薯蕷皂苷元抑制碘酸鈉誘發(fā)ARPE-19細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

陳若冰 吳素琴 姜玥 劉宵達 周酈楠 陳再興 徐曉萱

(1遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，遼寧 沈陽 110101；中國醫(yī)科大學(xué) 2藥理教研室；3臨床醫(yī)學(xué)院)

在前期山藥潛在功能挖掘中發(fā)現(xiàn)古方用山藥具有明目作用〔1〕，干性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)中醫(yī)辨證屬于目昏暗范疇，是老年常見病，晚期會引起不可逆的視力喪失，其發(fā)病機制主要為衰老、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮層脂質(zhì)沉積，色素紊亂，功能障礙。在現(xiàn)代藥效學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)山藥中的重要物質(zhì)薯蕷皂苷元具有強抗氧化、抗衰老的作用〔2〕，能夠抑制高血脂、糖尿病的氧化應(yīng)激反應(yīng)〔3〕，抑制ARPE-19細胞的過度增殖和遷移〔4〕，但未見其對干性AMD作用的報道，本研究擬分析薯蕷皂苷元對ARPE-19細胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和ARPE-19細胞增殖、凋亡濃度的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系(ARPE-19)購于中國科學(xué)院細胞庫。藥物和試劑：薯蕷皂苷元購于四川省維克奇生物科技有限公司(批號：wkq19013103，純度：HPLC≥98%)；碘酸鈉購于四川省維克奇生物科技有限公司(批號：wkq19051704，純度：HPLC≥98%)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、CCK8試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購于聯(lián)科生物；SOD、MDA試劑盒購于北京達科為生物技術(shù)有限公司。儀器和設(shè)備：流式細胞儀(Beckman，CytoFlex)、酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司 318C)、二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛，Thermo Heracell vios 160i)、分光光度計(德國/analytikjena，SPECORD?210 PLUS)、倒置顯微鏡(卡爾蔡司，Axio Vert.Al)、95℃恒溫水浴箱(北京中西華大科技有限公司，m269382)、高速冷凍離心機(美國貝克曼公司，Allegra X-30R)。

1.2細胞培養(yǎng) ①配制培養(yǎng)基：配制含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基；②細胞傳代：細胞密度達80%～90%時，胰酶消化、傳代。細胞置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3藥物配置 碘酸鈉避光保存，取20 mg碘酸鈉溶于10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制備成濃度為2 mg/ml的碘酸鈉溶液。薯蕷皂苷元組分別溶于PBS中制成濃度為10、20、40、80 μg/ml的薯蕷皂苷元溶液各10 ml。

1.4細胞分組 分為6組：正常培養(yǎng)組、碘酸鈉預(yù)處理組和薯蕷皂苷元10、20、40、80 μg/ml劑量組；每組4個孔。

1.5實驗方法 正常培養(yǎng)組常規(guī)處理培養(yǎng)，碘酸鈉預(yù)處理組予碘酸鈉2 mg/ml預(yù)處理，薯蕷皂苷元各組在予碘酸鈉2 mg/ml處理的同時分別給予薯蕷皂苷元10、20、40、80 μg/ml進行處理。培養(yǎng)24 h后進行指標(biāo)檢測。

1.6CCK8測定細胞增殖 用0.5 g/L胰酶消化對數(shù)生長期細胞，于96孔板內(nèi)接種細胞懸液(每孔1 000個細胞)，分別對各組加入實驗藥物，將細胞置于37℃，體積分數(shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后分別添加10 μl CCK8試劑到每個孔內(nèi)，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀波長設(shè)置為450 nm，重復(fù)3次測定每孔吸光度(OD)，取平均值。

1.7細胞SOD、GXH-PX、MDA含量測定 以上6組細胞培養(yǎng)24 h后，細胞取上清，胰酶消化約2 min，加培養(yǎng)液中止消化，用微量移液器將液體吸出轉(zhuǎn)入至EP管，1 000 r/min離心10 min棄上清，在沉淀細胞中加入1 ml PBS輕輕吹打，1 000 r/min離心10 min棄上清，加入0.5 ml PBS，懸浮細胞，進行超聲震蕩破碎，稀釋10倍后，按照SOD、GXH-Px、MDA試劑盒說明書，測定BCA蛋白濃度，測定各組細胞OD值，計算SOD、GXH-Px、MDA含量。

1.8細胞凋亡檢測 按實驗方案誘導(dǎo)凋亡，用預(yù)冷PBS離心洗滌，收集105個細胞。用雙蒸水稀釋5倍結(jié)合緩沖液為1倍工作液，5 μl FITC-Annexin V和10 μl碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，取補充1倍結(jié)合緩沖液至500 μl輕柔渦旋混勻后。對各組細胞進行流式分析(A)。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS22.0軟件進行One-Way ANOVA、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞增殖和凋亡濃度比較 各組細胞增殖和凋亡情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.082、0.665，均P<0.05)；從增殖濃度看，碘酸鈉預(yù)處理組(11.34%±2.82%)低于正常培養(yǎng)組(25.65%±6.05%)及薯蕷皂苷元80(28.63%±3.02%)、40(27.37%±4.53%)和20 μg/ml劑量組(25.49%±4.88%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常培養(yǎng)組高于薯蕷皂苷元20、10 μg/ml劑量組(18.42%±6.22%)，低于薯蕷皂苷元80 μg/ml、40 μg/ml劑量組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。薯蕷皂苷元80 μg/ml劑量組高于10 μg/ml劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從凋亡濃度看，碘酸鈉預(yù)處理組(30.41%±5.51%)高于正常培養(yǎng)組(8.26%±2.75%)、薯蕷皂苷元各劑量組(10、20、40、80 μg/ml組分別為15.27%±2.70%、15.05%±1.00%、11.42%±0.73%、8.49%±1.53%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常培養(yǎng)組低于薯蕷皂苷元20、10 μg/ml劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；薯蕷皂苷元各劑量組凋亡濃度與劑量呈反比，且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組細胞凋亡濃度

2.2各組SOD、GXH-Px、MDA含量比較 6組細胞SOD、GXH-Px、MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。碘酸鈉預(yù)處理組SOD含量明顯低于正常培養(yǎng)組和薯蕷皂苷元80、40 μg/ml劑量組(P<0.05)；正常培養(yǎng)組明顯高于薯蕷皂苷元10 μg/ml劑量組(P<0.05)；薯蕷皂苷元80 μg/ml劑量組明顯高于薯蕷皂苷元20、10 μg/ml劑量組(P<0.05)；薯蕷皂苷元40 μg/ml劑量組明顯高于10 μg/ml劑量組(P<0.05)。碘酸鈉預(yù)處理組GXH-Px含量明顯高于正常培養(yǎng)組和薯蕷皂苷元80、40 μg/ml劑量組(P<0.05)；正常培養(yǎng)組明顯高于薯蕷皂苷元10 μg/ml劑量組(P<0.05)；薯蕷皂苷元80 μg/ml劑量組明顯高于20、10 μg/ml劑量組(P<0.05)；其他各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。碘酸鈉預(yù)處理組MDA含量明顯高于正常培養(yǎng)組、薯蕷皂苷元各劑量(P<0.05)；MDA含量隨薯蕷皂苷元濃度升高而降低，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3 討 論

色素上皮細胞是血-視網(wǎng)膜屏障的組成部分，參與脈絡(luò)膜毛細血管與視網(wǎng)膜感光細胞之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，具有營養(yǎng)光感受器，吞噬感光細胞碎片等作用，當(dāng)氧化損傷、炎癥等因素導(dǎo)致色素上皮細胞損傷時，視網(wǎng)膜色素上皮層脂質(zhì)沉積及色素紊亂，逐漸出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細胞功能障礙，玻璃膜疣增多，脈絡(luò)膜新生血管形成。晚期疾病不可逆，導(dǎo)致失明，因此，色素上皮細胞損傷被學(xué)者們公認為干性AMD病理改變的始動環(huán)節(jié)〔5,6〕。在疾病早期積極干預(yù)，阻止視網(wǎng)膜色素上皮細胞的損傷是干預(yù)干性AMD病情進展的重要措施。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮損傷的重要因素，氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，增多的氮自由基及高活性分子氧自由基在視網(wǎng)膜上皮細胞中堆積，促進視網(wǎng)膜上皮細胞凋亡和抑制增殖。

碘酸鈉是一種無機氧化劑，使用碘酸鈉進行造模是干性AMD研究者常用的方法，碘酸鈉注射小鼠使視網(wǎng)膜細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能改變，引起視網(wǎng)膜細胞的損傷和死亡〔7,8〕。本研究中碘酸鈉引發(fā)視網(wǎng)膜上皮細胞氧化應(yīng)激損傷，模擬AMD發(fā)生有效。薯蕷皂苷元是一種自然合成的甾體皂苷元，藥屬螺甾烷醇糖苷元，廣泛存在于豆科和薯蕷科植物中〔9〕，是山藥的重要活性成分，薯蕷皂苷元抗氧化作用的研究主要集中在免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及抗腫瘤治療等方面〔10,11〕。本研究表明薯蕷皂苷元具有抑制碘酸鈉損傷視網(wǎng)膜上皮細胞的功能，能促進視網(wǎng)膜上皮細胞增殖，阻止凋亡，說明薯蕷皂苷元具有抗氧化凋亡和促進增殖的作用，且與劑量正相關(guān)。

細胞的增殖和凋亡與細胞氧自由基關(guān)系密切，氧自由基活性極強，能引起細胞膜脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸結(jié)構(gòu)和功能，促使細胞凋亡，抑制正常增殖。氧自由基的含量與細胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)有關(guān)〔12〕，抗氧化酶活性降低，可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)氧自由基堆積〔13〕，細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，生成大量MDA〔14〕。SOD是細胞最重要的氧自由基清除劑，可清除細胞中過多的氧自由基。GSH-Px是一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的重要過氧化物分解酶。能保護細胞膜不受過氧化物損害。本研究結(jié)果表明薯蕷皂苷元具有增強SOD、GSH-Px活力的作用，且與劑量相關(guān)，薯蕷皂苷元80、40 μg/ml劑量組效果最明顯。MDA含量是考察細胞受到氧化威脅的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果說明碘酸鈉預(yù)處理組脂質(zhì)過氧化、細胞損傷程度超過正常培養(yǎng)組和薯蕷皂苷元各劑量組，與碘酸鈉能誘發(fā)視網(wǎng)膜上皮細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷相一致，也驗證薯蕷皂苷元具有抗氧化作用。

綜上，薯蕷皂苷元能抑制碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，能通過增加SOD、GSH-Px活力，清除氧自由基，降低MDA含量，保護ARPE-19細胞，促進增殖，阻止凋亡。且其抗氧化作用與薯蕷皂苷元劑量具有相關(guān)性，以80 μg/ml劑量組效果最明顯。作為山藥的重要活性成分，薯蕷皂苷元在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對ARPE-19細胞的保護作用，也為山藥的明目功能提供了現(xiàn)代藥效學(xué)的實驗室支持。