液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測魚中氯霉素類和硝基咪唑類藥物殘留

勇艷華

（大連市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116630）

氯霉素類藥物為廣譜抗生素，具有良好的抗菌能力，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。氯霉素類藥物的毒副作用主要表現(xiàn)為對血液系統(tǒng)造成的毒性。硝基咪唑類藥物有致突變性和潛在的致癌性，很多國家已將其列為違禁藥物。歐盟在20 世紀(jì)90 年代已經(jīng)禁止洛硝噠唑、地美硝唑和甲硝唑用于可食用動(dòng)物，2002 年美國食品與藥物管理局又公布了11 種禁止在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中使用的藥物名單，其中包括硝基咪唑類藥物。我國農(nóng)業(yè)部和國家藥品監(jiān)督管理局第227 號(hào)公告中規(guī)定，甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑不允許以促進(jìn)動(dòng)物生長為目的在所有食用動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用。農(nóng)業(yè)部公告第235 號(hào)文件規(guī)定，水產(chǎn)品中氯霉素、甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝唑均不得檢出，但是甲砜霉素在魚肉中限量50 μg/kg，氟苯尼考在魚肉中限量1 000 μg/kg、在其他動(dòng)物肌肉中為100 μg/kg。

氯霉素類藥物的檢測方法有很多，分別為酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，現(xiàn)在普遍使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[1-11]。檢測硝基咪唑類及其代謝物的方法有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法，主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-18]。但同時(shí)檢測水產(chǎn)品中氯霉素類和硝基咪唑類及其代謝物的報(bào)道較少，標(biāo)準(zhǔn)《出口動(dòng)物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 3235—2012）中雖然包含了氯霉素和5 種硝基咪唑類物質(zhì)，但未包含甲砜霉素和氟甲砜霉素，且需堿化乙腈、酸化乙腈各提取1 遍，略顯煩瑣，此外使用的提取試劑乙腈毒性較強(qiáng)[19]。本文建立了同時(shí)檢測氯霉素族和硝基咪唑類藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，采用毒性較小的乙酸乙酯為提取試劑，進(jìn)行液液萃取，正己烷脫脂，檢出限可達(dá)到要求，重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、操作簡便，可滿足魚肉中兩類藥物殘留的檢測要求，適合用于生產(chǎn)、流通、餐飲及進(jìn)出口環(huán)節(jié)的質(zhì)量監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1290/6495，美國Agilent公司）；均質(zhì)機(jī)（德國IKA 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；CF16RXII 立式大容量高速離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；賽多利斯全自動(dòng)超純水機(jī)（ 德 國Sartorius 公 司）；Agilent poroshell 120 ECC18色譜柱（4.6 mm×50.0 mm，2.7 μm，美國Agilent公司）。

實(shí)驗(yàn)中甲醇、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；無水硫酸鈉為分析純；甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑-D3、氯霉素、氯霉素-D5、氟甲砜霉素和甲砜霉素均為Dr.E 公司生產(chǎn)，純度大于98%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氯霉素類：分別稱取氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品約0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL 于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

硝基咪唑類：分別稱取甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品約0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL 于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

氘代內(nèi)標(biāo)：分別稱取氯霉素-D5 和羥甲基甲硝咪唑-D3 標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g（精確至0.000 1 g）于100 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為100 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.1 mL 分別置于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得濃度為100 μg/L 的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取適量氯霉素類、硝基咪唑類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用20%甲醇逐級(jí)稀釋至氯霉素類的濃 度 為0.5 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L；硝基咪唑類的濃度為2.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、60.0 μg/L 和100.0 μg/L；內(nèi)含5.0 μg/L 氯霉素-D5 和20.0 μg/L 羥甲基甲硝咪唑-D3。

1.3 樣品前處理

稱取5.00 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于50 mL 離心管中，加入20 μL 羥甲基甲硝咪唑-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液、5 μL 氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)中間液、25 mL乙酸乙酯及適量無水硫酸鈉，均質(zhì)1 min，12 000 r/min高速離心，將上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，再加入25 mL 乙酸乙酯重復(fù)提取1 次，合并提取液至圓底燒瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。1 mL 純水定容，2 mL正己烷脫脂，渦旋1 min，取水層過0.2 μm 微孔有機(jī)濾膜，待測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 為純甲醇，B 為高純水；梯度洗脫程序：0 ～1.5 min（25%A），1.5 ～4.1 min（25%～100%A）；4.1 ～6.5 min（100%A）；6.5 ～6.6 min（25%A）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜參數(shù)

電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；掃描方式：正負(fù)同時(shí)掃描；毛細(xì)管電壓：3 500 V；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源溫度：200 ℃；去溶劑氣溫度：300 ℃；去溶劑氣：氮?dú)?3 L/min；錐孔氣：氮?dú)?2 L/min。其他參數(shù)詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

利用空白基質(zhì)加標(biāo)考察回收率，對提取試劑乙腈、甲醇和乙酸乙酯進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 者在回收率上無明顯差異，乙酸乙酯毒性較小，確定其為本實(shí)驗(yàn)的提取試劑。提取后，用正己烷脫脂，可提高回收率。

2.2 流動(dòng)相的選擇

氯霉素類藥物和硝基咪唑類的結(jié)構(gòu)決定了其可以在C18色譜上獲得分離。本實(shí)驗(yàn)探討了甲醇和乙腈對目標(biāo)化合物的洗脫效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩者均能較好地分離表1 中的10 種物質(zhì)，但考慮到價(jià)格和毒性等因素，最終選擇甲醇；氯霉素類為負(fù)模式采集，酸抑制負(fù)模式的電離，影響靈敏度，因此最終確定流動(dòng)相為純甲醇和高純水。在1.4.1 所述梯度洗脫條件下，在8 min 內(nèi)可獲得這10 種物質(zhì)的最佳峰形，達(dá)到快速分析的目的。

表1 氯霉素類和硝基咪唑類化合物質(zhì)譜檢測參數(shù)及液相保留時(shí)間

2.3 線性范圍及檢出限

氯霉素類和硝基咪唑類分別在0.5 ～50.0 μg/L和2.0 ～100.0 μg/L 濃度與峰面積成線性相關(guān)，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。利用低濃度添加回收確定本方法氯霉素類檢出限為0.1 μg/kg，硝基咪唑類檢出限中甲硝唑?yàn)?.5 μg/kg，其他均為1.0 μg/kg。

表2 氯霉素類和硝基咪唑類化合物線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 回收率和精密度

用空白魚肉基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法計(jì)算測定結(jié)果，以測定值對理論添加量的百分比表示回收率。每個(gè)添加水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法精密度，結(jié)果見表3。由表可知，8 種物質(zhì)的加標(biāo)回收均能滿足檢驗(yàn)需要。

表3 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 實(shí)際樣品分析

利用本方法對市場銷售的50 余份魚進(jìn)行檢測，其中，1 份魚肉中檢出氯霉素0.32 μg/kg，1 份魚肉中檢出甲硝唑5.21 μg/kg，其他樣品均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)檢測魚肉中3 種氯霉素類和5種硝基咪唑類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，此方法快速、高效、準(zhǔn)確，便于操作，可用于魚肉中3 種氯霉素類和5 種硝基咪唑類藥物殘留的日常檢測。