青貯發(fā)酵飼料中三株乳酸菌的生理特性研究

孫亞楠，李 梅，劉玉龍，任玉，朱朝華，潘立超，任海偉

（蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

0 引言

乳酸菌（LBA） 是一類能夠分解代謝碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的一組細(xì)菌的統(tǒng)稱。乳酸菌可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，提高腸道黏膜免疫，幫助腸道消化，促進(jìn)生長(zhǎng)和繁殖，是一類具有明顯益生功能的“益生菌”，且具有較好的生理特性。在農(nóng)業(yè)、生物飼料、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[1-3]。

青貯飼料是反芻動(dòng)物的重要粗飼料來源，是推動(dòng)畜牧業(yè)發(fā)展的主要?jiǎng)恿?。在青貯飼料的制備過程中，乳酸菌在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，從而迅速降低飼料的pH 值，在較低的pH 值環(huán)境下，其他有害微生物的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，從而延長(zhǎng)了飼料的儲(chǔ)存期，減少了青貯飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和破壞，可以有效提高青貯發(fā)酵飼料的品質(zhì)[4]。許多研究表明，青貯時(shí)添加乳酸菌不僅能夠增加青貯飼料的能量和蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以在青貯過程中產(chǎn)生具有抗菌活性或抗氧化作用的乳酸、乙酸等功能性代謝產(chǎn)物[5-7]。青貯時(shí)挑選出繁殖能力快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的精良乳酸菌菌株，是制備精良添加劑的核心，也是青貯最終能成功的重要決定因素[8-13]。近年來，乳酸菌在生物飼料領(lǐng)域的研究顯著增多，謝華德等人[14]研究乳酸菌對(duì)象草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)添加LAB 可以改善象草發(fā)酵品質(zhì)，提高象草青貯料的營(yíng)養(yǎng)。何軼群等人[15]從玉米秸稈飼料中篩選到6 株產(chǎn)酸和抑菌效果良好的乳酸菌，其中植物乳桿菌的產(chǎn)酸性能最好。

3 株乳酸菌在青貯過程中均扮演著重要的角色，其中植物乳桿菌作為一種同型發(fā)酵乳酸菌，相比異型發(fā)酵乳酸菌，有產(chǎn)酸速率高、青貯飼料中干物質(zhì)含量損失更少等優(yōu)勢(shì)[11]。戊糖片球菌是青貯過程中的固有乳酸菌菌種，可以顯著提高家禽的飼料轉(zhuǎn)化率和青貯發(fā)酵速率，改善青貯飼料的品質(zhì)[12]。類干酪乳桿菌RSI 安全，無致病性，在抑制病原菌、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫方面效果顯著，是一株優(yōu)秀的工業(yè)菌株[13]。

因此，對(duì)3 株乳酸菌生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，篩選出適合用于青貯的精良菌株，目的在于獲得更具優(yōu)良生物特性的乳酸菌，以期為更好地在青貯飼料中利用乳酸菌及其開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)[14-19]。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑

MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 g，檸檬酸氫二氨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g，磷酸氫二鉀2 g（瓊脂15 g）；加蒸餾水至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

立式電熱壓力蒸汽滅菌器、智能生化培養(yǎng)箱、紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；SBA～40X 型生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品；PBH-5 型便攜式酸度計(jì)，杭州雷磁分析儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化、純化

供試3 株乳酸菌為蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室所保藏。

（1） 活化。將植物乳桿菌、類干酪乳桿菌和戊糖片球菌3 株乳酸菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基表面，在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，當(dāng)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁時(shí)取出。

（2） 純化。各取0.2 mL 活化后的菌株分別涂布于MRS 固體培養(yǎng)基表面，37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。待單菌落生長(zhǎng)，結(jié)合菌落形態(tài)觀察等綜合鑒定為純菌株，然后作為測(cè)試菌種進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3.2 菌種的培養(yǎng)

以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量[20]將不同乳酸菌在MRS 培養(yǎng)基（液體） 上接種，分別在不同的溫度（20，30，37，42，50 ℃） 和pH 值（3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5） 下培養(yǎng)48 h。每隔3 h 取樣1 次，在波長(zhǎng)600 nm 的可見光條件下用分光光度計(jì)測(cè)其OD值繪制生長(zhǎng)曲線，并測(cè)定樣品中的乳酸濃度和pH 值。

（1） 菌株的溫度生長(zhǎng)試驗(yàn)。設(shè)置5 個(gè)溫度梯度（20，30，37，42，50 ℃），在經(jīng)嚴(yán)格滅菌的150 mL的MRS 液體培養(yǎng)基（pH 值為6.5） 上，接種體積分?jǐn)?shù)為1%的活化菌種[20]，置培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。從接種開始每隔3 h 取樣9 mL 于離心管中，分別測(cè)定其中的OD 值、pH 值及乳酸濃度。

（2） 菌株的pH 值生長(zhǎng)試驗(yàn)。設(shè)置不同pH 值梯度的MRS 液體培養(yǎng)基，pH 值參數(shù)分別為3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5。用1 mol/L 的NaOH 和HCl 溶液調(diào)節(jié)滅菌前的pH 值。在150 mL 經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理的MRS 液體培養(yǎng)基（溫度為37 ℃） 上以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種活化菌種，置于培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h[20]。從接種開始每隔3h 取樣9 mL 于離心管中，分別測(cè)定其中的OD 值、pH 值及乳酸濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 軟件繪制圖表，對(duì)不同溫度和pH 值處理的OD 值和乳酸濃度進(jìn)行分析，從而得到乳酸菌的最適生長(zhǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌的生理特性研究

2.1.1 溫度對(duì)植物乳桿菌影響

不同溫度下植物乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH值、OD 值的變化見圖1。

由圖1（a） 可知，植物乳桿菌在20 ℃培養(yǎng)時(shí)，9 h 后乳酸質(zhì)量濃度下降，21～30 h 乳酸質(zhì)量濃度穩(wěn)定，產(chǎn)酸速度基本為零，30 h 后乳酸質(zhì)量濃度開始有緩慢上升；在30 ℃培養(yǎng)時(shí)，接種3 h 后開始產(chǎn)生乳酸，3～6 h 產(chǎn)乳酸速度最快，6～33 h 乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，33 h 后乳酸質(zhì)量濃度開始上升；在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，3 h 后開始產(chǎn)生乳酸，3～9 h 間產(chǎn)酸速度最快，此后在21～48 h 期間乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，產(chǎn)酸較少；在42 ℃培養(yǎng)時(shí)，3～6 h 產(chǎn)酸速度最快，在21～48 h 時(shí)，產(chǎn)酸較為平穩(wěn)；在50 ℃時(shí)檢測(cè)到的乳酸含量一直很低，可以判定植物乳桿菌在50 ℃不生長(zhǎng)。由圖1（b） 可知，菌液的pH 值基本維持穩(wěn)定，在50 ℃培養(yǎng)時(shí)取得樣液的pH 值基本不變，植物乳桿菌在50 ℃時(shí)不產(chǎn)生乳酸。且由圖可知pH 值變化與乳酸質(zhì)量濃度變化相對(duì)應(yīng)，二者呈負(fù)相關(guān)。由圖1（c） 可知，在20，30，37 ℃時(shí)，菌體密度變化情況基本相同，在培養(yǎng)一開始并沒有出現(xiàn)明顯改變，3 h 后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，24 h 后逐漸生長(zhǎng)遲緩，達(dá)到穩(wěn)定期；在42 ℃時(shí)，乳酸菌對(duì)數(shù)期為3～12 h，12～48 h 菌體生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期，之后進(jìn)入衰亡期；在50 ℃時(shí)OD 值基本保持穩(wěn)定不變，說明并無乳酸菌生長(zhǎng)。

圖1 不同溫度下植物乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化

綜上所述，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)該植物乳桿菌無菌群擴(kuò)增、產(chǎn)酸等生理現(xiàn)象，生命代謝基本停止。該植物乳桿菌可生存的溫度需低于50 ℃，當(dāng)溫度處于適宜溫度范圍30～37 ℃時(shí)，菌體增殖和產(chǎn)酸效應(yīng)均處于最佳，與茍擁軍、黃玉軍、李相禹等人[21-23]的研究結(jié)果相似，最適的發(fā)酵溫度均在該范圍內(nèi)；當(dāng)溫度高于適宜溫度范圍菌體生長(zhǎng)至穩(wěn)定期所需的時(shí)間延長(zhǎng)；當(dāng)溫度低于適宜溫度范圍菌體的發(fā)酵過程中乳酸濃度會(huì)受到較大影響，在pH 值保持穩(wěn)定的情況下乳酸被消耗，即乳酸消耗的同時(shí)有其他酸類物質(zhì)生成。

2.1.2 pH 值對(duì)植物乳桿菌影響

不同pH 值下植物乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH值、OD 值的變化見圖2。

圖2 不同pH 值下植物乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化

由圖2（a） 可知，植物乳桿菌在pH 值為4.5，7.5，8.5 的條件下培養(yǎng)時(shí)，主產(chǎn)酸期均為12～21 h，在21～30 h 的培養(yǎng)階段產(chǎn)酸速度減緩，30 h 后乳酸質(zhì)量濃度基本保持不變，最終乳酸質(zhì)量濃度在pH 值為7.5，8.5 培養(yǎng)時(shí)最大，為1 280 mg/mL，在pH 值為4.5 的條件下培養(yǎng)時(shí)次之；在pH 值為5.5，6.5 的條件下培養(yǎng)，3 h 時(shí)開始產(chǎn)酸，之后產(chǎn)酸速度減緩，12～27 h 產(chǎn)酸速度增加，在27 h 后乳酸質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定，在pH 值為5.5 的條件下培養(yǎng)時(shí)終產(chǎn)酸質(zhì)量濃度與在pH 值為8.5 培養(yǎng)時(shí)基本相同；pH 值為3.5時(shí)，檢測(cè)到的乳酸含量一直很低，可以得出植物乳桿菌在此pH 值條件下不生長(zhǎng)，36 h 后乳酸質(zhì)量濃度開始上升。由圖2（b） 可知，在0～9 h 期間，初始pH 值為6.5 培養(yǎng)時(shí)pH 值下降最快，pH 值為5.5 培養(yǎng)時(shí)次之；初始pH 值為4.5，7.5，8.5 條件下培養(yǎng)時(shí)，在12～21 h 期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為3.5 培養(yǎng)時(shí)，pH 值基本保持不變。由圖2（c） 可知，初始pH 值為6.5 培養(yǎng)時(shí)，3 h 后細(xì)菌繁殖迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，6 h 后生長(zhǎng)逐漸遲緩，達(dá)到穩(wěn)定期；初始pH 值為7.5 培養(yǎng)時(shí)，9 h 后細(xì)菌繁殖迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，12 h 后生長(zhǎng)逐漸遲緩，達(dá)到穩(wěn)定期；初始pH 值為4.5 培養(yǎng)時(shí)，12 h 后細(xì)菌繁殖迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h后生長(zhǎng)逐漸遲緩，達(dá)到穩(wěn)定期；初始pH 值為5.5 培養(yǎng)時(shí)，9 h 后細(xì)菌開始大量生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h 后逐漸趨于平緩，到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)期，30 h 后又開始大量生長(zhǎng)，直至36 h 生長(zhǎng)遲緩，到達(dá)穩(wěn)定期；初始pH 值為3.5，8.5 的條件下培養(yǎng)時(shí)，OD 值一直在緩慢增大，但一直處于較低的水平，說明基本無乳酸菌生長(zhǎng)。

綜上所述，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，整個(gè)發(fā)酵體系的pH 值不斷降低，最終穩(wěn)定在pH 值3.5 左右。當(dāng)發(fā)酵體系的pH 值達(dá)到穩(wěn)定值3.5 后，pH 值不再大幅度的變化，即植物乳桿菌在pH 值低于3.5的條件下代謝受到抑制、無乳酸產(chǎn)生、菌體無擴(kuò)增，菌體在該pH 值條件下無生命特征。菌體的擴(kuò)增、產(chǎn)酸基本是同時(shí)進(jìn)行的，該植物乳桿菌的最適pH 值為6.5，在此pH 值條件下菌體最快度過遲緩期，最快進(jìn)入對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。陳境等人[24]的研究發(fā)現(xiàn)pH 值6.8 作為最適初始pH 值，可以使植物乳桿菌相關(guān)的酶活性增加，促進(jìn)其生長(zhǎng)。M V Leal-Sánchez 等人[25]也報(bào)道了植物乳桿菌LPCO 的最適發(fā)酵pH 值范圍為4.5～6.5。當(dāng)pH 值高于或低于6.5 時(shí)，菌體的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸效應(yīng)會(huì)出現(xiàn)一定程度的負(fù)效應(yīng)，其程度與pH 值偏離6.5 的幅度呈正相關(guān)，該特性與李娜等人[26]報(bào)道的pH 值對(duì)植物乳桿菌ZJ316 的影響相一致。pH 值對(duì)該植物乳桿菌發(fā)酵過程的影響規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，主要差異在它們的酸穩(wěn)定性，茍擁軍等人[21]報(bào)道的果漿發(fā)酵中的植物乳桿菌在pH 值3.5 時(shí)仍可以增殖并產(chǎn)酸，楊悅、孫盛等人[27-28]報(bào)道的植物乳桿菌LV02 和WHH589 的pH 值耐受值也低于3.5。從青貯中分離得到的植物乳桿菌具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，能夠在短時(shí)間內(nèi)度過遲緩期，進(jìn)入對(duì)數(shù)期并產(chǎn)酸[26-27]。

2.2 戊糖片球菌的生理特性研究

2.2.1 溫度對(duì)戊糖片球菌影響

不同溫度下戊糖片球菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH值、OD 值的變化見圖3。

由圖3（a） 可知，當(dāng)pH 值為6.5，戊糖片球菌在20 ℃培養(yǎng)時(shí)，12 h 后乳酸質(zhì)量濃度下降，21～33 h乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，產(chǎn)酸速度基本為零，33 h后乳酸質(zhì)量濃度有所上升。在30，37 ℃培養(yǎng)3 h 后開始產(chǎn)乳酸，3～6 h 產(chǎn)乳酸速度最快，9 h 后乳酸質(zhì)量濃度下降，12～27 h 乳酸質(zhì)量濃度開始上升，27～33 h 乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，產(chǎn)酸速度基本為零，33 h 后乳酸質(zhì)量濃度開始上升，且在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，乳酸質(zhì)量濃度1 480 mg/mL，達(dá)到最高；在42 ℃培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)3 h 后開始產(chǎn)乳酸，3～6 h 產(chǎn)酸速度最快，之后乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定且最大為1 440 mg/mL；在50 ℃培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)到的乳酸水平一直很低，可以基本判定戊糖片球菌在50 ℃不生長(zhǎng)。由圖3（b） 可知，在20，30，37 ℃時(shí)，菌液的pH 值維持穩(wěn)定，在50 ℃培養(yǎng)時(shí)取得樣液的pH 值基本不變，戊糖片球菌在50 ℃不產(chǎn)生乳酸。且由圖3 可知，pH 值變化與乳酸質(zhì)量濃度變化相對(duì)應(yīng)，二者呈負(fù)相關(guān)。由圖3（c） 可知，在20，30，42 ℃時(shí)，菌體密度變化情況基本相同，在培養(yǎng)一開始并沒有出現(xiàn)明顯改變，3 h后乳酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6 h 后逐漸生長(zhǎng)遲緩，到達(dá)穩(wěn)定期，在20，42 ℃時(shí)，乳酸菌還會(huì)增加直到36 h 菌體密度保持穩(wěn)定不變；在37 ℃時(shí)，可以看出3～21 h 時(shí)乳酸菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，穩(wěn)定期為21～48 h；在50 ℃時(shí)OD 值基本保持穩(wěn)定不變，說明并無乳酸菌生長(zhǎng)。

圖3 不同溫度下戊糖片球菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化

綜上所述，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)該戊糖片球菌無擴(kuò)增、產(chǎn)酸等生理現(xiàn)象，生命代謝基本停止。當(dāng)溫度處于20～42 ℃時(shí)，該戊糖片球菌能夠增殖、產(chǎn)酸。且均從接種3 h 后開始快速產(chǎn)酸，其中溫度在30，37，42 ℃時(shí)其產(chǎn)酸效果相近，20 ℃下的產(chǎn)酸效果明顯較弱。其主要原因在接種3 h 后20，30，37，42 ℃發(fā)酵條件下的戊糖片球菌均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，受溫度的影響，20 ℃條件下戊糖片球菌在達(dá)到穩(wěn)定期后菌液質(zhì)量濃度明顯低于其他溫度。

2.2.2 pH 值對(duì)戊糖片球菌影響

不同pH 值下戊糖片球菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH值、OD 值的變化見圖4。

圖4 不同pH 值下戊糖片球菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化

由圖4（a） 可知，戊糖片球菌在pH 值為4.5，7.5，8.5 的條件下培養(yǎng)時(shí)主產(chǎn)酸期為12～21 h，而21～24 h 時(shí)產(chǎn)酸速度遲緩，24 h 后乳酸質(zhì)量濃度基本達(dá)到穩(wěn)定；在pH 值為5.5，6.5 的條件下培養(yǎng)時(shí)，3 h 后開始產(chǎn)酸，之后產(chǎn)酸速度緩慢增加，在pH 值為6.5 培養(yǎng)時(shí)終產(chǎn)酸質(zhì)量濃度最大，為1 480 mg/mL；在pH 值為3.5 培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)到的乳酸水平一直很低，可以判定戊糖片球菌在pH 值為3.5 時(shí)不生長(zhǎng)，33 h 后乳酸濃度有所上升。由圖4（b） 可知，在0～9 h 期間，初始pH 值為6.5 培養(yǎng)時(shí)pH 值下降最快，pH 值為5.5 時(shí)次之；初始pH 值為7.5，8.5 培養(yǎng)時(shí)，在12～21 h 期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為4.5 培養(yǎng)時(shí)，在12～24 h期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為3.5 培養(yǎng)時(shí)，pH 值基本保持不變。由圖4（c）可知，初始pH 值為5.5 培養(yǎng)時(shí)，3 h 后細(xì)菌迅速繁殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期為33 h 后；初始pH 值為6.5 培養(yǎng)時(shí)，6 h 后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，21 h 后到達(dá)穩(wěn)定期；初始pH 值為4.5 培養(yǎng)時(shí)，12 h 后細(xì)菌開始迅速繁殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，27 h 后生長(zhǎng)逐漸遲緩，達(dá)到穩(wěn)定期；初始pH 值為7.5，8.5 培養(yǎng)時(shí)，12 h 后細(xì)菌開始迅速繁殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，21 h 后生長(zhǎng)逐漸遲緩，到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)期；初始pH 值為3.5 培養(yǎng)時(shí)，OD 值一直處于較低的水平，說明基本無乳酸菌生長(zhǎng)。

綜上所述，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，整個(gè)發(fā)酵體系的pH 值不斷降低，最終穩(wěn)定在pH 值3.5 左右。當(dāng)發(fā)酵體系的pH 值達(dá)到穩(wěn)定值3.5 后，pH 值不再大幅度變化，即戊糖片球菌在pH 值低于3.5 的條件下代謝受到抑制、無乳酸產(chǎn)生、菌體無擴(kuò)增，菌體在該pH 值條件下無生命特征。菌體的擴(kuò)增、產(chǎn)酸基本是同時(shí)進(jìn)行的，該戊糖片球菌的最適pH 值為6.5，在該pH 值條件下菌體產(chǎn)酸速度最快，最終乳酸濃度最高，菌體密度最大。與裴慧潔[29]研究結(jié)果相似，戊糖片球菌Z-1 在pH 值2～10 時(shí)具有良好的酸堿穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果與已有報(bào)道結(jié)果基本一致，而對(duì)于不同種類的戊糖片球菌，產(chǎn)酸存在差異性，潘佳雯[30]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH 值為3.5 時(shí)，戊糖片球菌XY46可繼續(xù)增殖。

2.3 類干酪乳桿菌的生理特性研究

2.3.1 溫度對(duì)類干酪乳桿菌影響

不同溫度下類干酪乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH值、OD 值的變化見圖5。

由圖5（a） 可知，類干酪乳桿菌在20 ℃培養(yǎng)時(shí)，3 h 后開始產(chǎn)乳酸，3～6 h 間產(chǎn)酸速度最快，12 h后乳酸濃度出現(xiàn)明顯下降，21～33 h 乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，產(chǎn)酸速度基本為零，33 h 后乳酸質(zhì)量濃度有所上升；在30，37 ℃培養(yǎng)時(shí)接種3 h 后開始產(chǎn)乳酸，3～6 h 產(chǎn)乳酸速度最快，此后在37 ℃時(shí)30 h 后乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，產(chǎn)酸量最多，為1 920 mg/mL；而在30 ℃培養(yǎng)時(shí)，21～33 h 乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，33 h 后乳酸質(zhì)量濃度又開始上升，36 h 乳酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定；在42 ℃培養(yǎng)時(shí)，接種3 h 后開始產(chǎn)乳酸，3～9 h 產(chǎn)乳酸速度最快，之后乳酸質(zhì)量濃度一直呈緩慢上升狀態(tài)；在50 ℃時(shí)培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)到的乳酸水平一直很低，可以基本判定類干酪乳桿菌在50 ℃不生長(zhǎng)。由圖5（b） 可知，在20，30，37 ℃時(shí)，菌液的pH 值變化維持基本穩(wěn)定狀態(tài)，在50 ℃培養(yǎng)時(shí)樣液的pH 值基本保持不變。且由圖5 可知，pH 值變化與乳酸質(zhì)量濃度變化相對(duì)應(yīng)，二者呈負(fù)相關(guān)。由圖5（c） 可知，在20～42 ℃時(shí)，菌體密度變化情況基本相同，在培養(yǎng)開始并沒有出現(xiàn)顯著改變，6 h之后細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)期過后逐漸趨于平緩，到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)期；在50 ℃時(shí)OD值基本保持穩(wěn)定不變，說明并無乳酸菌生長(zhǎng)。

圖5 不同溫度下類干酪乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化

綜上所述，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)該類干酪乳桿菌無擴(kuò)增、產(chǎn)酸等生理現(xiàn)象，生命代謝基本停止。當(dāng)溫度處于20～42 ℃時(shí)，該類干酪乳桿菌能夠增殖、產(chǎn)酸。且均從接種3 h 后開始快速產(chǎn)酸，其中溫度在37 ℃時(shí)產(chǎn)酸效果最佳，20 ℃下的產(chǎn)酸效果明顯較弱。結(jié)論與李彬等人[31]研究的與副干酪乳桿菌（Lactobaci llusparacasei JCM1171） 的相似性為99.83%的CSND-6 菌株在30～44 ℃的溫度范圍生長(zhǎng)基本一致。

2.3.2 pH 值對(duì)類干酪乳桿菌影響

不同pH 值下類干酪乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化見圖6。

圖6 不同pH 值下類干酪乳桿菌中乳酸質(zhì)量濃度、pH 值、OD 值的變化

由圖6（a） 可知，類干酪乳桿菌在pH 值為7.5，8.5 條件下培養(yǎng)時(shí)主產(chǎn)酸期為12～21 h，而21～33 h 期間產(chǎn)酸速度減緩，33 h 后乳酸質(zhì)量濃度基本保持不變；在pH 值4.5 培養(yǎng)時(shí)，主產(chǎn)酸期為12～21 h，而21～48 h 期間產(chǎn)酸速度減緩，乳酸質(zhì)量濃度不斷增大；在pH 值為5.5，6.5 條件下培養(yǎng)時(shí)，3 h 時(shí)開始產(chǎn)酸，之后乳酸質(zhì)量濃度下降，后來產(chǎn)酸速度緩慢增加，33 h 后乳酸質(zhì)量濃度基本保持不變，在pH 值6.5 培養(yǎng)時(shí)終產(chǎn)酸質(zhì)量濃度最大為1 920 mg/mL；在pH 值為3.5 培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)到的乳酸質(zhì)量濃度一直很低，可以判定類干酪乳桿菌在pH 值為3.5 時(shí)不產(chǎn)生乳酸。由圖6（b） 可知，在0～9 h 期間，初始pH值為6.5 培養(yǎng)時(shí)pH 值下降最快，接下來為pH 值5.5培養(yǎng)；初始pH 值為7.5，8.5 培養(yǎng)時(shí)，在12～21 h 期間pH 值下降最快，之后pH 值基本保持不變；初始pH 值為4.5 培養(yǎng)時(shí)，在12～24 h 期間pH 值下降最快，24 h 后pH 值基本保持不變；初始pH 值為3.5培養(yǎng)時(shí)，pH 值基本保持不變。由圖6（c） 可知，初始pH 值為5.5，6.5 條件下培養(yǎng)時(shí)，3 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，30 h 后到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)期；初始pH 值為8.5 培養(yǎng)時(shí)，12 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，21 h 后達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期；初始pH 值為4.5 培養(yǎng)時(shí)，12 h 后細(xì)菌迅速繁殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30 h 到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)期，終了菌體密度達(dá)到最大；初始pH 值為7.5 培養(yǎng)時(shí)，12 h 后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，24 h 后細(xì)菌生長(zhǎng)遲緩，36 h 到達(dá)穩(wěn)定期；初始pH 值為3.5 培養(yǎng)時(shí)，30 h 后OD 值一直在緩慢增大，但一直處于較低的水平，說明基本無乳酸菌生長(zhǎng)。

綜上所述，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，整個(gè)發(fā)酵體系的pH 值不斷降低，最終穩(wěn)定在pH 值3.5 左右。當(dāng)發(fā)酵體系的pH 值達(dá)到穩(wěn)定值3.5 后，pH 值不再大幅度的變化，即類干酪乳桿菌在pH 值低于3.5 的條件下代謝受到抑制、無乳酸產(chǎn)生、菌體無擴(kuò)增，菌體在該pH 值條件下無生命特征。菌體的擴(kuò)增、產(chǎn)酸基本是同時(shí)進(jìn)行的，該類干酪乳桿菌的最適pH 值為6.5，在此pH 值條件下菌體產(chǎn)酸速度最快，pH 值下降最快，最終菌體密度最大。該結(jié)論與李彬等人[31]研究的CSND-6 菌株在pH 值為6～8 時(shí)生長(zhǎng)較快的結(jié)論基本一致。

3 結(jié)論

（1） 對(duì)于植物乳桿菌，適合菌株生長(zhǎng)的溫度有20，30，37 ℃，適合產(chǎn)乳酸的溫度為42 ℃。當(dāng)pH值為6.5，溫度為30 ℃（前期），42 ℃（后期） 梯度培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)速度較快、菌體密度最大、最終乳酸質(zhì)量濃度最高，可達(dá)到快速發(fā)酵的目的。

（2） 對(duì)于戊糖片球菌，適合菌株生長(zhǎng)的溫度有20，30，37 ℃，適合產(chǎn)乳酸的溫度為37，42 ℃；當(dāng)pH 值為6.5，溫度為37 ℃培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)速度較快，最終乳酸質(zhì)量濃度最高。

（3） 對(duì)于類干酪乳桿菌，適合菌株生長(zhǎng)的溫度有20，30，37 ℃，適合產(chǎn)乳酸的溫度為30，37 ℃；當(dāng)pH 值為6.5，溫度為37 ℃培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)速度較快，菌體密度較大，最終乳酸質(zhì)量濃度最高。

（4） 微生物的生長(zhǎng)受到環(huán)境pH 值與溫度的影響，在不同pH 值與溫度下，影響程度差異較大。實(shí)驗(yàn)中的3 株乳酸菌在pH 值低于3.5 的條件下基本不生長(zhǎng)；溫度為50 ℃條件下基本不生長(zhǎng)。

（5） 研究表明，酸度在一定程度上也能反映菌株的生長(zhǎng)性能。菌株產(chǎn)酸量越高，環(huán)境的pH 值越低。乳酸菌在生長(zhǎng)時(shí)pH 值下降較快的時(shí)間段為培養(yǎng)后3～9 h。在隨后的培養(yǎng)時(shí)間里3 株乳酸菌的pH 值基本保持不變。