抗體基因點突變、插入和缺失體外檢測方法的建立及應(yīng)用

羅思敏，葉菱秀，郝 茜

上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學與微生物學系，上海市免疫學研究所，上海 200025

抗體是由漿細胞分泌的免疫球蛋白，擁有2 條完全相同的重鏈和輕鏈。重鏈蛋白由可變（variable，V）、多樣（diversity，D）、連接（joining，J）、恒定（constant，C）區(qū)的基因編碼構(gòu)成，其中胚系基因眾多的V、D、J 片段需通過V（D）J 重排方可行使功能，如形成由低親和力、單一類型抗體組成的初級抗體庫。當初始B細胞受到外界抗原刺激時，其可從骨髓遷出進入脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體等次級淋巴組織，經(jīng)歷體細胞高頻突變（somatic hypermutation，SHM）和類別轉(zhuǎn)換（class switch recombination，CSR），進一步產(chǎn)生由高親和力、不同類型抗體組成的次級抗體庫［1-2］。在SHM 過程中，激活誘導胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）可作用于抗體可變區(qū)的基因序列，將序列中的胞苷殘基脫氨變成尿苷，引發(fā)突變事件。研究［3］發(fā)現(xiàn)，AID 傾向于作用在RGYW（R=A/G，Y=C/T，W=A/T）基序上，特別是AGCT基序。與此同時，機體可通過堿基切除修復（base excision repair，BER）和錯配修復（mismatch repair，MMR）途徑對DNA 進行修復，而此過程中一些損傷修復因子可能會使DNA 斷裂末端非模板堿基發(fā)生插入或缺失，從而使抗體基因產(chǎn)生更多的插入和缺失片段。

廣譜中和抗體（broadly neutralizing antibodies，bnAbs）是由B 細胞產(chǎn)生的能夠中和多種病毒毒株的抗體［4］；和普通中和抗體相比，bnAbs具有較長的抗體重鏈互補決定區(qū)（complementarity determining regions，CDRs），大量的點突變、抗體基因片段插入 和 缺 失（insertions and deletions，indels） 等 特征［5-6］。雖然基因片段的插入和缺失是抗體親和力成熟過程中的小概率事件，但其對抗體的廣譜中和能力發(fā)揮著關(guān)鍵作用［7-8］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，在已報道的人類免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的廣譜中和抗體中，約有40%存在indels。目前，由于缺乏合適的研究體系，這些indels 的產(chǎn)生機制尚不明確；且本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)，長度為1 bp 和大于1 bp 的indels 的產(chǎn)生來源亦不盡相同。

有研究［9-10］顯示，眾多的細胞作用因子參與了由AID 介導的SHM 過程中的DNA 損傷修復。其中，DNA 聚合酶β（polymerase β，Polβ）由基因Polb編碼（小鼠中），參與了填補單個堿基的短片段BER、引入多個堿基的長片段BER 過程，被認為可能是AID 介導SHM 過程中影響抗體基因突變事件（包括點突變、插入和缺失）的重要因子［11］。由于Polβ 在DNA 復制中發(fā)揮了重要作用，完全敲除Polb基因會導致小鼠死亡［12］，因此可考慮利用Polβ 抑制劑來分析Polβ 對抗體基因點突變、插入和缺失的影響。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，扎西他濱（2'，3'-dideoxycytidine，DDC）［13］和5- 甲 氧 基 黃 酮（5-methoxyflavone，5-MF）［14］為Polβ 的抑制劑，能有效抑制Polβ 的功能。因此，本研究猜測，是否可使用DDC 和5-MF來觀察AID 介導SHM 過程中Polβ 對抗體基因突變事件的發(fā)生頻率存在的影響，目前此類研究尚未見報道。

在小鼠B 淋巴瘤細胞CH12F3 中，抗體重鏈（heavy chain，H）由2 條等位基因編碼，一條為有功能等位基因，另一條為無功能等位基因，其中有功能等位基因中的VDJ 序列由VH1-53、DH1-1、JH2 組成［15-16］，且固定該序列有利于建庫測序過程中的PCR引物設(shè)計。本研究利用細胞生物學技術(shù)和高通量測序技術(shù)，在過表達AID 的CH12F3 細胞中建立體外檢測抗體基因突變的方法，并利用該方法初步探究Polβ抑制劑對抗體基因突變頻率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與質(zhì)粒 小鼠B 淋巴瘤細胞株CH12F3、慢病毒包裝質(zhì)粒pCL-10A1、表達質(zhì)粒pMX-AID 均由中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心孟飛龍課題組饋贈。

1.1.2 主要試劑與儀器 DDC、0.4%臺盼藍染色液、β-巰基乙醇（Sigma，美國），5-MF（MCE，美國），Polβ 抗 體（Abcam，美 國），AICDA （activationinduced cytidine deaminase）抗體、β 微管蛋白（βtubulin）抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司），山羊抗兔IgG（Proteintech，美國），DMEM 培養(yǎng)基（Corning，美國），RPMI-1640 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、L-谷氨酰胺、嘌呤霉素（Gibco，美國），胎牛血清（上海吉泰依科賽生物科技有限公司），DNA 純化回收試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CH12F3 細胞（懸浮細胞）采用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺以及5×10-5mol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。293T 細胞（貼壁細胞）采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。所有細胞的培養(yǎng)條件均為37 ℃、5%CO2，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 慢病毒包裝 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化293T 細胞；隨后，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將該細胞密度調(diào)整為8×105/mL，并將其接種于10 cm培養(yǎng)皿中；轉(zhuǎn)染前2 h 進行細胞換液。將30 μg pMXAID 質(zhì) 粒、6 μg pCL-10A1 質(zhì) 粒、62 μL 2 mol/L CaCl2、500 μL 2×4-羥 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸 緩 沖 鹽 水（HEPES buffer saline，HBS）、雙蒸水制成1 mL 轉(zhuǎn)染混合液，靜置20 min 后將該混合液均勻滴加至上述培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h 后進行細胞換液，加入5.5 mL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染后48 h，用10 mL 注射器和0.45 μm 過濾器收集慢病毒上清液，再次加入5.5 mL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染后72 h再次過濾并收集慢病毒上清液，混合后立即使用或于4 ℃存放備用。

1.2.3 慢病毒感染 將CH12F3細胞（5×105/mL）接種于24 孔板中，每孔加入1 mL 慢病毒上清液（“1.2.2”中獲得），混勻后靜置20 min。將細胞培養(yǎng)板用封口膜密封后，于32 ℃、1 200×g條件下離心1.5 h，取出培養(yǎng)板并去除封口膜后，將其置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換為“1.2.1”中培養(yǎng)CH12F3 細胞的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次進行慢病毒感染（步驟同前）。每組設(shè)置5 個復孔，于第2 次感染36 h 后，加入1 μg/mL 嘌呤霉素進行48 h篩選。收集經(jīng)慢病毒感染的CH12F3 細胞（處理組）和感染前的CH12F3 細胞（對照組），于300 ×g離心5 min 后棄去上清液，用于后續(xù)蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測和高通量測序文庫的構(gòu)建。

1.2.4 Western blotting檢測 分別向“1.2.3”收集的處理組和對照組細胞中加入細胞裂解液，冰上裂解15 min 后于4 ℃、15 000×g離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2×SDS 上樣緩沖液，于100 ℃下加熱10 min 獲得總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、硝酸纖維素膜印跡后，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，加入對應(yīng)的一抗，包括AID抗體（1∶1 000）、Polβ 抗體（1∶1 000）、β-tubulin 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜后用PBST洗膜3次，再加入二抗（1∶5 000）。室溫孵育1 h，經(jīng)PBST 洗膜3 次后，加入化學發(fā)光顯影液進行曝光。

1.2.5 高通量測序文庫的構(gòu)建、數(shù)據(jù)處理及分析從“1.2.3”收集的處理組和對照組CH12F3 細胞中提取基因組DNA，通過3 輪PCR 進行文庫構(gòu)建（圖1）。第1 輪PCR 反應(yīng)中，以抽提的基因組DNA 為模板，使用抗體基因VDJ 片段的特異性引物進行擴增，反應(yīng)體系為：基因組DNA 2 μg、dNTP 200 μmol/L、正向/反向引物各0.2 μmol/L、Q5 反應(yīng)液10 μL、Q5?高保真DNA 聚合酶1 U，反應(yīng)條件為：98 ℃30 s，98 ℃10 s、62 ℃30 s、72 ℃30 s （20 個循環(huán)），72 ℃2 min。第2 輪PCR 反應(yīng)中，以2 μL 第1 輪擴增產(chǎn)物為模板，引物擴增片段覆蓋VDJ 區(qū)的CDR2 和CDR3，反應(yīng)體系與第一輪PCR 相同（模板除外），反應(yīng)條件亦與第一輪PCR 相同（除需將循環(huán)數(shù)降至16）。第3 輪PCR 反應(yīng)中，以1 μL 第2 輪擴增產(chǎn)物為模板，以Illumina P5 和P7 作為引物，反應(yīng)體系與第一輪PCR 相同（模板除外），反應(yīng)條件亦與第一輪PCR 相同（除需將循環(huán)數(shù)降至15）。將最終的PCR 擴增產(chǎn)物（350～450 bp）進行瓊脂糖凝膠電泳，再使用DNA 純化回收試劑盒回收DNA 片段，于Illumina Hiseq 測序儀進行高通量測序，測序模式為2×150。3輪PCR所用的引物序列參照文獻［17］。

圖1 高通量測序樣品準備流程圖及PCR策略Fig 1 Flowchart of preparation for high-throughput sequencing and PCR strategies

隨后，我們對高通量測序數(shù)據(jù)進行處理。使用課題組自定義腳本拆解數(shù)據(jù)，并用Bowtie2 軟件［18］將其與參考序列進行比對。同時，使用SHM 流程代碼［3］對點突變、缺失和插入進行定義：如果1 個核苷酸與參考序列不同，且其Illumina 測序質(zhì)量分數(shù)大于20，則將其視為點突變；如果相對于參考序列，缺口兩側(cè)的4 個連續(xù)核苷酸的Illumina 測序質(zhì)量分數(shù)均大于20，則該缺口被定義為缺失；如果相對于參考序列，僅存在單個插入且插入序列中2 個連續(xù)核苷酸的Illumina 測序質(zhì)量分數(shù)均大于20，則被定義為插入。

而后，我們對測序結(jié)果進行分析，具體如下：①點突變分析。繪制單堿基突變圖譜（即由每個位點的核苷酸所含點突變的讀長占總測序讀長的百分比構(gòu)成）、總體突變頻率圖（即由包含點突變的序列讀長占所有測序讀長的百分比構(gòu)成），以觀察突變模式和發(fā)生頻率。②indels 分析。繪制indels 發(fā)生的頻率圖（即由indels 總數(shù)占所有測序讀長的百分比構(gòu)成）和indels 的分布圖（即由每20 個堿基中缺失的起點或插入的位點總數(shù)占所有測序讀長的百分比構(gòu)成），以觀察indels的發(fā)生頻率和分布情況。

1.2.6 臺盼藍拒染法檢測 取“1.2.1”中培養(yǎng)的CH12F3細胞（5×105/mL）接種于24孔板中，每孔接種的細胞總量為106，每組設(shè)置3個復孔。采用不同濃度的DDC（12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L）和等體積的0.9%NaCl分別處理CH12F3細胞，采用不同濃度的5-MF（12.5、25、50、100、200 μmol/L）和等體積的DMSO分別處理CH12F3細胞，經(jīng)24、48、72 h后分別將上述細胞懸液與臺盼藍溶液以1∶1的比例均勻混合。取10 μL細胞混合液加入計數(shù)板中，于顯微鏡下進行計數(shù)，統(tǒng)計存活（未染色）的細胞數(shù)量及活細胞率。最終，分別選擇該2種抑制劑對細胞增殖影響較小的最大濃度作為后續(xù)的實驗濃度。

1.2.7 DDC 和5-MF 對抗體基因VDJ 片段點突變、插入和缺失的檢測 分別以“1.2.6”中獲得的DDC濃度、5-MF 濃度處理CH12F3 細胞（即實驗組），以等體積的0.9%NaCl處理的細胞、等體積的DMSO 處理的細胞依次記為上述實驗組的對照組，每組設(shè)置5 個重復樣品。將上述4 組細胞分別由慢病毒包裝和感染后，收集感染前、后的細胞行Western blotting，檢測其AID 和Polβ 的表達；同時，提取細胞的基因組DNA，并行高通量測序文庫的構(gòu)建及分析。具體方法同“1.2.2”—“1.2.5”。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，組間比較使用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CH12F3 細胞處理組和對照組中抗體基因VDJ片段的突變分析

采用Western blotting 檢測CH12F3 處理組和對照組中AID的表達，結(jié)果（圖2A）顯示，CH12F3細胞處理組中AID的表達較對照組有顯著增加，即慢病毒感染成功。

通過對高通量測序的結(jié)果進行分析，我們發(fā)現(xiàn)CH12F3 細胞處理組抗體基因VDJ 片段上存在大量的點突變，這些點突變主要集中在CDR2 和CDR3 區(qū)且突變的頻率均較高（圖2B），同時該突變模式與體內(nèi)生發(fā)中心B 細胞的突變模式［3］相一致。此外，通過對indels 的發(fā)生頻率進行分析，發(fā)現(xiàn)和對照組相比，CH12F3 細胞處理組的indels 的發(fā)生頻率較高（均P=0.000，圖2C、2D）；且該組中片段長度大于1 bp 的indels 的發(fā)生頻率亦較高（均P=0.000，圖2F、2G）。通過對上述indels 事件在抗體基因上的分布進行分析，結(jié)果（圖2E、2H）顯示，CDR2和CDR3區(qū)域的突變頻率高于VDJ 外顯子上的其他區(qū)域，即indels 發(fā)生的區(qū)域與高頻堿基突變的位置相對應(yīng)。

圖2 CH12F3細胞處理組和對照組中，AID的表達及抗體基因VDJ片段的點突變、插入和缺失頻率的分析Fig 2 Analysis of point mutation, insertion and deletion frequencies in the VDJ regions of antibody genes and AID expression in CH12F3 cells with or without AID overexpression

2.2 Polβ 抑制劑——DDC 對抗體基因VDJ 片段的突變分析

本研究通過臺盼藍拒染法檢測不同濃度的DDC處理CH12F3 細胞后對其增殖能力的影響，結(jié)果（圖3A）顯示，和經(jīng)0.9% NaCl 處理的CH12F3 細胞（對照組）相比，分別經(jīng)200、400、800 μmol/L DDC 處理的CH12F3 細胞在48、72 h 時的細胞數(shù)量均有顯著下 降（均P<0.05），而100 μmol/L DDC 處 理 的CH12F3 細胞則無明顯差異，因此該濃度被認為是DDC 不影響細胞增殖的最大濃度。隨后，采用100 μmol/L DDC 處理細胞（實驗組），再通過Western blotting 檢測慢病毒感染后的實驗組和對照組細胞中AID 和Polβ 的表達，結(jié)果（圖3B）顯示該2組細胞的AID 均有表達，即慢病毒感染成功；同時，實驗組細胞中Polβ 的表達量與對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.267），即100 μmol/L DDC 不影響Polβ的表達。

而后，對慢病毒感染前、后的實驗組和對照組共4 組細胞的基因組DNA 進行文庫構(gòu)建及高通量測序。對抗體基因VDJ 片段的點突變進行分析，結(jié)果（圖3C）顯示，慢病毒感染后的實驗組和對照組相比，其點突變頻率較低（P=0.000）；單堿基突變圖譜（圖3D）顯示，感染后的實驗組和對照組細胞中抗體基因VDJ 序列的突變圖譜高度相似，且點突變主要分布在VDJ 片段的CDR2 和CDR3 區(qū)。對抗體基因VDJ片段的插入頻率進行分析，結(jié)果顯示，感染后的實驗組和對照組相比，長度為1 bp及大于1 bp的插入頻率間差異均無統(tǒng)計學意義（圖3E），且這些插入大多發(fā)生在CDR2 和CDR3 區(qū)域（圖3F）。對抗體基因VDJ片段的缺失頻率進行分析，結(jié)果顯示，感染后的實驗組和對照組相比，其長度為1 bp 的缺失頻率較低（P=0.009，圖3G），且這些缺失主要發(fā)生在CDR2 和CDR3區(qū)域（圖3H）。

圖3 DDC對CH12F3細胞增殖及對抗體基因VDJ片段的點突變、插入和缺失頻率的影響Fig 3 Effects of DDC on the proliferation of CH12F3 cells and the frequencies of point mutation,insertion and deletion in the VDJ regions of antibody genes

2.3 Polβ抑制劑——5-MF對抗體基因VDJ片段的突變分析

通過臺盼藍拒染法檢測不同濃度的5-MF 處理CH12F3 細胞后對其增殖能力的影響，結(jié)果（圖4A）顯示，和經(jīng)DMSO 處理的CH12F3 細胞（對照組）相比，分別經(jīng)50、100、200 μmol/L 5-MF處理的CH12F3細胞在24、48、72 h 的細胞計數(shù)上顯著下降（均P<0.05），而25 μmol/L 5-MF 處理的CH12F3 細胞影響較小，因此該濃度被認為是5-MF 對細胞增殖影響較小的最大濃度。隨后，采用25 μmol/L 5-MF 處理細胞（實驗組），再通過Western blotting 檢測慢病毒感染后的實驗組和對照組細胞中AID 和Polβ 的表達，結(jié)果（圖4B）顯示該2 組細胞的AID 均有表達，即慢病毒感染成功；同時，實驗組細胞中Polβ 的表達量與對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.115），即25 μmol/L 5-MF不影響Polβ的表達。

而后，對慢病毒感染前、后的實驗組和對照組細胞的基因組DNA 進行文庫構(gòu)建及高通量測序分析。對抗體基因VDJ 片段的點突變進行分析，結(jié)果（圖4C）顯示，慢病毒感染后的實驗組和對照組相比，其點突變頻率較低（P=0.000）；單堿基突變圖譜（圖4D）顯示，感染后的實驗組和對照組的點突變主要分布在抗體基因VDJ 片段CDR2 和CDR3 區(qū)。對抗體基因VDJ 片段的插入頻率進行分析，結(jié)果顯示，感染后的實驗組和對照組相比，其長度大于1 bp的插入頻率較低（P=0.000，圖4E），且這些插入大多發(fā)生在CDR2 和CDR3 區(qū)域（圖4F）。對抗體基因VDJ 片段的缺失頻率進行分析，結(jié)果顯示，感染后的實驗組和對照組相比，其長度大于1 bp 的缺失頻率亦較低（P=0.000，圖4G），且這些缺失亦主要發(fā)生在CDR2和CDR3區(qū)域（圖4H）。

圖4 5-MF對CH12F3細胞增殖及對抗體基因VDJ片段的點突變、插入和缺失頻率的影響Fig 4 Effects of 5-MF on the proliferation of CH12F3 cells and the frequencies of point mutation, insertion and deletion in the VDJ regions of antibody genes

3 討論

在因病毒感染導致的疾病預(yù)防和治療過程中，疫苗研制常受到毒株突變的限制。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，少數(shù)個體在病毒慢性感染階段可產(chǎn)生廣譜中和抗體，以識別并廣泛中和多種類型的毒株［19］。目前，已 有 報 道 從 被HIV［6，20-21］、流 感 病 毒［22］、丙 肝 病毒［23］、埃博拉病毒［24］、寨卡病毒［25］和瘧原蟲［26］等感染的患者體內(nèi)分離得到bnAbs，這些發(fā)現(xiàn)從體液免疫角度給疫苗研制帶來了新的思路。但bnAbs的產(chǎn)生時間較長且難以被誘導，因此如何快速獲得bnAbs成為了亟待解決的問題。和普通的中和抗體相比，bnAbs 具有更高頻率的點突變、缺失和插入等，且這些突變事件的發(fā)生不利于疫苗的設(shè)計，具體機制亦不明晰。因此，在抗體進化過程中，確定某一個或某一些影響抗體基因點突變、插入和缺失的作用因子至關(guān)重要。

抗體基因的突變事件發(fā)生頻率極低，用傳統(tǒng)的實驗手段很難在細胞系中進行檢測，因此無法對其產(chǎn)生的機制進行深入研究。為解決這一難題，本研究通過在CH12F3B 細胞系中過表達AID 的方式，結(jié)合高通量測序?qū)υ摷毎锌贵w基因VDJ 片段進行深度測序，成功捕獲到了大量的基因點突變、插入和缺失事件。我們發(fā)現(xiàn)，在體外細胞系中檢測到抗體基因VDJ 片段上CDR2 和CDR3 區(qū)的點突變的頻率較高且分布較集中，這種由AID誘導產(chǎn)生的細胞內(nèi)高頻突變模式與體內(nèi)生發(fā)中心B 細胞的突變模式一致［3］。此外，插入和缺失發(fā)生的位置也主要在抗體基因VDJ 片段上CDR2 和CDR3 區(qū)，且抗體基因缺失的分布規(guī)律與小鼠體內(nèi)生發(fā)中心B 細胞的研究［3］結(jié)果亦相一致。上述結(jié)果表明，我們在體外CH12F3 細胞系中構(gòu)建的AID過表達的研究方法可有效檢測抗體基因VDJ片段突變事件的產(chǎn)生，進而有望利用該方法去尋找影響其突變事件發(fā)生的關(guān)鍵因子。

隨后，我們利用已建立的方法進一步探索參與DNA 損傷修復的細胞作用因子——Polβ 的抑制劑DDC 和5-MF 對抗體基因點突變、缺失和插入的影響。通過對慢病毒感染后的實驗組和對照組的突變頻率進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 μmol/L DDC 處理的CH12F3 細胞與對照組相比，點突變頻率、長度為1 bp的缺失頻率均較低，而大于1 bp的插入和缺失頻率亦有下降但差異無統(tǒng)計學意義；而經(jīng)25 μmol/L 5-MF 處理的CH12F3 細胞與對照組比較，點突變頻率、長度大于1 bp的插入和缺失頻率均有降低。這些結(jié)果均表明，DDC和5-MF能夠通過抑制Polβ的活性來影響抗體基因VDJ 序列上點突變、插入和缺失的發(fā)生頻率，因此Polβ 或是影響抗體基因點突變、插入和缺失的關(guān)鍵因子。

本研究在體外建立利用小鼠B 淋巴瘤細胞系CH12F3 研究抗體基因VDJ 片段點突變、插入和缺失的方法具有以下優(yōu)勢：①方便快捷，實驗周期較短。②便于通過基因敲除、蛋白過表達或抑制劑處理等方式處理細胞，進行高通量篩選，初步找出可能影響突變事件的關(guān)鍵因子。③投入成本較低，實驗設(shè)計相對簡單。盡管如此，該方法也存在一定的局限性：①細胞環(huán)境較為單一，而機體內(nèi)部環(huán)境復雜多樣，CH12F3 細胞過表達AID 并不能完全模擬生發(fā)中心B細胞經(jīng)歷SHM 的過程。②單次只能檢測1 個基因?qū)贵w基因VDJ 序列產(chǎn)生的影響。③對實驗細胞內(nèi)的點突變、插入和缺失事件的檢測數(shù)少于體內(nèi)實驗，所得實驗結(jié)論推導到體內(nèi)未必相符。因此，通過本研究方法篩選得到的影響抗體基因突變事件的關(guān)鍵因子還需通過體內(nèi)實驗加以驗證。

綜上所述，本研究建立了通過細胞系研究抗體基因VDJ 片段點突變、插入和缺失的檢測方法，或?qū)轶w外篩選影響抗體基因突變事件發(fā)生的關(guān)鍵因子提供高效的方法。近年來，伴隨著高通量測序分析抗體序列的不斷發(fā)展，設(shè)計的測序引物不能涵蓋所有抗體基因片段、抗體重鏈與輕鏈的配對信息難以檢測、對測序過程中可能引入的堿基插入和缺失進行分析等問題仍將是解析抗體基因序列中突變事件產(chǎn)生機制的難點。未來，本研究還將繼續(xù)深入探究在AID 介導的SHM 過程中抗體基因VDJ序列突變事件的產(chǎn)生機制，以期為bnAbs的篩選和誘導提供新的線索。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

郝茜和葉菱秀參與了實驗設(shè)計，羅思敏和郝茜參與了數(shù)據(jù)分析和整理，羅思敏、郝茜和葉菱秀參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by HAO Qian and YEAP Lengsiew. The data was collected and analyzed by LUO Simin and HAO Qian. The manuscript was drafted and revised by LUO Simin， HAO Qian and YEAP Lengsiew. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-31

·Accepted：2022-03-25

·Published online：2022-04-28