復(fù)方中藥制劑中連翹苷提取工藝的比較研究

王彥輝，姬星宇，焦金英，李自波，高媛媛

（1.河南中盛動物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450008；2.河南普華基因科技有限公司）

隨著禁抗時代到來，全面減抗成為未來發(fā)展趨勢，而中獸藥成為比較合適的替代抗生素的藥品，因此，這也為中獸藥新藥研發(fā)帶來了更好的機會。但是全新的中獸藥研發(fā)“投入大，產(chǎn)出小”，且安全性也有待考察，為了縮短新獸藥的開發(fā)周期，降低風(fēng)險并提高新獸藥開發(fā)的成功率，“老藥新用”、“人藥轉(zhuǎn)獸藥”越來越受到關(guān)注，傳統(tǒng)經(jīng)典名方、秘方驗方的再開發(fā)也是新獸藥研發(fā)的重要途徑。清熱靈顆粒，先收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》，后收錄于《中國藥典》一部中，其主要作用為清熱解毒，用于感冒熱邪壅肺證，臨床試驗表明，其對雞感冒引起的發(fā)熱具有一定的治療作用。

清熱靈顆粒處方組成為黃芩、連翹、大青葉和甘草等幾味中藥成分。清熱靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，黃芩苷為制劑含量控制指標(biāo)，黃芩苷在黃芩藥材中含量較高，超過8%，傳統(tǒng)的水提工藝較易達(dá)到含量控制指標(biāo)。但是連翹同樣作為方劑中的主要成分，藥材本身含連翹苷成分較少，不超過3%，因此，在保證黃芩苷含量的情況下，怎樣盡可能高地將制劑中其他成分提取出來，提高多成分含量，保證制劑治療效果，也是中獸藥研發(fā)的重要工作。本文將通過比較分煎、合煎、醇提、超聲提等提取方式，以確定復(fù)方制劑中連翹的最佳提取工藝。

1 材料

1.1 試藥

黃芩、連翹、大青葉、甘草等藥材，均購自張仲景大藥房；連翹苷對照品，批號：110821-201514，購自中國食品藥品檢定研究院；95%乙醇，分析純，天津市北辰方正試劑廠；甲醇，色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；乙腈，色譜純，美國天地化學(xué)試劑公司；中性氧化鋁，分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）、色譜柱Hypersi1 GOLD C18（賽默飛世爾科技有限公司）、BT125D電子天平（0.00001 g）（德國塞多利斯公司）、pH-3C 數(shù)字酸度儀（上海雷磁儀器廠），中藥提取設(shè)備（東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分煎法

取連翹藥材250 g，浸泡0.5 h后，加12倍水煎煮2次，每次1.5 h；另取黃芩250 g、大青葉250 g 和甘草50 g，浸泡0.5 h后，加12倍水煎煮2次，每次1.5 h，合并連翹和另外3種藥材煎液，濃縮至800 m1，使生藥含量為1 g/m1。

2.2 合煎法

取黃芩、連翹、大青葉藥材各250 g，甘草50 g，浸泡0.5 h后，加12倍水煎煮2次，每次1.5 h，合并2次煎液，過濾，濾液濃縮至800 m1，使生藥含量為1 g/m1。

2.3 乙醇回流提取法

取黃芩、連翹、大青葉藥材各250 g，甘草50 g，按料液比1∶10加入85%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1.5 h，合并兩次收集的提取液，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)濃縮至800 m1，使生藥含量為1g/m1。

2.4 超聲提取法

取黃芩、連翹、大青葉藥材各250 g，甘草50 g，粉碎，按料液比1∶10加入75%乙醇，浸泡0.5 h，超聲提取2次，每次30 min，合并兩次收集的提取液，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)濃縮至800 m1，使生藥含量為1 g/m1。

2.5 樣品溶液制備

2.5.1 對照品溶液制備 取連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 m1含100 μg的溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液制備 精密量取提取液1 m1，置中性氧化鋁柱（100～120目，6 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用70%乙醇40 m1洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 m1量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 色譜條件 色譜柱：Hypersi1 GOLD C18（4.6mm×250 mm，5 um）；以乙腈-0.2%磷酸溶液（25∶75）為流動相，等度洗脫；流速為1 m1/min，檢測波長為277 nm；進樣量為10 u1。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 取連翹苷對照品適量，制成終質(zhì)量濃度為0.4 mg/m1 的溶液，取此對照品溶液依次倍比稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/m1 的溶液，HPLC 分別進樣檢測，記錄色譜圖，以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以平均峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

2.6.2 精密度試驗 取連翹苷對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.6.3 重復(fù)性試驗 取提取液，平行制備供試品溶液6份，HPLC 進樣檢測，記錄峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取提取液，制備供試品溶液，分別于配制完成后第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD。

2.6.5 加樣回收率 準(zhǔn)確稱取同一批已測知含量的提取液9 份，制備供試品溶液，按對照品加入量與所提取液中連翹苷含量比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5，分別加入連翹苷對照品，每個濃度3個重復(fù)，記錄峰面積，計算回收率及RSD。

2.6.6 提取液含量測定 分別取4 個不同提取工藝所得提取液，以上述“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按上述“2.5.3”項下色譜方法，HPLC進樣檢測，記錄峰面積，計算提取液中連翹苷含量。

3 結(jié)果分析

3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

連翹苷線性關(guān)系考察結(jié)果如圖1所示，所得線性回歸方程為：y=1E+07x+3 084.7，R2=1，說明在0.012 5～0.4 mg/m1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 連翹苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 精密度試驗結(jié)果

取連翹苷對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6 次，所得精密度試驗結(jié)果如表1 所示，測得連翹苷對照品溶液RSD 為0.2%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

3.3 重復(fù)性試驗結(jié)果

取提取液，平行制備供試品溶液6 份，所得重復(fù)性試驗結(jié)果如表2所示，測得連翹苷對照品溶液RSD為0.9%，表明該試驗的測定方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

取提取液，制備供試品溶液，分別于配制完成后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣檢測，檢測結(jié)果如表3所示，樣品溶液放置24 h 后，連翹苷含量為0.42 mg/m1，與0 h 比，無顯著下降，RSD 為1.28%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)比較穩(wěn)定。

表3 樣品溶液穩(wěn)定性試驗

3.5 加樣回收率試驗結(jié)果

回收率試驗結(jié)果見表4，由表4 可見，不同加樣濃度，樣品平均加樣回收率為99.5%，RSD 為0.8%，說明該檢測方法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率試驗結(jié)果

3.6 提取液含量檢測結(jié)果

經(jīng)以上方法學(xué)考察驗證后，不同提取方式所得清熱靈顆粒提取液中連翹苷含量測定結(jié)果如表5所示，合煎所得連翹苷含量較高，為0.41 mg/m1，分煎則次之，為0.37 mg/m1，乙醇回流提取和超聲提取所得連翹苷含量較低，僅為0.30 mg/m1和0.28 mg/m1，說明采用整體投料，傳統(tǒng)水提工藝提取所得連翹苷提取率最高，提取率達(dá)66.6%。

表5 不同提取方法連翹苷含量測定結(jié)果

4 討論

清熱靈顆粒的處方組成是：黃芩、連翹、大青葉、甘草；方中黃芩苦寒，清肺泄熱，為君藥；連翹既能疏散風(fēng)熱，清熱解毒，又可辟穢化濁，在透散衛(wèi)分表邪的同時，兼顧溫?zé)岵⌒耙滋N結(jié)成毒的特點，為臣藥；大青葉清熱解毒，涼血散斑，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。現(xiàn)代藥效學(xué)研究表明，除黃芩苷外，連翹苷也具有抗菌抗病毒的相關(guān)活性，也是清熱靈顆粒的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。本文采用不同提取工藝，包括分煎、合煎、醇提、超聲提等，來比較研究連翹苷的最佳提取工藝。

煎煮法是我國最早使用的傳統(tǒng)的提取方法，是提高煎劑質(zhì)量、保障臨床用藥安全有效的重要環(huán)節(jié)之一，體現(xiàn)了中醫(yī)治病的精髓。清代名醫(yī)徐靈胎云：“煎藥之發(fā)，最易深究，藥之效不效，全在于此”。乙醇回流提取法是用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑提取原料成分，將浸出液加熱蒸餾，其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷卻，重復(fù)流回浸出容器中浸提原料，這樣周而復(fù)始，直至有效成分回流提取完全的方法。超聲提取就是利用超聲波強烈的空化、攪拌等效應(yīng)，破壞植物細(xì)胞壁，減少傳質(zhì)阻力，使有效成分迅速溶出。本研究試驗結(jié)果表明，在以上幾種提取工藝中，傳統(tǒng)水提工藝所得清熱靈顆粒提取液中連翹苷含量最高，尤其是復(fù)方藥材整體投料，而以乙醇為溶媒的回流提取和超聲提取，則提取率相對較低，原因可能為連翹苷易溶于水，不溶于乙醇，因此采用醇提工藝，所得連翹苷提取率較低。綜合比較，傳統(tǒng)水煎工藝，操作簡單，更適用于實際生產(chǎn)。中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，每一味藥材都有其藥效學(xué)作用，因此，應(yīng)采用合適的提取方法，盡可能地將每一味藥材的有效成分充分提取出來。□