百蕊草LRR-RLKs基因的鑒定與生物信息學分析

張文香 常子麗 李芳 楊香香 丁波 曹劍鋒

摘 要 以百蕊草（Thesium chinense Turcz）為材料，根據(jù)硝酸銀誘導的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，PCR克隆到兩條LRR-RLK基因，通過測序、生物信息學分析、熒光定量PCR等技術對兩條基因進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，兩條基因全長分別為1 278 bp與2 115 bp，分別編碼425和704個氨基酸，命名為TcLRR1和TcLRR2;TcLRR1與擬南芥EFR基因一致性最高，TcLRR2與水稻Xa21一致性最高;TcLRR2具有完整的LRR-RLK蛋白結構（亮氨酸重復域、信號肽、跨膜結構域、激酶域），而TcLRR1缺乏激酶域;TcLRR1與TcLRR2在非脅迫條件下的組織表達模式一致，都在葉片中表達最高。綜上所述，TcLRR2可作為百蕊草抗逆相關的LRR-RLK候選基因進行后續(xù)的深入研究。

關鍵詞 百蕊草;基因;LRR-RLK;TcLRR1;TcLRR2;生物信息學

中圖分類號：Q343.1+2 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.09.001

收稿日期：2022-01-22

基金項目：貴州省科技廳自然科學研究基金項目（黔科合基礎〔2016〕1415，黔科合基礎〔2018〕1117）;貴州省科技廳平臺人才項目（黔教合KY字〔2017〕5790-06）;貴州林業(yè)科技項目（黔科合林〔2017〕01號）;貴州省教育廳生物科學一流專業(yè)項目（〔2019〕46）。

作者簡介：張文香（1984—），女，河北武邑人，博士，副教授，研究方向為植物栽培與植物生理。E-mail：zwx26_2006@126.com。

*為通信作者，E-mail：caojianfeng@gznc.edu.cn。

植物中的受體主要有雙元系統(tǒng)、受體激酶兩種，廣泛參與植物的生長、發(fā)育、脅迫、免疫等過程。受體激酶具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)三部分，根據(jù)胞外區(qū)結構的不同又可分為三種類型：含S結構域的、富亮氨酸重復的、類表皮生長因子的[1]。其中，富亮氨酸重復的類受體蛋白激酶最多，此類受體的胞外區(qū)域一般具有多個富亮氨酸重復序列，具有與配體結合的功能。目前已在多種植物如擬南芥、玉米、水稻、橘類、大豆、薔薇科中鑒定出編碼此類受體的基因，最早是在玉米中鑒定出來的[2]。

百蕊草（Thesium chinense Turcz）是檀香科（Santalaceae）多年生半寄生草本植物，具有清熱解毒、解暑的功效，在我國有著悠久的被用于疾病治療的歷史。百蕊草具有較強的抗菌消炎作用，通常用于治療炎癥相關疾病，是優(yōu)秀的廣譜抗菌中藥材，被譽為“天然抗生素”。對百蕊草粗提物和純化成分的藥理作用和臨床應用研究證實，百蕊草具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制腫瘤細胞增殖等多種藥理作用[3-5]。百蕊草的植物化學成分研究表明，百蕊草中含有黃酮類、生物堿、多糖等成分，其中黃酮類是其重要的指標性成分，在植物的生長、發(fā)育、繁殖和防御中起著多種生理作用。目前對于百蕊草的研究主要在栽培、代謝產(chǎn)物分離與提純等方面，在分子水平對其生長調(diào)控機理的研究還較少。本研究根據(jù)噴施硝酸銀（1 mmol·L-1）處理及對照轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)，篩選出了被硝酸銀誘導高調(diào)表達的富亮氨酸類受體蛋白激酶基因，對其結構與功能進行分析，旨在為從分子水平研究百蕊草的次級代謝和抗逆性提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

百蕊草樣品采自于貴陽市烏當區(qū)東風鎮(zhèn)試驗基地（106°81′ E， 26°64′ N），挑選野外自然生長處于初果期，長勢、大小和生理狀態(tài)基本一致的百蕊草植株作為實驗植株，采取根、莖、葉組織，迅速凍于液氮。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 基因的鑒定和克隆

根據(jù)本實驗室百蕊草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6]拼接序列獲得6 878 bp的序列，通過ORFFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析工具，預測完整的開放閱讀框（Open Reading Frame），并進行blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）在線搜索比對，初步確定基因類型。對通過在線預測得知的兩個較長的ORF （Open Reading Frame），分別為1 278 bp（ORF1）和2 115 bp（ORF2）進行克隆，利用 Primer Premier 5 軟件設計特異引物，ORF1上游引物為 ORF1-F：5′-ATGAACAAACCCTACGTTATAG GTC-3′，下游引物為 ORF1-R：5′-TCAAATACCTGA CAGGTGGTTATCA-3′;ORF2上游引物為：5′-ATGCTCACCATGCTTGACATGCCTGC-3′，下游引物為：5′-CTACTCTCTTCCCGTGTCCTTGATAA-3′。

引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 第 1 鏈為模板 進行 PCR 擴增，50 μL 的 PCR 反應體系包含 25 μL Premix PrimeSTAR HS （TaKaRa） DNA 聚合酶，上、下游 引 物 （ 10 μmol·L-1） 各 2.5 μL，cDNA 模 板1 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應程序為： 98 ℃預變性 2 min;98 ℃變性 10 s，60 ℃退火 10 s，68 ℃延伸 60 s，30 個循環(huán);最后 68 ℃ 延伸 6 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠純化回收。回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，采用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆并測序。

1.2.2? RNA提取與cDNA合成

采用生工生物的UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（B511321）提取百蕊草總RNA，采用Thermo Scientific的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EP0743）進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3? 生物信息學分析

在HMMER網(wǎng)站https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan進行結構域預測;選擇http：//web.expasy.org/網(wǎng)址中的ProtParam工具進行理化性質(zhì)分析，包括分子量、等電點、親水性、穩(wěn)定性等。在http：//www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html網(wǎng)站進行信號肽、跨膜結構的預測，在http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網(wǎng)站進行磷酸化位點預測分析。

1.2.4? 進化樹分析

以模式植物擬南芥LRR-RLK基因，以及TcLRR1和TcLRR2的蛋白質(zhì)全長序列構建進化樹，擬南芥LRR-RLK蛋白序列及構建方法與參數(shù)選擇參考Wang等[7]。

1.2.5? 熒光定量PCR

以初果期百蕊草的根、莖、葉cDNA為模板，以18SRNA為內(nèi)參基因，選用ABI的熒光定量PCR試劑盒（B639273），在StepOne Plus型熒光定量PCR儀 （ABI， Foster， CA， USA）上進行擴增。

內(nèi)參基因引物序列為：

18SRNA-F? 5′ TTCTTAGTTGGTGGAGCGATTT3′

18SRNA-R? 5′ CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC3′

目的基因引物序列為：

TcLRR1-F? 5′CTTTCGGGTGTCATTCCTCC3′

TcLRR1-R? 5′TCTGAAAAGGTCTCTTGGGATACT3′

TcLRR2-F? 5′AATAACTCTTGCCACTGTAGGGT3′

TcLRR2-R? 5′ATTTCATCCGTTGGCTTCC3′

反應體系為：上下游引物（10 μM）各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，酶（SybrGreen qPCR Master Mix）10 μL，最后加ddH2O到20 μL。擴增45個循環(huán)。

2? 結果與分析

2.1? 基因鑒定與分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接得到6 878 bp的序列，通過在線預測得知有兩個較長的ORF （Open Reading Frame），設計PCR引物進行克隆驗證，經(jīng)過測序，確定兩條序列分別為1 278 bp（ORF1）和2 115 bp（ORF2）（見圖1），分別編碼425和704個氨基酸（見圖2）。將翻譯得到的蛋白序列在線進行blast比對，發(fā)現(xiàn)ORF1的蛋白序列與擬南芥富亮氨酸類受體蛋白激酶EFR（At5g20480）、GSO1（At4g20140）、At3g47570一致性較高（見圖3a）;ORF2的蛋白序列與水稻的類受體蛋白激酶Xa21及擬南芥At3g47570、EFR（At5g20480）一致性較高（見圖3b）。通過HMMSCAN在線分析保守結構域，發(fā)現(xiàn)ORF1蛋白序列分別在121aa-181aa、338aa-398aa位具有一個亮氨酸富集區(qū)域（Leucine-rich repeat），不具有激酶結構域;而ORF2蛋白序列在248-308aa具有重復亮氨酸區(qū)域，在418-689aa具有激酶結構域（protein kinase domain）（見圖4）。由于兩個蛋白序列都具有富亮氨酸重復序列，因此將編碼ORF1的基因命名為TcLRR1，編碼ORF2的基因命名為TcLRR2。

2.2? TcLRR1/2蛋白的理化性質(zhì)分析

TcLRR1的分子量為46 458.17，等電點為5.97，全長425個氨基酸，其中帶負電荷的氨基酸為26個，帶正電荷的氨基酸20個，脂肪系數(shù)110.75，平均親水系數(shù)0.101，不穩(wěn)定系數(shù)26.77，為穩(wěn)定蛋白;TcLRR2的分子量為77 780.84，等電點為6.48，全長704個氨基酸，其中帶負電荷的氨基酸68個，帶正電荷的氨基酸64個，脂肪系數(shù)103.44，平均親水系數(shù)0.064，不穩(wěn)定系數(shù)33.48，為穩(wěn)定蛋白。

2.3? 結構預測

在線對兩條基因的跨膜結構進行了預測，發(fā)現(xiàn)TcLRR1序列1～24位為信號肽序列，沒有跨膜結構，預測其序列為胞外序列;TcLRR2序列1～28位為信號肽，357-377aa為跨膜區(qū)域，378-704aa位于膜內(nèi)，29-356aa位于膜外。

2.4? 磷酸化位點預測

在線進行磷酸化位點預測，發(fā)現(xiàn)TcLRR1共具有46個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）位點最多，為31個;其次是蘇氨酸（T）位點，為10個;酪氨酸（T）位點5個（見圖5a）。TcLRR2共具有89個磷酸化位點，其中絲氨酸（S）位點最多，為62個;其次是蘇氨酸（T）位點，為17個;酪氨酸（T）位點10個（見圖5b）。

2.5? 序列比對與進化樹分析

通過TcLRR1與TcLRR2序列比對發(fā)現(xiàn)，二者一致性僅16.09%。將兩者與擬南芥LRR-LRKs構建進化樹，發(fā)現(xiàn)TcLRR1屬于VI-1亞組，TcLRR2屬于XII-1亞組，TcLRR1與blast比對的At3g47570、At5g20480及At4g20140都未聚在同一亞組（見圖6）;TcLRR2與At3g47570和At5g20480（EFR）聚為同一亞組，與blast結果一致。

2.6? 基因表達模式分析

在非脅迫條件下，以初果期的根、莖、葉為材料，選擇葉片作為對照研究了TcLRR1和TcLRR2基因的相對表達模式，發(fā)現(xiàn)TcLRR1和TcLRR2在葉片中的表達量最高，在莖和根中的表達量低且兩者差異不明顯（見圖7）。

3? 結論與討論

近年來，高通量轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為研究基因表達調(diào)控的主要手段，廣泛應用于藥用植物新基因的發(fā)現(xiàn)、代謝途徑的確定，以及基因家族鑒定、進化分析等方面。百蕊草是優(yōu)良的抗炎抗菌藥材，其中百蕊草素等黃酮類成分為主要活性成分，前期本課題組通過體外使用非生物誘導因子硝酸銀對百蕊草植株進行誘導后，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序研究百蕊草黃酮等化合物的次生代謝途徑、關鍵基因的表達調(diào)控等，通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序在獲得大量次生代謝相關序列信息的同時也獲得了包括LRR家族在內(nèi)的一些基因家族序列信息[6]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)，調(diào)取差異表達的6 878 bp的序列進行分析，獲得兩個具有較長開放閱讀框的序列，blast比對結果表明二者都屬于LRR-RLKs，分別命名為TcLRR1和TcLRR2。對結構域與跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，TcLRR1蛋白缺乏跨膜區(qū)與激酶區(qū)，屬于不完全的LRR-RLKs蛋白，TcLRR2具有較長ORF，具有完整的LRR-RLKs基因的結構。進一步對兩個基因的蛋白結構進行比對，發(fā)現(xiàn)TcLRR1在C端具有很長的缺失，因此推測TcLRR1可能不具有受體激酶的功能，其在植物體內(nèi)存在的意義還需進一步驗證。

不同物種LRR基因的核酸序列差異較大，同源性較低，但是LRR基因編碼的氨基酸序列具有相似的結構和功能[8]。TcLRR2基因結構較完整，blastp比對發(fā)現(xiàn)它與水稻Xa21的一致性最高，而水稻Xa21基因與水稻的免疫性有關[9]，因此猜測TcLRR2可能與百蕊草的抗逆性有關。目前通過轉(zhuǎn)錄組測序并進行PCR驗證，獲得了兩個LRR基因序列，說明百蕊草與其他植物一樣存在著LRR基因家族[10-11]。植物抗性基因作為防衛(wèi)系統(tǒng)的一員，在沒有外界脅迫影響時表達量很低，當有激發(fā)子或誘導子誘導時，抗性基因能高表達，植物能夠識別并激活抗病信號傳導途徑產(chǎn)生防衛(wèi)反應?？剐曰蛟诓煌M織的表達也有差異性[12]，本研究通過熒光定量的方法對這兩個基因在根、莖及葉中的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)TcLRR1與TcLRR2表達趨勢一致，都是在葉片中表達量最高，莖和根中的表達量低且差異不明顯，表明該家族基因在百蕊草中可能存在組織特異性表達的特點，推測葉在逆境信號感知中更為敏感和重要。同時，TcLRR1與TcLRR2兩者蛋白序列一致性僅為16.09%，對于功能域不完整的TcLRR1來說，其表達的機理與意義還有待進一步驗證。

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（責任編輯：丁志祥）