刈割頻率對天然羊草草原羊草葉鈣、鐵、鋅及氨基酸含量的影響

閆春霞，趙 曼，寶音陶格濤，趙一安，祁 智

（1.內蒙古大學生命科學學院/牧草與特色作物生物學教育部重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010010；2.內蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院，內蒙古呼和浩特 010010；3.張家口市農村合作經濟經營管理站，河北張家口 075000）

刈割是通過人為干擾對草地進行利用和管理的方式之一。相對于放牧，刈割可以選擇性地移除植物地上部分或全部生物量，適度刈割能夠緩解枯草在草地上的積累效應，同時也能抑制草地群落中優(yōu)勢物種的競爭性生長，使得競爭能力差的物種有機會進行繁殖和生長，從而提高草原生態(tài)的植物多樣性與物種豐富度[1-5]。有學者研究表明，連續(xù)刈割群落的多度高于隔年刈割，但群落平均高度、蓋度以及地上生物量等都低于隔年刈割[5]。肖紅等[6]研究表明，刈割顯著降低了羊草和無芒雀麥的地上現存量，在生長季降水少的干旱年份，第2 次刈割會嚴重抑制羊草和無芒雀麥的再生和碳水化合物的貯藏，建議1年刈割1 次[6]。

羊草（Leymus chinensis）是內蒙古草原廣泛分布的優(yōu)質禾本科牧草，作為一種重要的牧草資源，其富含維生素、礦物質，粗蛋白含量高，適口性良好，產量高，耐踐踏，對發(fā)展草原畜牧業(yè)具有重要的經濟和社會意義[7-8]。除作飼草外，羊草根莖穿透侵占能力很強，能形成強大的根網，盤結固持土壤作用很大，是很好的水土保持植物[9]。天然羊草草原是內蒙古的主要草原類型，也是我國北方的天然生態(tài)屏障和重要的畜牧業(yè)生產基地。在內蒙古的廣大牧區(qū)，為使牲畜安全過冬，每年都要從天然草原割取大量的牧草以備冬春補飼。由于長期刈割和放牧利用，羊草草原生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分大量輸出，群落結構嚴重失調，草地逐年退化沙化，水土流失加劇，生態(tài)環(huán)境日益惡化，對我國生態(tài)安全造成了嚴重的威脅[10]。因此，探索更加科學合理的刈割與放牧方式，是解決我國天然羊草草原當前生態(tài)環(huán)境惡化問題的關鍵。

Ca、Fe、Zn 是植物生長發(fā)育必需的礦物質元素，Ca2+參與維持細胞壁、細胞膜結構的穩(wěn)定，同時是細胞內重要的第二信使，被鈣調素感受并形成復合物后，會結合多種轉錄因子，進而調控下游靶基因，響應各種非生物和生物脅迫的信號傳導以及參與調控生物體的生長發(fā)育過程[11-12]。Fe2+/Fe3+能夠參與DNA復制[13]、葉綠素生物合成、呼吸、光合作用等過程，同時也是電子傳遞鏈等多種酶促反應中的輔助因子[14-15]。Zn2+是RNA 聚合酶、超氧化物歧化酶、乙醇脫氫酶和碳酸酐酶等多種酶的活化劑，參與碳水化合物、脂肪、核酸和蛋白質的合成與代謝[16]。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，在植物體內主要以游離態(tài)和結合態(tài)存在，結合態(tài)指多肽和蛋白質。植物組織中游離氨基酸僅占氨基酸總量的2%左右，但對植物的生長至關重要。游離氨基酸不僅是植物重要的氮源，而且可以維持植物的代謝平衡，能夠在干旱、冷害、重金屬污染等逆境脅迫下靈敏地響應環(huán)境壓力，從而保證植物的正常生長[17-18]。

本研究通過對不同刈割頻率下天然羊草草原羊草葉中Ca、Fe、Zn 及氨基酸含量的測定與分析，確定刈割是否會對草地內羊草的Ca、Fe、Zn 以及氨基酸含量產生影響，探索天然羊草草原最適合的刈割頻率，從而為遏制草原生態(tài)環(huán)境惡化、保護草原生態(tài)安全提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗樣地

試驗樣地位于內蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟白音錫勒牧場的中國科學院內蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，地理坐標為43°30′～48°30′N，113°30′～116°42′E。該地區(qū)屬于溫帶草原氣候，羊草為主要優(yōu)勢種，群落組成為“羊草+大針茅+糙隱子草”[19-21]。

1.2 刈割試驗設計

刈割試驗于2001年開始，2019年結束，連續(xù)19年對樣地草原羊草進行不同頻率的刈割。試驗采用隨機區(qū)組設計，5 個處理：“000”不刈割（CK）、“101”刈割1年休1年、“110”刈割2年休1年、“111”1年刈割1 次、“222”1年刈割2 次。每個處理4 次重復，重復數分別歸類為Block 1、Block 2、Block 3、Block 4，小區(qū)面積為10 m×10 m。不同刈割頻率試驗設計見圖1a，試驗區(qū)實際情況見圖1b。不同刈割頻率的時間設定和刈割后留茬高度參考鮑雅靜等[22]的方法，“101”“110”“111”的刈割時間為每年的8月16日，“222”的刈割時間為每年的6月23日和9月12日，刈割后羊草的留茬高度為6 cm。

圖1 刈割試驗設計及試驗區(qū)情況

1.3 取樣

2019年7月在干燥無雨天氣，6 h 內對不同刈割頻率試驗小區(qū)內的羊草進行集中取樣。取樣時在每個小區(qū)內設置5 個1 m×1 m 的樣方，選取株高一致的羊草，齊地面剪取全部地上生長部分。

1.4 Ca、Fe、Zn 含量測定

Ca、Fe、Zn 含量的測定方法參照WANG 等[23]的方法。具體步驟為：（1）如1.3 中所述，將收集到的羊草成苗，每株作為1 個樣本。（2）每個樣本先用0.5 mmol/L CuSO4·5H2O 清洗3 次，然后用去離子水漂洗3 次。105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重。（3）將樣品研磨成粉末并充分混勻，用分析天平稱取10 mg（精確到0.000 1 g），記錄數據。（4）將樣品粉末放入5 mL 離心管，加入3 mL 5% HNO3，渦旋混勻。（5）將樣品置于37 ℃搖床內，250 r/min 處理48 h。4 ℃，2 200g，離心30 min，取上清液到2 mL 的離心管中。4 ℃，15 000g，離心30 min，再提取上清液至2 mL 的離心管中，作為待測液備用。（6）利用電感耦合等離子體發(fā)射儀（ICP-OES，德國耶拿PQ9000），對待測樣品中的Ca、Fe、Zn 含量進行測定。

1.5 氨基酸種類及其含量測定

1.5.1 氨基酸種類

試驗測定了不同刈割頻率下羊草葉中14 種氨基酸的含量，其名稱及縮寫見表1。

表1 14 種氨基酸的名稱及縮寫

為了便于比較及直觀分析，按照“000”條件下測定的羊草葉中氨基酸含量的高低，將羊草干物質中氨基酸含量≥0.3 μg/mg 劃分為大量氨基酸，含量在0.1～0.3 μg/mg 劃分為中量氨基酸，含量＜0.1 μg/mg劃分為微量氨基酸。

1.5.2 氨基酸含量測定方法

參照張金林等[24]的方法，具體步驟為：（1）如1.3 中所述，將收集到的羊草成苗，每株作為1 個樣本。（2）每個樣本先用0.5 mmol/L CuSO4·5H2O 清洗3 次，然后用去離子水漂洗3 次。105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重，將樣品研磨成粉末并充分混勻。（3）準確稱取10 mg 樣品粉末（精確到0.000 1 g），加入1 mL 蒸餾水和1 mL 8%的磺基水楊酸。（4）將樣品渦旋振蕩15 min，4 ℃，10 000g，離心20 min，取上清液至2 mL 的離心管中，作為待測液備用。（5）用日立L-8900 型全自動氨基酸分析儀測定氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 不同刈割頻率對羊草葉中Ca、Fe、Zn 含量的影響

由圖2 和表2 可知，與“000”相比，刈割頻率為“101”時，羊草葉中Ca 含量提高1.2%，但二者無顯著差異（P＞0.05）；刈割頻率為“110”“111”“222”時，羊草葉中Ca 含量分別提高了13.6%、21.8%、11.8%，差異顯著（P＜0.05）。由圖2 可知，與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Fe、Zn 含量差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同刈割頻率下Ca 含量變化值 單位：%

圖2 不同刈割頻率羊草葉中Ca、Fe、Zn 含量

2.2 不同刈割頻率對羊草葉中氨基酸含量的影響

2.2.1 大量氨基酸含量變化

由圖3a 和表3 可知，與“000”相比，刈割頻率為“101”“110”的羊草葉中Ala 含量差異不顯著（P＞0.05）；刈割頻率為“111”和“222”的Ala 含量顯著降低（P＜0.05），“111”降低28.8%、“222”降低27.2%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Ser 含量均顯著降低（P＜0.05），“101”降低35.0%、“110”降低24.0%、“111”降低22.0%、“222”降低33.0%。與“000”相比，刈割頻率為“101”“110”“111”的羊草葉中Val 含量差異不顯著（P＞0.05）；刈割頻率為“222”的Val 含量顯著降低，為34.5%（P＜0.05）。

2.2.2 中量氨基酸含量變化

由圖3b 和表3 可知，與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Leu 含量均顯著增加（P<0.05），“101”增加38.0%、“110”增加44.0%、“111”增加66.0%、“222”增加53.0%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Arg 含量均顯著增加（P<0.05），“101”增加32.0%、“110”增加36.0%、“111”增加40.0%、“222”增加28.0%。不同刈割頻率羊草葉中Phe、His、Lys、Glu 含量差異均不顯著（P>0.05）。

2.2.3 微量氨基酸含量變化

由圖3c 和表3 可知，與“000”相比，刈割頻率為“101”“110”“111”的羊草葉中Cys 含量顯著增加（P<0.05），“101”增加49.5%、“110”增加41.9%、“111”增加52.0%；“000”與“222”差異不顯著（P>0.05）。

表3 不同刈割頻率羊草葉中14 種氨基酸含量變化值 單位：%

圖3 不同刈割頻率羊草葉中氨基酸含量

與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Tyr 含量顯著降低（P<0.05），“101”降低46.0%、“110”降低37.0%、“111”降低34.0%、“222”降低15.0%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Ile 含量顯著降低（P<0.05），“101”降低19.0%、“110”降低18.0%、“111”降低36.0%、“222”降低37.0%。與“000”相比，不同刈割頻率羊草葉中Met 含量顯著降低（P<0.05），“101”降低35.0%、“110”降低24.0%、“111”降低29.0%、“222”降低35.0%。不同刈割頻率羊草葉中Gly 含量差異不顯著（P>0.05）。

2.2.4 14 種氨基酸總量變化

由表4 可知，與“000”相比，“101”“110”“111”刈割頻率下的羊草葉中14 種氨基酸總量分別上升了30.95%、40.19%、33.76%；“222”刈割頻率下的羊草葉中14 種氨基酸總量下降了99.76%。

表4 不同刈割頻率羊草葉中14 種氨基酸總量變化值 單位：%

3 討論與結論

試驗結果表明，與“000”（不刈割）相比，當刈割頻率為“101”（刈割1年休1年）時，羊草葉中Ca 含量無顯著變化（P>0.05）；而“110”（刈割2年休1年）、“111”（1年刈割1 次）、“222”（1年刈割2 次）這3 種刈割頻率下羊草葉中Ca 含量顯著增加（P<0.05）。仲延凱等[25-27]研究發(fā)現，刈割會促進羊草根、葉中Ca含量增加，這與本研究結果相符。植物補償生長是造成Ca 含量增加的主要原因，而刈割強度是決定植物補償生長的一個關鍵因素。由于刈割后植物的葉面積減少，光合作用以及碳、氮的吸收和同化過程減弱，植物體內的營養(yǎng)物質被動員起來以實現最優(yōu)化分配[28-29]，根系大量吸收水分、無機鹽，通過再生長補償去除的組織[30-31]，從而導致羊草葉中Ca 含量增加。本研究中，不同刈割頻率羊草葉中Fe、Zn 含量差異不顯著（P>0.05），這可能是由于刈割處理會促進根系大量吸收水分及無機鹽，在此過程中，Ca 與Fe、Zn 產生吸收競爭[32]，從而使得羊草葉中Fe、Zn的積累不明顯。

本研究表明，刈割后羊草葉中Leu、Arg、Cys（“222”除外）含量顯著增加（P<0.05），Ser、Tyr、Ile、Met 含量顯著降低（P<0.05），Ala 含量在“111”和“222”時顯著降低（P<0.05），Val 含量在“222”時顯著降低（P<0.05），而Phe、His、Lys、Glu 和Gly 的含量變化不大（P>0.05）。張海娜等[33]研究發(fā)現，檸條在刈割后的萌蘗株葉和根中Arg、Asp、Ser、Val、Tyr、Phe、His、Pro、Ala、Met 等的含量均有不同程度提高。田靈芝[34]研究發(fā)現，刈割-施氮后小黑麥中飼237 草中的Leu、Met 和Lys 含量增加。石蕾等[35]研究發(fā)現，通過剪葉處理，興安落葉松針葉內Ile、Phe 的含量提高，而Asp、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Val 和Leu 的含量均有不同程度的下降。本研究中羊草刈割后氨基酸含量變化與上述研究結果有相同之處，也有一些不符，這可能是由于不同研究中所用的試驗材料、刈割方式、試驗地生態(tài)環(huán)境不同導致氨基酸的變化規(guī)律不相同。

高等植物生長過程中需要不斷利用氨基酸合成蛋白質和其他有機氮化物，因此，游離氨基酸不會在體內過多積累，由于不同氨基酸在植物生長中的作用不同，某種氨基酸含量的提高是植物有機體對其需求增大的一種表現[36]。MATTHEW 等[37]研究發(fā)現，Leu 具有信號傳導的功能，能夠誘導許多逆境脅迫響應基因的表達。本研究中，刈割后羊草葉中Leu 含量上升，推測可能是由于刈割脅迫下，植物體需要促進Leu 合成代謝，提高Leu 水平，進而誘導大量逆境響應基因的表達，使植物啟動逆境響應[38]；刈割后羊草葉中Arg 含量上升，這可能是由于刈割后的植物需要大量的氮素進行補償性生長，而Arg 是氮素的重要儲存形態(tài)，并且能夠合成二胺促進細胞分裂[39]，植物體內Arg 含量提高，進而促進植物的補償性生長；刈割后羊草葉中Cys 含量上升，可能是由于刈割對植物造成刈割脅迫，使得植物在逆境條件下，需要啟動葉片內抗氧化系統(tǒng)及其防御機制，而Cys 在植物抗氧化以及氧化還原反應的調控中起著重要的作用[40]，刈割后羊草葉中Cys 含量提高，以響應逆境脅迫。

有研究表明，植物能承受的刈割強度是有一定限度的，如果刈割強度達到植物能維持正常生長的極限，植物表現出等補償生長[41]。本研究發(fā)現，與“000”相比，刈割頻率為“101”時，羊草葉中Ca 含量差異不顯著；刈割頻率為“110”“111”“222”時，羊草葉中Ca 含量差異顯著，分別提高了13.6%、21.8%、11.8%。刈割頻率為“101”“110”“111”“222”時，14 種氨基酸總量分別提高了30.95%、40.19%、33.76%以及降低了99.76%。由此可知，在4 種刈割頻率下羊草葉中Ca 含量“111”最高，“110”次之；14 種氨基酸總量“110”最高，“111”次之。本試驗結果說明，在“111”（1年刈割1 次）和“110”（刈割2年休1年）刈割頻率下，植物處于等補償生長點，能夠表現出最大的等補償生長效應。對于天然羊草草原，1年刈割1 次和刈割2年休1年都是較為科學合理的刈割方式。