）

2.4 兩組大鼠血清HB-EGF 水平比較 DCM 組大鼠血清HB-EGF 水平為（1.73±0.48）ng/ml，高于DCM 組的（0.26±0.06）ng/ml（t=7.546，P＜0.01）；蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示DCM 組心肌HB-EGF 水平明顯升高，見圖2。

圖2 兩組大鼠血清HB-EGF 水平比較及心肌HB-EGF 蛋白表達電泳圖

2.5 兩組大鼠心肌HB-EGF mRNA 表達水平比較DCM 組大鼠心肌HB-EGF mRNA 表達水平為8.02±1.92，高于對照組的1.72±0.77（t=7.467，P＜0.01），見圖3。

圖3 兩組大鼠HB-EGF mRNA 表達水平比較

3 討論

近年來，糖尿病的發(fā)病率迅速增高，其并發(fā)癥多，致死率及致殘率高，其中DCM 是糖尿病嚴重的并發(fā)癥，最初表現(xiàn)為心臟僵硬、心肌纖維化、心室肥厚和重塑，進一步發(fā)展則出現(xiàn)舒張及收縮功能障礙，最終進展為充血性心力衰竭[12-13]。DCM 發(fā)病過程主要與氧化應(yīng)激、炎癥反映、線粒體損傷等導(dǎo)致心肌肥大、纖維化等相關(guān)[14]。本實驗通過建立DCM 大鼠模型，并行超聲檢查、心肌病理觀察、HB-EGF 水平檢測，探討HB-EGF 在DCM 大鼠心肌纖維化中的作用。

STZ 是最常用于誘導(dǎo)糖尿病模型的藥物之一，為氨基葡萄糖-亞硝基脲抗生素，與葡萄糖結(jié)構(gòu)相近，在胰腺β 細胞中優(yōu)先被葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白吸收。腹腔內(nèi)注射STZ 導(dǎo)致胰腺β 細胞毒性和壞死，最終導(dǎo)致胰島素缺乏，引起糖尿病[15]。高劑量STZ 的單次使用方案和低劑量的持續(xù)使用方案均可用于制作糖尿病模型。STZ 制作糖尿病模型的最重要優(yōu)點是容易誘發(fā)，且不受年齡段限制，可在不同年齡段研究高血糖對心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響[16]。同時，血糖增高導(dǎo)致體內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物堆積、炎癥因子增加均可促進心肌纖維化；另外，高脂高糖飲食使心肌靠脂肪酸供能，導(dǎo)致心肌能量利用受阻，加速心肌收縮及舒張功能受損[17]。王金鑫等[18]研究發(fā)現(xiàn)采用單次STZ 結(jié)合連續(xù)高脂高糖飲食可成功建立2 型DCM 模型，并具有造模周期短、成功率高、費用低等特點，與人2 型DCM 的臨床特征相符合。故本實驗腹腔單次注射STZ 建立大鼠糖尿病模型，餐后血糖≥16.8 mmol/L判定為2 型糖尿病。造模第6 周血糖水平顯著升高，體重減輕，14 周時心臟超聲提示左心室擴大，LVEF明顯下降，心肌纖維化，DCM 大鼠造模成功，證實STZ 單次腹腔注射結(jié)合連續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)可成功建立DCM 模型。

HB-EGF 是表皮生長因子中的成員之一，其對多種細胞的有絲分裂有促進作用，并且在組織中廣泛表達，在生物體內(nèi)具有重要作用。研究表明，在發(fā)生氧化應(yīng)激、缺氧、損傷、動脈硬化及創(chuàng)傷時，HB-EGF 表達水平明顯增加[19]。HB-EGF 有促進血管平滑肌增殖、動脈粥樣硬化等作用，對于心血管系統(tǒng)、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生、發(fā)展亦具有重要作用[20]。Prado 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與正常血管壁相比，動脈粥樣硬化的血管壁中HB-EGF 呈高表達。韓鵬黎等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中，巨噬細胞和血管平滑肌細胞的HB-EGF 表達水平顯著增高。HB-EGF 異常的基因突變可導(dǎo)致小鼠心臟增大、心肌纖維化、心功能下降[23]。有報道顯示，血液中的高糖狀態(tài)可以導(dǎo)致HB-EGF 表達水平升高進而導(dǎo)致表皮生長因子受體異常磷酸化[24]，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活和細胞遷移、增殖、分化、凋亡，促進心肌組織纖維化[25-26]。有研究利用HB-EGF 基因腺病毒綠色熒光蛋白表達載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 信號通路參與HB-EGF 引起的心肌肥大及心肌纖維化過程[27]。本實驗通過蛋白質(zhì)印跡法、ELISA 檢測、RT 和PCR 檢測均發(fā)現(xiàn)DCM 組大鼠HB-EGF 表達顯著升高，與研究相符，證明了降低HB-EGF 表達可作為減輕心肌纖維化的一個新靶點。

心肌纖維化是糖尿病患者發(fā)生心肌重構(gòu)的一個重要標志，也是引起DCM 心功能下降的重要原因。成纖維細胞的活化、細胞因子和炎癥介質(zhì)刺激、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過度激活等均參與心肌纖維化的過程。其中成纖維細胞活化占主導(dǎo)地位。同時炎癥因子刺激也可促進成纖維細胞活化，最終導(dǎo)致心肌纖維化[28]。本研究對實驗第14 周大鼠進行心肌Masson 染色及HE 染色，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細胞排列紊亂，有局灶性壞死的情況，同時心肌細胞間質(zhì)中成纖維細胞明顯增多，細胞間隙增大，膠原組織增生、纖維化明顯。因此改善心肌炎癥及纖維化對治療DCM 意義重大[29]。基于心肌纖維化在DCM 等疾病中占重要位置，抗纖維化成為治療DCM 的主要途徑，后續(xù)仍需開展大量研究以深入探索心肌纖維化的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以了解各個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵靶點，從而為臨床提供相關(guān)的治療靶點[28-30]。本實驗還證實了DCM 組大鼠血清及心肌組織中HB-EGF 表達水平顯著升高，結(jié)果推測HB-EGF 的異常高表達在DCM 中發(fā)揮重要作用。