GC-MS/MS 測(cè)定禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈和3 種代謝物殘留

邢銀英，陳 建，張碧宇，顏艷陽，林 飛，項(xiàng)林敏，邵曉林，周建峰

（溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江溫州 325000）

0 引言

近年來，農(nóng)業(yè)部下發(fā)《關(guān)于切實(shí)加強(qiáng)蛋禽養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理工作的通知》，要求啟動(dòng)針對(duì)氟蟲腈違法違規(guī)使用的專項(xiàng)檢查[1]，嚴(yán)防氟蟲腈在生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)各環(huán)節(jié)對(duì)飼料原料和產(chǎn)品造成污染，所以理論上氟蟲腈不應(yīng)該在蛋及禽源類肉中檢出，也未就此項(xiàng)目禽肉及其制品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控[2]。目前，我國(guó)氟蟲腈的檢測(cè)主要在植物源性產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品及蛋類產(chǎn)品[1，3-10]，而國(guó)家監(jiān)督抽檢中并不包括禽源類肉及其肉制品的氟蟲腈限量，既然氟蟲腈在雞蛋中的存在已是事實(shí)，有必要對(duì)其上游產(chǎn)業(yè)鏈的禽源類肉及其肉制品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控。雖然我國(guó)內(nèi)地市場(chǎng)沒有歐洲“毒雞蛋”流入[2]，但是蛋類上游鏈端的禽源類肉及其肉制品可能已經(jīng)以進(jìn)口方式進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)。

在現(xiàn)有的氟蟲腈檢測(cè)方法中，定性定量的主要方法有氣相色譜法[8]、液相色譜法[5，7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6，10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4，9，11-20]等，這些方法中常用的前處理方法有液-液萃取[9]，固相萃取[19]（SPE），較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)產(chǎn)生較多的有機(jī)溶劑污染。國(guó)內(nèi)針對(duì)于氟蟲腈及其代謝物的行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有GB 23200.115—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》、GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法》等（該標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)氟蟲腈本體做測(cè)定），但是這些標(biāo)準(zhǔn)并沒有覆蓋到大部分禽源類肉和肉制品。經(jīng)查閱，文獻(xiàn)中有較多提到利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行測(cè)定，王永芳等人[3]利用LC-MS/MS 測(cè)定雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲腈及代謝物殘留量。戴盡波等人[4]利用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)禽源性食品中氟蟲腈及其代謝物等。但是，目前以氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)禽源類肉和肉制品進(jìn)行檢測(cè)的研究并未開展，GC-MS/MS 儀器檢測(cè)在定量定性上準(zhǔn)確度和精確度都比較高，且方法檢出限穩(wěn)定。

試驗(yàn)采用QuEChERS 前處理方法，建立檢測(cè)禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈及3 種代謝物殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。通過對(duì)于不同禽源類肉及其肉制品及其提取溶劑、凈化方式和色譜分析條件進(jìn)行研究，開發(fā)出一套操作性強(qiáng)、適應(yīng)性和覆蓋面廣、可行性強(qiáng)、效率高，同時(shí)精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度均能滿足相關(guān)要求的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟蟲腈及代謝物（氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均為100 μg/mL 液體標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶于乙腈，上海Anpel 公司提供；甲醇、乙腈（色譜純），上海Anpel 公司提供；氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；凈化管含PSA、C18、無水MgSO4，上海Anpel 公司提供。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 8890/7000D 三重四極桿氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，配EI 源，美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器，德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；SIGMA 冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min），美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；Research Plus微量移液器，德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；濾器（0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜），上海Anpel 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1） 混合中間工作液。分別移取200 μL 氟蟲腈及代謝物（氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)母液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成2.0 μg/mL 的混合溶液。

（2） 臨用時(shí)，用空白樣品前處理所得基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.020，0.050，0.100，0.200，0.500 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 試樣的制備與保存

將雞肉、鴨肉和鵝肉等禽類樣品各200 g，切碎均質(zhì)混勻，分別裝至潔凈容器內(nèi)作為測(cè)試樣，-18 ℃以下保存。

1.3.3 檢測(cè)樣品制備

稱取5 g（精確到0.01 g） 樣品，放入50 mL 聚丙烯離心管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的酸化乙腈溶液20 mL，渦旋混合5 min，再加入2 g 氯化鈉，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心5 min，使兩相分層；移取上層乙腈溶液1 mL 于2 mL 聚丙烯凈化離心管中，加入凈化粉末N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、無水MgSO4，渦旋混勻1 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后，待測(cè)定。

1.3.4 色譜質(zhì)譜條件

毛細(xì)管色譜柱：VF-1701MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；溫度：進(jìn)樣口280 ℃；柱溫100 ℃（40 ℃/min） ～250 ℃（2 min，40 ℃/min） ～280 ℃（6 min）；離子源280 ℃；載氣流速：氦氣，純度≥99.999%，1.0 mL/min；進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，電子轟擊源70 eV，溶劑延遲5 min，進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣，監(jiān)測(cè)方式為動(dòng)態(tài)多重反應(yīng)檢測(cè)（DMRM）。

氟蟲腈及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 DMRM 離子對(duì)參數(shù)采集圖

DMRM 離子對(duì)參數(shù)采集圖見圖1。

圖1 DMRM 離子對(duì)參數(shù)采集圖

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過Agilent Masshunter 工作站及定性定量處理系統(tǒng)采集分析質(zhì)譜圖，基質(zhì)配標(biāo)外標(biāo)定量工作曲線，采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)表格和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)過程萃取優(yōu)化

有機(jī)試劑乙腈通用性比較強(qiáng)，對(duì)于極性和非極性農(nóng)藥均有較高的提取效果，能溶解大多數(shù)農(nóng)藥，且可溶入的油脂量極少，在許多農(nóng)藥殘留提取試驗(yàn)中都直接用乙腈作為提取溶劑，樣品提取液離心分層后，農(nóng)藥及其相關(guān)代謝組分被分配到有機(jī)相中。擬以加標(biāo)回收率作為指標(biāo)，考查乙腈、乙腈水、酸性乙腈和酸性乙腈水4 種提取試劑的萃取效果，試驗(yàn)過程依據(jù)1.3.3 步驟。

對(duì)每種萃取進(jìn)行平行添加試驗(yàn)，后發(fā)現(xiàn)純乙腈的萃取效果優(yōu)于乙腈水，在提取過程中能夠更好地將蛋白成分進(jìn)行沉淀，同時(shí)相對(duì)于其他試劑，乙腈能夠降低脂肪和其他雜質(zhì)的溶出度。合適酸性范圍的乙腈與純乙腈相比，減少雜質(zhì)成分對(duì)目標(biāo)物氟蟲腈及代謝物（氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈） 的干擾性，同時(shí)增加其測(cè)定響應(yīng)值，綜合比較試驗(yàn)采用0.5%酸性乙腈作為萃取試劑。萃取過程中，加入適量NaCl 鹽析，有助于兩相離心分層，減少有機(jī)相中的水分，且增加中、高極性農(nóng)藥在有機(jī)相中的溶解度。

萃取試劑回收率均值分析圖見圖2。

圖2 萃取試劑回收率均值分析圖

2.2 萃取液凈化組分分析

常用QuEChERs 的凈化劑有N- 丙基乙二胺（PSA），屬于固相吸附劑，與NH2相似，PSA 有2 個(gè)氨基PKa 值分別為10.1 和10.9，比氨基柱更強(qiáng)的離子交換能力，廣泛用于植物農(nóng)殘分析樣品的處理，以及去除糖類、脂肪酸和親脂性色素等極性成分。十八烷基硅烷鍵合硅膠C18，含碳量10%，具有疏水作用，對(duì)非極性的組分有吸附作用，主要用于反相萃取，適合于非極性到中等極性的化合物。無水MgSO4，是為了去除水分而添加[4，9，11]。由于禽源肉類及其肉制品中存在色素問題較少，對(duì)于石墨化炭黑GCB 就不再做考查。試驗(yàn)采用QuEChERS 前處理方法，所以盡可能偏向高效、簡(jiǎn)潔、快速方式。

試驗(yàn)針對(duì)不同比例的N- 丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、無水MgSO4凈化組分搭配測(cè)試，通過同一水平的多組平行添加試驗(yàn)，以回收率作為依據(jù)考查凈化組分的最佳配比。PSA 和C18的作用主要在于吸附雜質(zhì)，而無水MgSO4以除水為主，所以在添加量上會(huì)高于前兩者。經(jīng)多種組凈化填料配比進(jìn)行添加試驗(yàn)，方法學(xué)考查，采用無水硫酸鎂150 mg，N-丙基乙二胺50 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠C1850 mg 作為凈化組分。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品基質(zhì)中某些提取物組分對(duì)待測(cè)物濃度或質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確度的影響，在質(zhì)譜分析上具體可以描述為待測(cè)溶液在離子化過程中，非待測(cè)物及干擾組分的離子化行為對(duì)于待測(cè)目標(biāo)物的離子化程度產(chǎn)生的加強(qiáng)效應(yīng)或者抑制效應(yīng)[13-20]。禽源肉類樣品乙腈萃取所得的化學(xué)成分復(fù)雜，含較多的油脂類等大分子物質(zhì)，氣相色譜質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)明顯，為準(zhǔn)確定量目標(biāo)化合物，減少基質(zhì)干擾，采用空白樣品的平行試驗(yàn)基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2.4 儀器分析條件選擇

根據(jù)目標(biāo)物氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈的結(jié)構(gòu)分析，比較多種極性的毛細(xì)管色譜柱，采用較適合農(nóng)殘分析的重型惰性化毛細(xì)管柱VF-1701MS 進(jìn)行分析測(cè)試，能夠利用串聯(lián)質(zhì)譜的性質(zhì)有效采集目標(biāo)化合物，具體色譜參數(shù)見1.3.4 色譜質(zhì)譜條件。

使用質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，通過全掃描、前級(jí)離子掃描、產(chǎn)物離子掃描等采集模式找到相應(yīng)的前級(jí)離子和產(chǎn)物離子, 優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，建立MRM 方法。對(duì)4 種化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行不同碰撞電壓下的各化合物標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖。

3 討論與評(píng)價(jià)

3.1 線性分析

將氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度逐級(jí)稀釋至0.005，0.010，0.020，0.050，0.100，0.200，0.500 μg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 種藥物在0.005～0.500 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r） 均大于0.990。

氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3。

圖3 氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 方法回收添加與精密度

氟蟲腈及其3 種代謝物按0.02，0.05，0.10 mg/kg，3 個(gè)質(zhì)量濃度分別添加至空白雞肉、鴨肉和鵝肉樣品中，每個(gè)質(zhì)量濃度做6 個(gè)平行樣，按方法進(jìn)行樣品處理，基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)正曲線定量，計(jì)算回收率與精密度。同時(shí)，分別以S/N≥3、S/N≥10 為判斷依據(jù)確定方法的檢出限與定量限。通過對(duì)3 類實(shí)際樣品加標(biāo)回收檢測(cè)分析，得到加標(biāo)回收率為80.8%～106.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.0%。經(jīng)分析計(jì)算，氟蟲腈及其3 種代謝物的定量限均在0.01～0.02 mg/kg。

模擬加標(biāo)水平下的回收率及精密度見表2。

表2 模擬加標(biāo)水平下的回收率及精密度

3.3 實(shí)際樣品分析

從市場(chǎng)上分別抽取20 批次雞肉，20 批次鴨肉，20 批次鵝肉樣品，10 批雞肉制品，10 批鴨肉制品，10 批鵝肉制品，按照指定方法進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)出陽性樣品。

4 結(jié)論

采用QuEChERS 前處理方法，建立檢測(cè)禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈及其代謝物3 種藥物殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。通過對(duì)于不同禽源類肉及其肉制品及其提取溶劑、凈化方式和色譜分析條件進(jìn)行研究，開發(fā)出一套操作性強(qiáng)、適應(yīng)性和覆蓋面廣、可行性強(qiáng)、效率高，同時(shí)其精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度能滿足相關(guān)要求的檢測(cè)方法。通過該方法能夠?qū)κ袌?chǎng)上售賣的各種禽源類肉和肉制品做到氟蟲腈及代謝物殘留量的有效控制，改善市場(chǎng)的禽源類肉及其肉制品的安全問題。