小個(gè)頭有大能量：微生物開(kāi)啟固定CO₂新篇章

劉開(kāi)放 劉立明

CO是地球上最主要的溫室氣體，但同時(shí)也是自然界最為豐富的碳一資源（如CO、甲酸、甲醇等含有一個(gè)碳原子的物質(zhì)，可當(dāng)作資源被利用）。因此，若能發(fā)展高效的CO捕集和轉(zhuǎn)化技術(shù)，將其轉(zhuǎn)化成酯、醇、醚、酸等具有高應(yīng)用價(jià)值和高經(jīng)濟(jì)效益的化學(xué)產(chǎn)品，溫室效應(yīng)等問(wèn)題或?qū)㈦S之得到改善。

CO捕集和轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為物理、化學(xué)和生物3種。物理固定技術(shù)是對(duì)CO進(jìn)行分離、收集和濃縮，再將其輸送至地下或深海中實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)存，但很容易受地殼運(yùn)動(dòng)的影響，繼而發(fā)生CO泄漏，造成新的生態(tài)問(wèn)題?；瘜W(xué)固定方法則是以CO為底物生產(chǎn)化工產(chǎn)品，或?qū)⑵洳迦牖瘜W(xué)鍵中制備有機(jī)物，然而該過(guò)程會(huì)消耗大量的試劑，并產(chǎn)生多種新的副產(chǎn)物。而通過(guò)模擬植物光合作用開(kāi)發(fā)的微生物細(xì)胞捕集和轉(zhuǎn)化CO的技術(shù)體系，具有運(yùn)行成本低、安全性高等特點(diǎn)，為CO高效封存提供了一種可持續(xù)發(fā)展的新方法。但要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，核心在于改造微生物，進(jìn)而直接利用CO和光能合成高值化學(xué)品，為此需要解決兩個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題：如何設(shè)計(jì)高效的CO固定途徑，如何為CO固定提供充足的能量。

自然界存在著兩大類(lèi)固定CO的微生物，一類(lèi)是自養(yǎng)型，另一類(lèi)是異養(yǎng)型。

自養(yǎng)型固碳微生物具有完善的能量捕獲系統(tǒng)，能利用CO為唯一碳源生長(zhǎng)。根據(jù)能量捕獲途徑的不同，自養(yǎng)型微生物又可分為光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型。

光能自養(yǎng)型主要是微藻類(lèi)、光合細(xì)菌和藍(lán)藻等。其中，微藻的光能利用率可達(dá)10%～15%，每年可固定全球40%以上的CO，在碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用；光合細(xì)菌能將CO轉(zhuǎn)化為多種化合物，模式菌株包括類(lèi)球紅細(xì)菌、莢膜紅菌和沼澤紅假單胞菌等，每克菌體在單位小時(shí)內(nèi)的固碳量可達(dá)12.4 毫克；藍(lán)細(xì)菌具有較強(qiáng)的光合系統(tǒng)，能吸收廣泛的太陽(yáng)光波長(zhǎng)，光能利用率可達(dá)10%以上，是陸生植物的10倍，模式菌株包括聚球藻、魚(yú)腥藻和集胞藻等。

化能自養(yǎng)型微生物，如鐵細(xì)菌、一氧化碳細(xì)菌、硫氧化細(xì)菌和硝化細(xì)菌等，則是通過(guò)氧化亞鐵化合物、硫化氫、亞硝酸鹽等有機(jī)物產(chǎn)生電子，再經(jīng)過(guò)電子傳遞鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷和還原態(tài)輔酶Ⅰ，驅(qū)動(dòng)CO固定。

異養(yǎng)型固碳微生物主要利用自身的固碳酶來(lái)固定CO，具有生長(zhǎng)速度快、易放大和遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)?？茖W(xué)家們?cè)?0世紀(jì)初就發(fā)現(xiàn)了戊糖丙酸桿菌中存在固碳途徑，隨后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、釀酒酵母和谷氨酸棒狀桿菌等都具有一定的固碳能力。但是，天然異養(yǎng)微生物存在固碳效率低、能量供應(yīng)不足等缺點(diǎn)，導(dǎo)致難以大規(guī)模應(yīng)用。因此，通過(guò)合成生物學(xué)的技術(shù)手段改造異氧微生物，能顯著提升其固碳能力，如工程化改造大腸桿菌BL21（DE3），可使其固碳效率與藍(lán)藻相當(dāng)；通過(guò)代謝工程改造釀酒酵母YSX4C222，可將固碳效率提高75倍。由此可見(jiàn)，微生物展現(xiàn)出強(qiáng)大的固碳潛力，在CO利用方面大有可為。

科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微生物中存在7條天然固碳途徑，根據(jù)代謝特點(diǎn)和固碳種類(lèi)可分為三大類(lèi)。

第一類(lèi)是磷酸戊糖途徑相關(guān)的卡爾文循環(huán)。CO進(jìn)入該循環(huán)，在酶和能量的催化驅(qū)動(dòng)下形成糖。雖然它是最普遍的固碳途徑，但關(guān)鍵酶二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）存在效率低和易發(fā)生副反應(yīng)等缺點(diǎn)。近幾年來(lái)，隨著關(guān)鍵酶Rubisco晶體結(jié)構(gòu)被解析，結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬和蛋白質(zhì)改造策略，能顯著提高其催化性能。2019年，這一途徑被引入大腸桿菌中，獲得了能同時(shí)利用CO和木糖的工程菌，隨后利用適應(yīng)性進(jìn)化的方法，逐步消除工程菌對(duì)木糖的依賴，得到了僅利用CO為唯一碳源就能生長(zhǎng)的自養(yǎng)菌[3]。

第二類(lèi)是直接還原CO的還原乙酰輔酶A途徑和還原性甘氨酸途徑。它們都是首先將一部分CO還原為甲酸，然后再同化另一部分CO生成碳二化合物（如乙醇、乙醛和乙酸等含有兩個(gè)碳原子的化合物）。但還原乙酰輔酶A途徑是厭氧途徑，限速酶分別是甲酸脫氫酶、一氧化碳脫氫酶和呋喃脫氫酶；而還原性甘氨酸途徑則是耐氧途徑，限速酶是甘氨酸裂解酶復(fù)合體。

第三類(lèi)是靠近碳中心代謝的4條固碳循環(huán)途徑：①能同時(shí)固定CO和HCO3？的二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)。它們先通過(guò)丙酮酸合酶固定1摩爾CO，再通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶固定1摩爾HCO3？。由于其限速酶4-羥基丁酰輔酶A脫水酶中含有氧不穩(wěn)定的鐵硫中心，所以為厭氧途徑；②僅固定HCO3？的3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán) 和3-羥基丙酸循環(huán)。它們具有高耗能、長(zhǎng)路徑的特點(diǎn)，可通過(guò)乙酰輔酶A和丙酰輔酶A羧化酶固定HCO3？；③僅固定CO的還原三羧酸循環(huán)。含有3種不可逆的酶：富馬酸還原酶、2-酮戊二酸合成酶和檸檬酸合成酶，其中，2-酮戊二酸合成酶是重要的固碳元件。該途徑為低耗能的耐氧途徑，能利用光能使每個(gè)循環(huán)固定CO。

上述7條天然路徑由于反應(yīng)復(fù)雜、效率較低等原因，難以滿足實(shí)際需求。因此科學(xué)家們開(kāi)始設(shè)計(jì)和構(gòu)建人工固碳途徑：①理論設(shè)計(jì)。借助生物信息學(xué)和基因組網(wǎng)絡(luò)模型，通過(guò)計(jì)算路徑反應(yīng)的自由能、熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)等，評(píng)估路徑可行性。②固碳元件選取。從BRENDA、KEGG和UNIPORT等數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘固碳路徑中的固碳羧化酶和固碳還原酶，并進(jìn)行生物化學(xué)和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定。③固碳元件改造。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確定固碳路徑的限速酶，并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，提高固碳效率。④固碳路徑構(gòu)建。將最優(yōu)固碳元件進(jìn)行體內(nèi)組裝和優(yōu)化，提高固碳途徑的效率。

根據(jù)這些原則，國(guó)外科學(xué)家們以羧化酶為起點(diǎn)，篩選了17個(gè)固碳元件，構(gòu)建了能量消耗減少40%而CO轉(zhuǎn)化速率可提高兩倍的循環(huán)途徑。另有國(guó)內(nèi)學(xué)者設(shè)計(jì)了一個(gè)可以在厭氧和50℃條件下固定CO的簡(jiǎn)易人工固碳循環(huán)（POAP循環(huán)），其反應(yīng)過(guò)程僅需4種酶，實(shí)現(xiàn)了高效固碳。此外，還有研究者借助計(jì)算機(jī)輔助挖掘，設(shè)計(jì)了新型固碳途徑，用于改善大腸桿菌的生長(zhǎng)。為了將人工途徑與微生物生產(chǎn)相偶聯(lián)，筆者團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一條產(chǎn)生ATP的蘋(píng)果酸合成途徑（PCK途徑），通過(guò)耦合耗能的CO固定途徑和產(chǎn)能的PCK途徑，開(kāi)發(fā)了能量平衡的蘋(píng)果酸合成系統(tǒng)，使CO固定率提高了870%，蘋(píng)果酸產(chǎn)量達(dá)到387毫摩爾每升[4]。

除了構(gòu)建人工固碳途徑外，給予充足的能量供應(yīng)也是提高微生物固碳效率的關(guān)鍵瓶頸。為此，科學(xué)家們借助合成生物學(xué)的技術(shù)策略，分別針對(duì)自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物發(fā)明了多種供能方法，以此提升CO的固定效率[6]。

對(duì)于光能自養(yǎng)型微生物，可通過(guò)改造捕光天線核心蛋白和構(gòu)建新型納米材料組成的捕光系統(tǒng)，增強(qiáng)光合作用的半飽和強(qiáng)度和光子捕獲能力，提高光子轉(zhuǎn)換為質(zhì)子和電子的能力，促進(jìn)能量產(chǎn)生。而對(duì)于化能自養(yǎng)微生物，主要通過(guò)改造膜相關(guān)氧化還原蛋白，如MtrB和CymA，以及過(guò)表達(dá)銅藍(lán)蛋白等無(wú)機(jī)氧化酶，來(lái)提高電子產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的效率，獲得能量供應(yīng)。對(duì)于電自養(yǎng)微生物（利用電能驅(qū)動(dòng)碳固定，滿足自身生長(zhǎng)需要的微生物），則主要通過(guò)優(yōu)化陰極電極的結(jié)構(gòu)或開(kāi)發(fā)鈷磷合金或者銦箔等無(wú)機(jī)陰極催化劑，促進(jìn)電子捕獲并介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移到微生物細(xì)胞中，強(qiáng)化能量產(chǎn)生。

異養(yǎng)微生物的能量主要來(lái)自有機(jī)物的分解代謝，因此，“開(kāi)源節(jié)流”是提高能量供應(yīng)的有效方法。研究者可通過(guò)提高底物水平磷酸化、增加胞內(nèi)還原態(tài)輔酶Ⅰ供應(yīng)和提高電子傳遞鏈產(chǎn)能效率等強(qiáng)化本源供能系統(tǒng)的策略，或者引入異源代謝途徑、開(kāi)發(fā)電化學(xué)系統(tǒng)和構(gòu)建生物—雜合系統(tǒng)等外源能量供應(yīng)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行“開(kāi)源”。筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了自組裝硫化鎘捕光系統(tǒng)并應(yīng)用于大腸桿菌中，在藍(lán)光照射下，胞內(nèi)還原態(tài)輔酶Ⅰ的含量提高62%，進(jìn)而顯著提升了CO的固定效率[7]。此外，“節(jié)流”能最大限度地減少非必需反應(yīng)的能量消耗，包括用能耗少的代謝途徑替代耗能高的代謝途徑、抑制或者阻斷耗能副產(chǎn)物的形成、刪除非必需基因等，減少不必要的能量消耗，為異養(yǎng)微生物固定CO提供足夠的能量供應(yīng)。也有研究通過(guò)刪除調(diào)控大腸桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)的62個(gè)基因，減少了大約20%的能量消耗，提高了CO的固定效率[8]。

微生物生產(chǎn)具有占地少、易控制和單位面積產(chǎn)能高等顯著優(yōu)勢(shì)。借助合成生物學(xué)方法在微生物中構(gòu)建的高效固定CO細(xì)胞“工廠”，可將CO轉(zhuǎn)化為淀粉、蛋白質(zhì)、燃料和材料單體等高價(jià)值產(chǎn)品，正所謂是小個(gè)頭、多功能、大產(chǎn)業(yè)。

合成淀粉

植物通過(guò)光合作用固定CO生產(chǎn)淀粉的路徑涉及60余步代謝反應(yīng)，理論轉(zhuǎn)化率僅為2%左右。我國(guó)科學(xué)家們從頭設(shè)計(jì)，構(gòu)建了由四大模塊涉及11步反應(yīng)的人工淀粉合成代謝途徑（artificial starch anabolic pathway， ASAP），首次實(shí)現(xiàn)了從CO到淀粉分子的全合成。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人工合成的淀粉分子與天然淀粉分子的結(jié)構(gòu)組成一致。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示，人工合成淀粉的效率約為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)淀粉的8.5倍。在充足能量供給的條件下，按照目前技術(shù)參數(shù)，理論上1噸發(fā)酵罐年生產(chǎn)淀粉總量相當(dāng)于我國(guó)5畝（1畝=666.7平方米）玉米地的年產(chǎn)淀粉量[9]。

合成蛋白質(zhì)

當(dāng)前，利用微生物固定CO合成蛋白質(zhì)領(lǐng)域已有了長(zhǎng)足進(jìn)展。有研究院校同企業(yè)合作，突破了自然光合固碳的限制，以鋼鐵廠、電廠含CO和CO的尾氣及氨水為原料，經(jīng)乙醇梭菌發(fā)酵、離心、干燥后獲得了一種新型乙醇梭菌蛋白質(zhì)。其粗蛋白含量超過(guò)80%，必需氨基酸含量及其結(jié)構(gòu)比例接近魚(yú)粉蛋白，優(yōu)于豆粕蛋白。目前，這一技術(shù)已實(shí)現(xiàn)萬(wàn)噸級(jí)蛋白產(chǎn)能，開(kāi)辟了一條“低成本、非傳統(tǒng)動(dòng)植物資源生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)”的新途徑。如果能在我國(guó)更多的鋼鐵企業(yè)、石化企業(yè)和煤炭加工廠推廣應(yīng)用，將是一場(chǎng)有效促進(jìn)碳循環(huán)、碳利用和碳捕集的碳革命。

合成燃料

為了供應(yīng)充足的燃料，科學(xué)家們已開(kāi)發(fā)出利用微生物固定CO生產(chǎn)乙醇和生物柴油等燃料的技術(shù)。如在利用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中，每生成1分子乙醇就會(huì)釋放1分子CO，造成大量碳損失。為此，科學(xué)家們將異源的磷酸核酮糖激酶和二磷酸核酮糖羧化酶導(dǎo)入釀酒酵母中構(gòu)建卡爾文循環(huán)來(lái)固定CO，使乙醇產(chǎn)量提高了25%以上[10]。此外，研究者還將微藻置于生物反應(yīng)器中，其吸收陽(yáng)光和CO后可生成微藻生物質(zhì)，經(jīng)過(guò)加工轉(zhuǎn)化成的生物柴油，熱值是木材和農(nóng)作物秸稈的1.5倍。

合成生物可降解塑料單體

通過(guò)代謝工程改造微生物，能替代石油路徑合成生物可降解材料單體[11]。如琥珀酸是生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的重要組成成分，年需求量超過(guò)300萬(wàn)噸。筆者團(tuán)隊(duì)借助合成生物學(xué)的方法，在高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌中引入高效的CO捕集元件、CO轉(zhuǎn)化路徑和光能驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，構(gòu)建了高效利用CO生產(chǎn)琥珀酸的碳負(fù)性細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了從化學(xué)工藝每生產(chǎn)1噸琥珀酸釋放1.66 噸CO，到每生產(chǎn)1噸琥珀酸吸收1.63噸CO的轉(zhuǎn)變，開(kāi)辟了溫室氣體利用的新途徑。

綜上所述，通過(guò)解析微生物濃縮和捕集CO的分子機(jī)理，理性設(shè)計(jì)高效的CO固定途徑，構(gòu)建新型能量供應(yīng)系統(tǒng)，創(chuàng)制捕獲CO轉(zhuǎn)化生產(chǎn)有規(guī)?；袌?chǎng)需求的燃料、化工產(chǎn)品或建筑材料的“碳負(fù)性”人工細(xì)胞，是建立以CO為原料的工業(yè)生物轉(zhuǎn)化新路線，減少對(duì)石油資源和耕地需求，縮短工藝流程，降低生產(chǎn)成本，有助于我國(guó)在新一輪國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中贏得先機(jī)的重要策略，為實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”“碳中和”的目標(biāo)提供微生物解決方案。

[本文相關(guān)研究受江蘇省前沿引領(lǐng)技術(shù)基礎(chǔ)研究專項(xiàng)（BK20212013）資助。]

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關(guān)鍵詞：微生物 固碳 溫室氣體 碳中和 ■