哺乳動物細胞表面展示IgG 抗體Fc 組合突變庫的構建及評估

張 咪，柳淑君，李福彬，張 燕

上海交通大學基礎醫(yī)學院免疫學與微生物學系，上海市免疫學研究所，上海 200025

單克隆抗體是抗體的一類主要形式，單克隆抗體藥物治療的有效性、安全性和特異性，使其在生物醫(yī)藥領域具有非常重要的地位［1-2］。1986—2021 年，在美國或歐盟獲批的抗體治療藥物數(shù)量從1 個增至100個［3］；且至2019年11月，共有79種抗體藥物正處于后期臨床研究實驗［2］。為了提高單克隆抗體的藥效和成藥性，抗體優(yōu)化技術已經廣泛應用于生物制藥領域。

其 中， IgG 抗 體Fc （fragment crystallizable domain）的優(yōu)化是抗體優(yōu)化的一個重要領域。這是由于Fc 序列的變化決定了抗體與Fcγ 受體（Fcγ recepter，F(xiàn)cγR）、新生兒Fc 受體以及補體蛋白C1q的親和力。大量研究表明，多種類型IgG 單克隆抗體的活性受到其Fc 與FcγR 相互作用的影響。人和小鼠均表達多種IgG 亞型和多種FcγR。IgG 抗體Fc 與特定FcγR 的結合對其功能有不同的影響，比如IgG1 突變體（S298A/E333A/K334A）提高了其與FcγRIIIA的結合能力，使得FcγRIIIA 介導的抗體依賴細胞毒（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC） 作用增強，從而將該IgG1 突變體（即曲妥珠單抗）對表達人類表皮生長因子受體2 （human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的人乳腺腺癌細胞SK-BR-3 的體外殺傷能力提高了50～100 倍［4］；另一個IgG1 突變體（G236A/S239D/I332E）與FcγRIIA 的親和力提高了70倍，與FcγRIIA/FcγRIIB親和力提高了15 倍，可以增強巨噬細胞對抗體靶向細胞的吞噬作用［5］。因此，通過改變抗體Fc與其FcγR 結合屬性進而改變抗體功能，是重要的抗體藥物優(yōu)化思路。

抗體Fc 優(yōu)化的一個主要挑戰(zhàn)是IgG 的Fc 部分至少有4 個片段與FcγR 相互作用［6］，直接相互作用的氨基酸位點約20 個。同時，不排除其他部分還可能產生間接影響。如N297 糖基化位點是人IgG 與FcγR結合的中心，N297A 突變可導致IgG 與FcγR 不能結合［7］；P396L 突變可導致ADCC 活性增加［8］。因此，優(yōu)化抗體Fc 與FcγR 結合能力時需要同時考慮的氨基酸位點較多，這使得Fc 的突變文庫非常大。同時，翻譯后修飾對Fc 和FcγR 相互作用也具有重要影響，使得抗體Fc 的優(yōu)化只能依托真核細胞表達平臺。哺乳動物細胞展示系統(tǒng)是表達和分泌人類抗體最天然的系統(tǒng)。然而，相對于文庫多樣性可達到1010的噬菌體展示系統(tǒng)和107的酵母展示系統(tǒng)，哺乳動物細胞展示系統(tǒng)的篩選效率在很大程度上受到穩(wěn)轉文庫規(guī)模?。s104）的限制［9］。如何有效地實現(xiàn)更大范圍的Fc突變篩選，一直是一個重要的問題。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

3T3 細胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）；Phoenix細胞和Helper輔助質粒由上海交通大學醫(yī)學院黃傳新博士課題組饋贈；同源重組試劑盒（Hieff Clone? Plus Multi One Step Cloning Kit，貨號10912ES10）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；高保真DNA 聚合酶Pfu（貨號AP231）和大腸埃希菌（E. coli）DH5α 感受態(tài)細胞（貨號CD201）購自北京全式金生物技術股份有限公司；PEI 轉染試劑（貨號：24765-2）購自美國Polysciences 公司；膠回收試劑盒（Gel extraction kit，貨號D2500-02）、無內毒素質粒大抽試劑盒（Endo-Free Plasmid DNA Maxi Kit，貨號D6926-03）購自美國Omega Bio-tek 公司；Polybrene 助轉染試劑（貨號GM-040901）購自吉滿生物科技（上海）有限公司；PBS 緩沖液（貨號B320KJ）購自上海源培生物科技公司；DAPI 熒光染料（貨號D3571）購自美國Invitrogen公司；蛋白酶K（貨號B600452）、1 mol/L Tris-HCl pH 8.0 溶液（貨號B548127）、NaCl （貨 號A100241） 和SDS （貨 號A100227） 購自生工生物工程（上海） 股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 簡并引物的設計和PCR 以實驗室已有的哺乳動物表面展示載體MIGR1-IgG2［該載體具有的特征是在膜表面表達人抗體IgG2 的同時也會表達綠色熒光蛋白（GFP）］為模板，設計簡并引物（引物序列中除正常堿基外為簡并堿基：R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T）。對合成的簡并引物進行等比例混合（不考慮引物所含突變多樣性，直接等量混合）或者按該條引物所攜帶的突變數(shù)占總文庫多樣性的比例進行混合（例如：簡并引物編號為1 的引物包含3 072 種突變，則其占比為3 072/41 600×100%=7.38%，那么取7.38 μL 該引物，其他引物也按照計算的比例加入，混合）。然后進行PCR使目的片段和線性化MIGR1-IgG2 載體具有相同末端序列，并根據(jù)膠回收試劑盒說明書對其進行純化。

1.2.2 抗體Fc 突變質粒文庫的構建 純化后的具有相同末端序列的線性化載體和插入片段，通過同源重組酶進行重組反應。取10 μL 上述反應產物加至100 μLE. coliDH5α 感受態(tài)細胞，冰上靜置30 min，42 ℃熱激90 s，冰上放置2 min，加入500 μL LB 培養(yǎng)基，于37 ℃，搖床200 r/min 孵育30 min 后，取少量DH5α 菌液涂平板，過夜培養(yǎng)，次日計算克隆數(shù)。當克隆數(shù)為文庫大小的2～5倍時，認為該文庫構建成功，并且將這些單克隆菌落，進行一代測序（Sanger測序），檢測文庫的質量。余下的DH5α 菌液，進行大規(guī)模培養(yǎng)，用無內毒素質粒大抽試劑盒提取質粒，獲得質粒文庫。

1.2.3 抗體Fc 突變細胞文庫的構建 將上述大抽質粒文庫和Helper 輔助質粒（摩爾比為2∶1），與轉染試劑PEI（總質粒與PEI 質量比為1∶5）混合，轉染提前鋪板的Phoenix 細胞（融合度為50%～60%），6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集含有反轉錄病毒的上清液。將該上清液與新鮮DMEM 培養(yǎng)基1∶1 混合，并加入Polybrene（終濃度為8 μg/mL），混勻后感染提前鋪板的3T3 細胞（融合度為50%～65%），24 h 后換液，48 h后即可獲得表達抗體Fc突變的細胞文庫。

1.2.4 流式細胞術分析Phoenix 細胞的轉染效率和3T3 細胞的感染效率 胰酶消化收集Phoenix 細胞或者3T3 細胞，制備單細胞懸浮液，PBS 緩沖液洗滌2 次，并用含有DAPI（0.5 μg/mL）的200 μL 流式染色緩沖液重懸細胞，通過流式細胞儀分析。流式細胞術結果用FlowJo軟件分析。

1.2.5 基因組DNA 提取 取約1.5×106個3T3 細胞，500×g離 心5 min 取 上 清 液，PBS 緩 沖 液 洗 滌1 次，200 μL 無SDS 的基因組DNA 緩沖液［100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、 1 mmol/L EDTA］重懸，并加入4 μL濃度為10 μg/μL蛋白酶K，吹打混勻。然后加入200 μL 含有SDS 的基因組DNA緩 沖 液［100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA、1%SDS］，37 ℃反應4 h。反應結束后，加入400 μL 異丙醇，上下翻轉混勻，將會看到DNA 析出。然后用槍頭挑出DNA，加入800 μL 70%乙醇洗滌。再挑出DNA 晾干，最后加入100 μL ddH2O溶解，即獲得細胞基因組DNA。

1.2.6 高通量測序評估文庫構建情況 取大抽質粒約60 ng或者待分析細胞DNA作為模板，自建庫進行高通量測序（PE150），獲得500 萬～800 萬條序列。使用Flash 程序對數(shù)據(jù)進行拼接，得到高通量測序原始數(shù)據(jù)。提取突變區(qū)域的核苷酸序列，將其批量翻譯成對應的氨基酸序列（http：//www.cbs.dtu.dk/services/VirtualRibosome/）［10］，在Rstudio 和Excel 中進行數(shù)據(jù)分析，計算期望文庫突變在總文庫中出現(xiàn)的頻率。

2 結果

2.1 篩選與FcγRIIB 親和力增強的氨基酸單點突變

為了縮小影響FcγRIIB 親和力的氨基酸突變的范圍，我們首先選擇可能有直接影響的氨基酸位點，包括4 個區(qū)域，分別為EU 編號233～240、265～269、297～299、327～333 的位點［6］，對其進行單點的任意突變，并通過篩選確定這些氨基酸突變。結果顯示，流式細胞術分選后，與FcγRIIB 結合的細胞比例逐步增多（圖1）。對分選前后細胞進行測序分析，與野生型相比，表1 中的氨基酸增強了抗體Fc 與FcγRIIB的親和力。本研究選取區(qū)域1（EU 編號233～240的位點）構建Fc組合突變文庫。

第七，合理使用中藥和益生菌添加劑。在抗生素限用的時代，在防控疾病時，盡量采用中藥類制劑和微生態(tài)制劑，這樣可以避免殘留的發(fā)生，當然盡量做到不發(fā)病才是最好的。

圖1 分選前后點突變文庫的檢測Fig 1 Analysis of point mutation libraries before and after sorting

表1 EU編號233～240位點與FcγRIIB親和力增強的氨基酸Tab 1 Amino acids with enhanced affinity for FcγRIIB at 233-240 of EU numbring

2.2 高容量Fc組合突變質粒文庫的構建

由于多個氨基酸同時參與IgG 抗體Fc 和FcγR 相互作用，各個氨基酸位點突變并非簡單的加減關系，而可能具有復雜的相互影響。我們推測，同時考慮多個氨基酸位點的突變組合對獲得更好的優(yōu)化序列是必要的。因此，我們在已經獲得的單點氨基酸突變的基礎上，構建能夠覆蓋全部區(qū)域1 的氨基酸位點的組合突變文庫。

根據(jù)表1所示氨基酸設計簡并引物（表2），利用多個簡并引物構建質粒文庫，使得組合突變文庫包含表1 所示的所有突變氨基酸組合，同時盡可能降低簡并引物帶來的其他氨基酸突變。文庫中所包含的突變種類有11 520種（期望文庫多樣性，其計算方法為每個位點氨基酸種類相乘的結果，即6×4×4×4×5×3×2=11 520 種），增加到41 600 種（實際文庫多樣性，其計算方法為32 條簡并引物包含的突變氨基酸種類相加：3 072+256+……+1 152+96=41 600 種），是期望文庫多樣性的3.6倍。

表2 簡并引物的序列Tab 2 Sequences of the degenerate primers

2.3 按比例添加簡并引物可提高文庫的均一性與完整性

將簡并引物按等比例或者按引物所包含突變多樣性占比混合，進行PCR 連接轉化制備質粒文庫，對質粒文庫進行高通量測序分析。結果（表3）顯示：等比例混合引物時，在組合突變質粒文庫中有10 855種為期望文庫中的組合突變，即所構建的質粒文庫覆蓋了期望文庫中94.24%的組合突變，突變出現(xiàn)頻率大于等于10-6的比例為82.38%；而按一定比例混合引物時，在組合突變質粒文庫中有11 472種為期望文庫中的組合突變，即所構建的質粒文庫覆蓋了期望文庫中99.58%的組合突變，且出現(xiàn)頻率均大于等于10-6。隨機選取10 個單克隆菌落進行一代測序，結果（表4）顯示，10 條序列中有3 個為期望文庫的序列，另外7 個為簡并引物所引入的新的組合突變，同時比例也與上述3.6 倍基本相符。我們選取按突變種類占比混合引物制備的質粒文庫進行后續(xù)實驗。

表3 簡并引物等比例混合和按突變種類占比混合后質粒文庫的檢測結果Tab 3 Results of plasmid library after the degenerate primers mixed with equal proportion or according to the proportion of mutation diversity

表4 EU編號233～240位點Fc組合突變文庫的Sanger測序結果Tab 4 Sanger sequencing results of Fc combined mutation plasmid library at 233-240 of EU numbering

2.4 高容量Fc組合突變細胞文庫的構建

為了確保文庫中上萬種突變能通過轉染產生反轉錄病毒，而后感染3T3 細胞表達膜IgG，需要根據(jù)轉染效率來確定被轉染的Phoenix 細胞數(shù)量以及被感染的3T3 細胞數(shù)量。因此，本研究中，我們按照轉染/感染效率為40%，實際感染或感染細胞數(shù)為文庫的100 倍，轉染/感染時Phoenix 細胞/3T3 細胞融合度為50%，這3 個標準確定2 個15 cm 細胞培養(yǎng)皿的細胞數(shù)量即可滿足轉染/感染要求。

轉染Phoenix 細胞48 h 后，流式細胞術檢測Pheonix 細胞的包裝病毒時的轉染效率。結果（圖2A）顯示，與未轉染的Phoenix 細胞相比，Phoenix細胞突變文庫的GFP 表達水平為51.6%。反轉錄病毒感染3T3 細胞，48 h 后檢測3T3 細胞感染效率，結果（圖2B）顯示，約有47.4%的3T3 細胞有GFP 信號，提示細胞文庫初步構建成功。

圖2 Phoenix細胞的轉染效率（A）及3T3細胞的感染效率（B）Fig 2 Transfection efficiency in the Phoenix cells(A)and infection efficiency in the 3T3 cells(B)

2.5 高通量測序檢測Fc組合突變細胞文庫的質量

取轉染后的細胞提取DNA，進行高通量測序。結果（表5）表明，期望的組合突變在實際細胞文庫中可以檢測到9 898 種，占期望文庫的85.92%，只有14.08%的突變沒有被檢測到，成功構建了包含大部分期望氨基酸組合突變的細胞文庫。

表5 Fc組合突變細胞文庫的高通量測序結果分析Tab 5 Analysis of high throughput sequencing results of Fc combined mutant cell library

3 討論

單抗藥物的研發(fā)技術和平臺日漸成熟，其中通過重組抗體的方式在體外進行抗體文庫的構建已經成為單抗藥物研發(fā)的重要手段。為了能夠更加系統(tǒng)、全面地模擬自然突變的情況，需要設計高通量的抗體文庫。目前構建抗體文庫的方法主要有定點突變、硅蛋白設計［6-7］、噬菌體展示和酵母展示技術［8-10］等。其中，定點突變和硅蛋白設計方法受通量和成本的限制［11-12］；而高通量噬菌體展示和酵母展示技術，前者無法進行Fc 糖基化修飾，后者展示的糖蛋白包含高甘露糖，使得抗體在血清中會被很快清除［13-15］。哺乳動物細胞展示技術可以解決上述障礙，并可以在細胞表面展示具有正確折疊和翻譯后修飾的全人源化抗體［16］。本研究中，我們提供了一個基于單點突變文庫的篩選結果，分步構建大容量多組合突變文庫的方法，用于哺乳動物表面展示技術對Fc 變體的篩選。與前述方法相比，該技術有2 個優(yōu)點：①所構建的文庫大小可達到105，屬于高通量，便于后續(xù)篩選。②可進行翻譯后糖基化修飾，是Fc 工程的理想平臺。利用這種方法，我們成功構建了4.16×104多樣性的組合突變質粒文庫及對應細胞文庫。高通量測序分析這些文庫結果顯示實際文庫能夠覆蓋期望組合突變的99.58%（質粒文庫）或85.92%（細胞文庫），為后續(xù)構建更高容量突變文庫及高通量篩選Fc 組合突變變體打下了堅實的基礎。

Fc工程改造增加對FcγRIIB的結合能力被認為是一種有前景的方法?；贗gG1 的Fc 突變體V12（E233D/G237D/H268D/P271G/Y296D/A330R）［12］是目前已知的最大程度增強與FcγRIIB 的結合能力，且不增加與其他活化型FcγR 結合能力的Fc 變體。該研究在抗體鉸鏈下游區(qū)域和CH2 區(qū)域的約30 個氨基酸進行定點突變建庫篩選，并且考慮了從Fc/FcγRIIB復合體的晶體結構來優(yōu)化Fc 變體。其不足之處是V12 變體是通過定點突變方法發(fā)現(xiàn)的，受通量的限制，所有的變體數(shù)加起來不到1 000 個。與此相比，本研究有3 個方面的優(yōu)勢：①建庫分為2 步，首先在區(qū)域1 的7 個位點獲得與FcγRIIB 高親和力的氨基酸，然后基于這些氨基酸再進行組合突變。在Fc 中與FcγRIIB 相結合的4 個區(qū)域內，除了第3 個區(qū)域包含的氨基酸位點較少，其余的氨基酸個數(shù)為5～7個，如果要進行組合突變文庫的構建，直接用簡并引物的方法構建，每個位點包含20 種可能，所構建的文庫容量將達到205～207。根據(jù)現(xiàn)有條件，利用哺乳動物細胞表面展示法處理容量如此大的文庫有技術限制，而且后續(xù)的分選工作也難以進行。因此，本研究先對單點突變文庫進行了一輪篩選，獲得與FcγRIIB 高親和力的一些氨基酸，以這些與FcγRIIB 有結合優(yōu)勢的氨基酸突變?yōu)榛A，進行組合突變時可縮小文庫的大小，使得后續(xù)的文庫構建和分選更易進行。②利用簡并引物來構建文庫時，按照每條引物所包含突變多樣性占比混合引物制備的文庫更均一，實際文庫覆蓋期望文庫的比例更高，在質粒文庫中能夠達到99%以上。同時，一代測序結果中，出現(xiàn)的突變個數(shù)的比例也正好符合實際文庫和期望文庫的比值。③效率高，成本低。設計包含11 520種突變的文庫，若每種組合突變合成1 條引物，則需要合成11 520 條引物，成本太高，而且操作起來極其困難。本研究僅用32 條引物就可以通過PCR 產生上萬種突變，每條引物能包括多種可能性，同時又盡可能降低了文庫的大小，既節(jié)省了成本，又大大降低了操作難度。

質粒文庫準備就緒之后，需要通過反轉錄病毒感染3T3 細胞獲得細胞文庫。與對照相比，Phoenix 細胞包裝病毒的效率為51.6%，而3T3 細胞被感染的效率為47.4%，基本符合預期，初步提示文庫構建成功。最后，再通過高通量測序檢測細胞文庫的完整性，結果顯示，85.92%的突變包含在細胞文庫中，未檢測到的突變原因有可能是因為高通量測序所使用的模板不能夠完全覆蓋我們所制備的細胞文庫導致的。不過上述質粒文庫和細胞文庫的高通量測序結果也顯示我們構建了高質量的抗體Fc 組合突變文庫。這說明本研究的設計可以為抗體文庫的構建提供一種較好的方法思路。

綜上所述，本研究成功構建了一個包含41 600種IgG-Fc變體的組合突變膜抗體庫。通過簡并引物獲得質粒文庫，成本低且易操作，為構建細胞文庫提供了基礎。哺乳動物細胞表面展示技術獲得的抗體庫，具有可展示全長抗體、高通量、可進行糖基化修飾等優(yōu)點，因而展示的抗體在分子結構、理化特性和生物學功能方面接近于天然的高等生物蛋白質分子。在進行質粒轉染或者病毒感染的過程中，較難保證只有1 種外源DNA 進入單個細胞。不過，我們在實驗設計時將被感染成功的細胞數(shù)設定在實際文庫大小的100 倍左右，保證了只有多次進入細胞并且編碼高親和力Fc 突變序列才會被篩選出來，盡量減少篩選結果的隨機性。哺乳動物細胞表面展示技術具有很大的優(yōu)勢與開發(fā)潛力，本研究中所討論的建庫方法適用于所有類型的蛋白，并不局限于IgG，還可用于單鏈可變區(qū)片段（ScFv）［17］、病毒膜蛋白［18］等。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

上海交通大學醫(yī)學院已申請專利“FcγRIIB 親和力增強的抗體Fc區(qū)”（PCT/CN2020/133685，待審），發(fā)明人為李福彬、張燕、張咪、畢艷俠、田世豪、張慧慧和柳淑君。所有作者聲明不存在其他利益沖突。

A patent application titled “Antibody Fc region having enhanced FcγRIIB affinity” has been filed by Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （PCT/CN2020/133685， pending）， and the listed inventors are LI Fubin， ZHANG Yan， ZHANG Mi， BI Yanxia， TIAN Shihao， ZHANG Huihui， and LIU Shujun.All the authors disclose no other relevant conflicts of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

李福彬、張燕參與了實驗設計；張燕、張咪參與了實驗操作；張燕、張咪和柳淑君參與了數(shù)據(jù)分析；張咪、張燕和李福彬參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LI Fubin and ZHANG Yan. The experiments were performed by ZHANG Yan and ZHANG Mi. The results were analyzed by ZHANG Yan， ZHANG Mi and LIU Shujun.The manuscript was drafted and revised by ZHANG Mi， ZHANG Yan and LI Fubin. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-01

·Accepted：2022-04-25

·Published online：2022-04-28