林氏消化液和厚金格爾消化液水解結(jié)果與運(yùn)用比較

詹益雄，徐江峰，李 浪，李方麗，翁雅倩，車(chē) 騰，瞿明霞

（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢 430207）

在菌苗類(lèi)培養(yǎng)基中，通過(guò)胰酶消化牛肉得到的蛋白胨作為氮源被廣泛使用，如用林氏消化液制作白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)基，用厚金格爾消化液制作腦膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌培養(yǎng)基[1]。多年來(lái)的培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)胰酶消化牛肉的蛋白胨是質(zhì)量穩(wěn)定、高效的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分。通過(guò)胰酶消化牛肉得到的消化液通過(guò)噴霧干燥制得的干粉，也開(kāi)始在國(guó)內(nèi)運(yùn)用。各疫苗生產(chǎn)單位在生產(chǎn)牛肉胰酶消化液類(lèi)產(chǎn)品的工藝上不盡相同，大多在原始制法上做過(guò)改良；由于各單位該類(lèi)產(chǎn)品品種少，并未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)分析林氏消化液和厚金格爾消化液的制作和水解結(jié)果，結(jié)合其使用范圍，為該類(lèi)消化液運(yùn)用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰酶粉（1∶250，BR）；上海瑞永生物科技有限公司提供；20%氫氧化鈉溶液，自備；新鮮黃牛肉，市售。

1.2 檢測(cè)用試劑、主要儀器設(shè)備

1.2.1 檢測(cè)用試劑

磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 值6.86）、硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 值9.18）、0.85%生理氯化鈉溶液、2%硼酸溶液、30%氫氧化鈉溶液、消化劑、0.1 mol/L 硫酸溶液和1 mol/L 氫氧化鈉溶液、0.05 mol/L 鹽酸溶液、溴百里香酚藍(lán)指示劑、0.5%酚酞指示劑、硼酸鹽緩沖鹽水。

1.2.2 儀器設(shè)備

電子天平、pH 計(jì)（賽多利斯pb-10）、Buchi 自動(dòng)凱氏儀（K-370，系列號(hào)1000073773）、恒溫水浴箱等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 林氏消化液制備

新鮮黃牛肉經(jīng)過(guò)除脂、除筋膜、清洗、攪碎處理后，將20 000 g 新鮮碎黃牛肉加注射用水定容至60 L，加溫至90～100 ℃后，降溫至50～55 ℃，并維持恒溫50～55 ℃，不斷攪拌，消化過(guò)程中用20%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH 值并維持pH 值7.8～8.0。計(jì)時(shí)，胰酶粉分4 次加入，前3 次加入2/7，后1 次加入1/7，每隔30 min 加胰酶粉1 次，共加胰酶粉480 g。水解2.5 h 后，加入冰醋酸1 500 mL，煮沸后澄清過(guò)濾，取樣，滅菌，檢測(cè)AN 值、TN 值。

1.3.2 厚金格爾消化液制備

新鮮黃牛肉經(jīng)過(guò)除脂、除筋膜、清洗、攪碎處理后，將20 000 g 新鮮碎黃牛肉加水定容至70 L，煮沸30 min，冷卻至50～55 ℃，并維持恒溫50～55 ℃攪拌，消化過(guò)程中用20%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH 值并維持pH 值7.8～8.0，胰酶粉分2 次加入，每次加入胰酶粉160 g，每隔30 min 加胰酶粉1 次，共加胰酶粉320 g。在加入20%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH 值，且2 次測(cè)量（測(cè)量間隔≥15 min），在pH 值7.8～8.0 時(shí)，轉(zhuǎn)移至38 ℃密閉抑菌條件下，水解240 h，每12 h攪拌1 次，水解完成后取出煮沸，澄清過(guò)濾，取樣，滅菌，檢測(cè)AN 值、TN 值。

1.3.3 水解度計(jì)算和分析

用滴定法（加中性甲醛，與α - 氨基作用后，再以氫氧化鈉溶液滴定羧基） 確定樣品氨基氮含量。用Buchi 自動(dòng)凱氏儀（半微量法） 測(cè)定樣品總氮。水解度值按照AN/TN 計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 AN 值和TN 值檢測(cè)結(jié)果

林氏消化液共得到24 批次檢測(cè)數(shù)據(jù)，厚金格爾消化液共得到24 批次檢測(cè)數(shù)據(jù)。

AN 值和TN 值檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 AN 值和TN 值檢測(cè)結(jié)果

2.2 AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值計(jì)算

分別計(jì)算林氏消化液和厚金格爾消化液的AN 平均值和TN 平均值，兩者比值為AN/TN 值。2 種消化液AN/TN 值極顯著差異性（p＜0.01）。

AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值見(jiàn)表2。

表2 AN 值和TN 值平均值及AN/TN 值

2.3 林氏消化液和厚金格爾消化液運(yùn)用比較

統(tǒng)計(jì)2 種消化液，林氏消化液使用范圍較窄，主要用于白喉?xiàng)U菌、肉毒桿菌、水腫梭菌、溶組織梭菌的培養(yǎng)基氮源；厚金格爾消化液使用范圍較廣，主要用于金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟氏菌、白色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)氏菌、副傷寒甲沙門(mén)氏菌、副傷寒乙沙門(mén)氏菌、百日咳桿菌、霍亂、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、土拉倫菌、甲型溶血性鏈球菌的培養(yǎng)基氮源。比較AN/TN 值，得出更高水解度的消化液適用范圍更廣。

3 結(jié)論

對(duì)林氏消化液和厚金格爾消化液的水解液AN 值和TN 值進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)AN 值和TN 值平均值計(jì)算的AN/TN 值得出，厚金格爾消化液AN/TN 值比林氏消化液AN/TN 值高14.54%。比較林氏消化液和厚金格爾消化液工藝，溫度是變量，溫度升高加速水解反應(yīng)過(guò)程[2]；厚金格爾消化液制作后期是密閉抑菌消化，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)其pH 值為7.0～7.8 呈緩慢下降趨勢(shì)，不在胰酶最佳消化pH 值范圍內(nèi)[3-4]，也為水解不利因素，不計(jì)上述2 項(xiàng)不利因素作用，消化時(shí)間對(duì)水解的正向作用仍明顯。厚金格爾消化液前期50～55 ℃消化階段平均為1.5 h，在進(jìn)入后期消化前，未進(jìn)行AN 值和TN 值檢測(cè)，以及后期240 h 的消化分子量變化趨勢(shì)未進(jìn)行檢測(cè)，該部分趨勢(shì)尚需再通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行研究。

林氏消化液主要用于白喉?xiàng)U菌、魏氏梭菌、氣性壞疽、肉毒梭菌等的培養(yǎng)基制作，厚金格爾消化液主要用于霍亂弧菌、鼠疫桿菌、布魯氏桿菌、炭疽熱桿菌、土拉桿菌、志賀菌、百日咳、甲型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏菌、傷寒桿菌等的培養(yǎng)基制作[1]。大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌對(duì)于基礎(chǔ)液的水解度要求更低，即革蘭氏陰性菌深層培養(yǎng)的基礎(chǔ)液水解度更低。革蘭氏陽(yáng)性菌深層培養(yǎng)大多選用類(lèi)似于林氏消化液的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液，如破傷風(fēng)梭菌的深層培養(yǎng)選用的基礎(chǔ)液是牛肉胃酶消化液，在現(xiàn)階段常見(jiàn)基礎(chǔ)液中水解程度幾乎為最低；革蘭氏陰性菌的深層培養(yǎng)大多選用類(lèi)似于厚金格爾消化液，或者相似水解程度的干酪素水解液[5-6]，有些甚至直接用全綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)，如無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗生產(chǎn)時(shí)所用的SSM培養(yǎng)基或者其改良培養(yǎng)基[7-11]。這些事例反映細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)條件在不同胨或者氮源的分子量方面是不同的；在氮源替換試驗(yàn)上或者培養(yǎng)基改良上，應(yīng)重視氮源成分的分子量分布。另外，現(xiàn)階段各疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家對(duì)培養(yǎng)基的改良試驗(yàn)頻繁且迅速，僅僅追求深層培養(yǎng)菌體數(shù)量的增多尚不能體現(xiàn)培養(yǎng)基改良試驗(yàn)的成功，抗原性的保持也是培養(yǎng)基改良試驗(yàn)面臨的新課題[12]。