肉及肉制品微生物檢測新技術(shù)研究進展

胡三梅

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院后勤基建處，北京 100076）

肉及肉制品富含蛋白質(zhì)、脂類、維生素以及鐵、鋅等礦物質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)動物蛋白的重要來源，同時我國肉及肉制品產(chǎn)量巨大，近10 年肉類平均年產(chǎn)量近8 505 萬t， 其中肉制品產(chǎn)量占15%～20%，其食用安全性備受人們關(guān)注。2021年國家市場監(jiān)督管理總局及各省、直轄市、自治區(qū)公布的本年度監(jiān)督抽檢情況顯示，肉及肉制品共1 264 批次不合格，不合格項目類別主要涉及獸藥、微生物、添加劑、質(zhì)量指標、污染物、標簽、非法添加等，其中微生物不合格數(shù)量達到346 批次，占不合格總數(shù)的27.4%（注：因國家市場監(jiān)督管理總局及各地市場監(jiān)督管理局抽檢公告較多，此處僅列出國家市場監(jiān)督管理總局2021年最后一項抽檢公告）。本文介紹肉及肉制品中微生物限量要求，分析傳統(tǒng)微生物檢測方法的弊端，綜述快速測試片法、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物熒光法、分子診斷法、免疫分析法、光譜法及儀器法等新技術(shù)在肉及肉制品微生物檢測應(yīng)用中的研究進展。

1 我國肉及肉制品相關(guān)標準中微生物限量要求

肉及肉制品的營養(yǎng)成分適宜微生物的生長繁殖，微生物數(shù)量也是肉及肉制品相關(guān)標準中的重要衛(wèi)生指標和安全指標，相關(guān)標準中對微生物的限量要求如表1～2所示。

表 1 肉類（原料肉）相關(guān)標準中的微生物限量要求Table 1 Microbial limit requirements specified in meat standards

表 2 肉制品相關(guān)標準中的微生物采樣方案及限量要求Table 2 Microbial sampling scheme and limit requirements specified in processed meat standards

由表1～2可知，對肉及肉制品有限量要求的微生物種類包括菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌（O157:H7）、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和單核細胞增生李斯特氏菌，其中菌落總數(shù)和大腸菌群代表產(chǎn)品的衛(wèi)生情況，在鮮牛肉、肉松、肉脯、火腿腸、熏煮火腿、熏煮香腸等產(chǎn)品標準中為出廠檢驗指標，每批次均需檢驗合格后方能出廠。

2 傳統(tǒng)微生物檢測方法

傳統(tǒng)微生物檢測采用食品安全國家標準食品微生物檢驗4789系列標準，如GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》、GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.6—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》、GB 4789.36—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》、GB 4789.5—2012《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 志賀氏菌檢驗》、GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.11—2014《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 β型溶血性鏈球菌檢驗》及GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》。通常需提前配制稀釋管、培養(yǎng)基，對使用的稀釋管、培養(yǎng)基和相關(guān)耗材進行高壓滅菌，經(jīng)樣品處理、稀釋、加樣、培養(yǎng)、計數(shù)等環(huán)節(jié)才能得到檢測結(jié)果，通常需2 d以上，操作費時費力。為能得到準確結(jié)果的同時縮短檢測時間、降低檢測成本，研究人員開發(fā)了新型的微生物檢測技術(shù)。

3 肉及肉制品微生物檢測新技術(shù)

3.1 快速測試片法

快速測試片法是將培養(yǎng)基系統(tǒng)預(yù)先制備在測試片上，微生物菌落在測試片上呈紅色或粉紅色，可增強微生物計數(shù)效果。趙立冬等分別使用快速測試片法與 GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》檢測熟肉樣品、人工污染熟肉樣品的菌落總數(shù)結(jié)果一致性，發(fā)現(xiàn)2 種方法檢測結(jié)果相關(guān)系數(shù)分別為0.897、0.964，檢測結(jié)果一致性較好?？焖贉y試片法與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法原理相同，但該方法無需提前配制培養(yǎng)基、稀釋液，檢測步驟較少、效率高，培養(yǎng)時間僅需24 h，可大幅節(jié)省檢測時間，同時可節(jié)省菌落總數(shù)檢測過程中的時間和人力成本，目前已形成成熟的商業(yè)化產(chǎn)品。

3.2 ATP生物熒光法

ATP廣泛存在于生物活體內(nèi)，且每個微生物活菌細胞中均有含量近似的ATP，熒光素酶是一種生物活性催化劑，可將ATP的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。ATP在具備熒光素酶、氧氣、鎂離子的環(huán)境中可與熒光素反應(yīng)產(chǎn)生熒光，熒光強度與ATP含量呈線性關(guān)系，通過檢測生物熒光即可間接獲得菌落總數(shù)。黃彬等優(yōu)化肉及肉制品中微生物ATP提取方法，分別采用十六烷基三甲基溴化銨和-環(huán)糊精為微生物細胞ATP的提取劑和中和劑，發(fā)現(xiàn)當(dāng)肉制品中微生物濃度為10～10CFU/mL時測得的發(fā)光強度對數(shù)值與平板計數(shù)結(jié)果對數(shù)值相關(guān)系數(shù)為0.929 1，可用于實際檢測，但因無法排除體細胞ATP的影響而不適用于原料肉的菌落總數(shù)檢測。

3.3 分子診斷法

3.3.1 多重實時聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法

多重實時PCR是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上加入多對特異性引物，通過DNA聚合酶催化及堿基配對實現(xiàn)對引物界定的DNA樣品中不同序列擴增，具有檢測通量高、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢，近年來發(fā)展迅速。Elisa等利用多重實時PCR方法同步檢測肉制品中沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7和單核細胞增生李斯特氏菌，若樣品中只含有這3 種致病菌中的一種，則檢測限可達10 CFU/g， 若樣品中有3 種致病菌，則檢測限為10CFU/g。范維等使用多重實時PCR的方法同步檢測散裝即食肉制品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌，增菌5 h后，3 種微生物的檢出限分別達到3.8、4.9、5.7 CFU/mL。 熊蘇玥等利用多重實時PCR方法同步檢測香腸中的金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7及霉菌，5 種致病微生物在20 h內(nèi)的檢出限均可達100 CFU/25 g。Nguyen等先將雞肉中沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7與單核細胞增生李斯特氏菌增菌12 h，再使用多重實時PCR檢測，與不增菌直接檢測相比可將檢出限降低1 個數(shù)量級。閆琳等將人為接種沙門氏菌的禽肉增菌12 h后，再利用多重實時PCR檢測，檢出限可低至100 CFU/25 g。由此可見，多重實時PCR檢測微生物，尤其是致病菌的高靈敏度是建立在增菌培養(yǎng)處理的前提下，增菌時間越長，靈敏度越高，實際檢測過程中需根據(jù)樣品情況在檢測時間和檢測限二者間進行平衡。

3.3.2 等溫擴增技術(shù)

等溫擴增技術(shù)僅需簡單的恒溫儀器既可實現(xiàn)核酸體外擴增，已成為PCR擴增技術(shù)的替代性選擇，包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、滾環(huán)擴增、單引物擴增等技術(shù)。 Ledlod等開發(fā)了基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)和雙向側(cè)流試紙相結(jié)合的方法，可在45 min內(nèi)快速檢測肉品中單核細胞增生李斯特氏菌，檢出限達20 CFU/g。Chen Xingxing等開發(fā)了基于等溫擴增技術(shù)的豬肉制品金黃色葡萄球菌快檢方法，檢出限達50 CFU/mL。等溫擴增技術(shù)的缺點在于對引物設(shè)計的要求較高，同時易形成氣溶膠，造成假陽性，影響檢測結(jié)果。

3.4 免疫分析法

3.4.1 膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是一種以膠體金作為標記物應(yīng)用于檢測特定抗原或抗體的一種新型免疫標記技術(shù)。膠體金在弱堿性環(huán)境下帶負電荷，可與帶正電荷基團的蛋白質(zhì)分子、伴刀豆球蛋白A、植物血漿凝集素、萄球菌A蛋白等生物大分子結(jié)合，在顯微鏡下呈黑褐色，若有大量結(jié)合物聚集則用肉眼即可觀察到粉紅斑點，可用于定性或半定量的快速免疫檢測。劉志科等開發(fā)出雞白痢沙門氏菌膠體金免疫層析快速檢測試紙條，與其他病原菌無交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果與平板凝集實驗符合率達到96.4%。Song Chunmei等成功研制出一種膠體金免疫層析試紙條，用于快速檢測肉凍等食品中志賀氏菌和大腸桿菌O157:H7。膠體金免疫層析技術(shù)的缺點在于無法實現(xiàn)高通量檢測，且其準確性高度依賴抗體的特異性。

3.4.2 熒光量子免疫試紙條法

熒光量子表面具有不同的官能團，通過修飾即可與抗體等生物大分子偶聯(lián)，同時熒光量子點具有穩(wěn)定性好、熒光強度高等特點，可提高免疫層析試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性。朱芳茜等利用自制的量子點偶聯(lián)志賀氏菌單克隆抗體，研制了一種可視化檢測志賀氏菌的量子點免疫熒光試紙條，該試紙條在豬肉、火腿腸等樣品中的檢測限為1×10CFU/mL，單樣品檢測時間為15 min。熒光量子免疫試紙條法的缺點在于檢測限較高，目前仍無法滿足肉制品中致病菌的檢測限量要求。

3.5 光譜檢測

3.5.1 近紅外光譜法

近紅外光譜波長為780～2 526 nm，是介于可見光與中紅外光之間的電磁波，可反映分子化學(xué)鍵基頻振動的倍頻和合頻吸收，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法（如偏最小二乘法）可實現(xiàn)快速、無損、多組分同步檢測含氫官能團的有機物，已廣泛應(yīng)用于豬胴體、鮮豬肉、鮮牛肉及凍牛肉、鮮羊肉、鮮雞肉、羊肉卷、牛肉漢堡餅等肉及肉制品的檢測。Alexandrakis等利用近紅外光譜法可定性識別雞胸肉中是否含李斯特菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌和大腸桿菌。Argyri、Panagou等采用傅里葉變換紅外光譜建立了冷卻牛肉腐敗程度預(yù)測模型，新鮮、半新鮮、腐敗冷卻牛肉識別準確率分別達到91.7%、81.2%和94.1%，并可直接預(yù)測菌落總數(shù)。Grau等開發(fā)了基于短波近紅外光譜技術(shù)的包裝切片雞胸肉新鮮度快速定性檢測技術(shù)，可與腐敗特征指標菌落總數(shù)的指示作用保持一致。

3.5.2 表面增強拉曼光譜法

光束照射到物體表面時出現(xiàn)的少部分折射光方向和波長均發(fā)生變化的散射為拉曼光譜。不同的被照射物質(zhì)分子中的官能團各不相同，由此產(chǎn)生振動的拉曼光譜可提供分子結(jié)構(gòu)信息，從而實現(xiàn)對被照射物質(zhì)的快速檢測。但是拉曼光譜易受干擾，導(dǎo)致信號較弱，通過貴金屬表面糙化處理可使拉曼信號增強，這種現(xiàn)象被稱為表面增強拉曼，可實現(xiàn)痕量物質(zhì)的快速檢測。Ma Xiaoyuan等在多刺納米金粒子上修飾巰基化適配體作為表面增強拉曼納米探針，檢測豬肉樣品中的沙門氏菌，檢測限為4 CFU/mL，加標回收率為96.55%～105.45%。Zhang Hui等利用適配體固定化磁性納米金粒子捕獲豬肉樣品中的金黃色葡萄球菌，經(jīng)優(yōu)化后表面增強拉曼法檢出限為35 CFU/mL，加標回收率為94.12%～102.75%。拉曼光譜也可反映肉中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，從而反映肉的腐敗變質(zhì)程度。

3.5.3 高光譜成像技術(shù)

高光譜成像技術(shù)是一種光譜和圖像融合的光電檢測技術(shù)，能同時反映樣品內(nèi)外部的信息，光譜波段覆蓋了紫外、近紅外、可見光區(qū)域，分辨率可達納米級別，是一種融合光學(xué)、計算機、信號處理學(xué)的檢測技術(shù)。Peng Yankun等開發(fā)基于高光譜成像系統(tǒng)的豬肉菌落總數(shù)檢測技術(shù)，使用逐步判別法篩選出可表征菌落總數(shù)的5 個最佳波長，通過最小二乘支持向量機建立了理想的預(yù)測模型。郭中華等開發(fā)了可檢測羊肉表面菌落總數(shù)的高光譜成像系統(tǒng)，經(jīng)優(yōu)化的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)系數(shù)可達0.998 8。趙俊華等利用高光譜成像技術(shù)開發(fā)臘肉菌落總數(shù)的定量分析技術(shù)，校正集和預(yù)測集相關(guān)系數(shù)分別為0.808和0.798。李文采等以市售冷藏雞胸肉為研究對象，建立基于高光譜成像技術(shù)的菌落總數(shù)快速預(yù)測模型，校正集和驗證集相關(guān)系數(shù)分別為0.93和0.86。 王偉等以生鮮豬肉為研究對象，選用最小二乘支持向量機的建模方法構(gòu)建基于高光譜成像技術(shù)的細菌總數(shù)預(yù)測模型，與標準平板菌落總數(shù)記數(shù)法所檢測的細菌總數(shù)相關(guān)系數(shù)達到0.94以上。

光譜法對肉及肉制品中有機物含量有較好的預(yù)測效果，同時具有一定的定性判別能力，但目前光譜類設(shè)備價格較高，未開發(fā)出針對不同產(chǎn)品基質(zhì)的微生物檢測專用設(shè)備，且多為預(yù)測方法，仍需對其預(yù)測準確性進行大量驗證才可進行實際應(yīng)用。

3.6 儀器法

3.6.1 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)是融合流體力學(xué)、激光學(xué)、熒光染色科學(xué)和計算機科學(xué)的細胞分析技術(shù)，具有快速、多指標、分析全面等特點。隨著流式細胞術(shù)在各領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越多，商品化的流式細胞儀也越來越成熟。微生物通常由分析型的流式細胞儀檢測，該設(shè)備包括液流系統(tǒng)、光路檢測系統(tǒng)和檢測分析系統(tǒng)，將待測樣品制成單細胞懸液，經(jīng)液流系統(tǒng)進入光路檢測系統(tǒng)，細胞在激光照射下發(fā)生散射和折射，產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號由不同的通道接收，經(jīng)計算機分析處理得出檢測結(jié)果。 黃韻分別采用Guava EasyCyte 6-2 L流式細胞儀和平板計數(shù)法對冷鮮肉中的單增李斯特菌進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌在4 ℃冷鮮肉中經(jīng)過16 d培養(yǎng)后流式細胞儀和平板計數(shù)法檢測結(jié)果分別為5.4×10、5.3×10CFU/g， 二者結(jié)果十分接近。流式細胞術(shù)的缺點在于只能對細胞等生物分子進行分析檢測，肉及肉制品等食品中不同基質(zhì)需使用不同的熒光染料標記，存在熒光信號重疊的可能性，會降低檢測準確性。

3.6.2 電化學(xué)法

微生物在培養(yǎng)過程中，生理代謝作用使培養(yǎng)基的電惰性物質(zhì)（如碳水化合物、類脂、蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)化為電活性物質(zhì)，大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，體系的阻抗降低，因此可以通過測定體系中電流或電位的變化規(guī)律，構(gòu)建電流或電位與微生物濃度的關(guān)系模型，進而測定出體系中微生物的濃度。這種方法具有測定快速、直觀、操作簡單、測定設(shè)備成本低和信號可控等特點。 劉飛等依據(jù)微生物呼吸作用的電子傳遞規(guī)律，采用原電池的工作原理，開發(fā)基于電化學(xué)法的冷鮮肉中菌落總數(shù)快速預(yù)測技術(shù)，預(yù)測值和實測值的差異（預(yù)測值和實測值差值的絕對值與其平均值的比率）在15%以內(nèi)。

4 結(jié) 語

食品安全法規(guī)定，食品應(yīng)檢驗合格后方可出廠或銷售，而傳統(tǒng)微生物檢測方法檢驗周期較長，菌落總數(shù)和大腸菌群2～3 d、食源性致病菌3～5 d，對鮮牛肉、熏煮香腸等保質(zhì)期較短且出廠必須檢測微生物的肉及肉制品造成了極大的流通壓力和經(jīng)濟損失，因此微生物檢測新技術(shù)和儀器在肉類領(lǐng)域具有巨大的市場需求。本文綜述6 種類型、11 種肉及肉制品微生物檢測新技術(shù)的研究進展，多數(shù)具備節(jié)省檢測時間的優(yōu)勢，滿足了肉類企業(yè)縮短檢測周期的需求，但多數(shù)檢測方法仍停留在實驗室研究階段，存在實際檢測應(yīng)用對比數(shù)據(jù)偏少、儀器商品化程度低等問題，建議加強檢測新技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法在實際樣品檢測應(yīng)用中的比對工作，改進檢測方法細節(jié)，進一步提高檢測準確率，同時推動新技術(shù)的標準化，加快新技術(shù)與設(shè)備在實際檢測中的應(yīng)用。