生姜細(xì)胞外囊泡樣納米粒載吳茱萸堿的處方工藝及體外釋藥研究

趙夢(mèng),劉卓雅,于嘉敏,王芮, 范銘婕,喬宏志,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;3.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023)

吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)是蕓香科植物吳茱萸、石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中的主要生物堿成分,具有抗腫瘤、抗胃潰瘍、抗炎、抗肥胖等多種藥理活性[1],但存在水溶性差、生物利用度低等弊端。為了克服上述問(wèn)題,研究人員制備了脂質(zhì)體[2-4]、脂質(zhì)納米粒[5]等脂基新制劑,均顯示出對(duì)EVO成藥性的改善作用。

近年來(lái),從多種植物鮮榨汁中分離到一種以脂質(zhì)雙層為基本骨架,包含蛋白、核酸等活性成分的泡狀納米結(jié)構(gòu),被命名為細(xì)胞外囊泡樣納米粒(Extracellular vesicle-like nanoparticles,EVNs)[6]。EVNs保留了原植物的組成和活性功能,在腫瘤、腸炎、酒精肝、肺纖維化等疾病的治療方面有明顯療效[7]。此外,從EVNs提取的脂質(zhì)還可用于裝載親疏水小分子藥物及核酸藥物等[8-10],發(fā)揮載體作用。例如將6-姜烯酚載入生姜EVNs來(lái)源脂質(zhì)后,可減緩釋藥速度,提高生物利用度,用于治療結(jié)腸炎[11]。有報(bào)道顯示EVNs來(lái)源的脂質(zhì)還具有特定的轉(zhuǎn)運(yùn)趨向性,可以引導(dǎo)藥物到達(dá)特定的部位。例如生姜EVNs脂質(zhì)中含有的磷脂酸與EVNs在腸道的積累相關(guān),磷脂酰膽堿促進(jìn)EVNs從腸道向肝臟轉(zhuǎn)移[12];用葡萄柚EVNs脂質(zhì)制備的納米粒能攜帶JSI-124靶向抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]。

生姜是常見(jiàn)的藥食同源中藥，生姜來(lái)源的EVNs對(duì)結(jié)腸炎[13]、牙周炎[14]、酒精性肝損傷[15]等多種疾病有效。目前已有研究通過(guò)脂質(zhì)譜學(xué)分析，證明生姜來(lái)源EVNs中含有多種脂質(zhì)成分，例如磷脂酸(PA)、雙半乳糖甘油二酯(DGDG)、單半乳糖甘油二酯(MGDG)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)等[16]。本文以生姜來(lái)源EVNs為對(duì)象，提取其脂質(zhì)用于EVO的裝載，將考察脂質(zhì)提取條件、載EVO脂質(zhì)體(EVO@Lipo)的工藝影響因素及體外釋藥行為，以期改善EVO成藥性，考察生姜EVNs來(lái)源脂質(zhì)的載釋藥性能。

1 材料與方法

1.1 儀器

美的MJ-WJE2802D榨汁機(jī)(美的集團(tuán)有限公司);Optima XP1超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);Regulus 8100掃描電子顯微鏡(日本日立公司);Eppendorf低溫臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國(guó)Malvern公司);Zetasizer Nano-ZS90(英國(guó) Malvern公司);BT 25S十萬(wàn)分之一天平、Waters E2695 HPLC(美國(guó)Waters公司);THZ-C恒溫震蕩箱(蘇州培英公司);JY96-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(德國(guó)Sartorius公司);DSC 214差示掃描量熱儀(德國(guó)耐馳);紅外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司);Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑

鮮生姜購(gòu)于山東濰坊,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室胡楊老師鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖;甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈、二氯甲烷(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);8 000～14 000 Da透析袋、吳茱萸堿(上海源葉生物科技有限公司,吳茱萸堿分子量:303.36,批號(hào):X26A8P34704,純度>98%);乙腈(色譜純,美國(guó)默克公司);10×PBS緩沖液干粉(pH 7.4,南京邁博生物科技有限公司);0.45 μm微孔濾膜(南京邁博生物科技有限公司);ODS-2 C18柱(江蘇漢邦科技有限公司)。

1.3 EVNs分離和表征

采用差速離心法提取EVNs,將生姜清洗干凈,榨汁,汁液加入相同體積的1×PBS緩沖液(pH 7.4),置于離心管中4 000×g離心1 h,去除大塊組織,取上清,10 000×g離心1 h,離心后取上清,120 000×g超高速離心2 h,將下層沉淀用適量PBS分散得到EVNs,用濃度為8%、30%、45%、60%的蔗糖進(jìn)行密度梯度離心,120 000×g超高速離心2 h,收集條帶,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取EVNs稀釋后采用納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)測(cè)定粒徑,動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)測(cè)定多分散系數(shù)(PDI)及Zeta電位,并將EVNs烘干,噴金鍍膜后,使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察EVNs的形貌。

1.4 脂質(zhì)提取和溶劑篩選

取1 mL EVNs(1×1010mL-1),加入有機(jī)溶劑3.75 mL,渦旋混勻后再加入有機(jī)溶劑和水各1 mL,混勻,22 ℃下2 000 r·min-1離心10 min[16],取有機(jī)層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑得到干燥脂膜,稱質(zhì)量。以脂質(zhì)與EVNs干質(zhì)量的比值計(jì)算脂質(zhì)提取率。

以脂質(zhì)提取率、脂質(zhì)體粒徑和濃度為指標(biāo),篩選脂質(zhì)提取的最適溶劑。選取的有機(jī)溶劑分別為:三氯甲烷、乙醇-三氯甲烷、丙酮-三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷-乙醇、乙腈-二氯甲烷、乙腈-三氯甲烷、二氯甲烷-三氯甲烷,丙酮-二氯甲烷共11組,其中混合溶劑的比例均為2∶1。

1.5 EVO體外分析方法建立

1.5.1 色譜條件 色譜柱:ODS-2 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(55∶45,v/v);檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:20 μL。

1.5.2 專屬性考察 稱取處方量的脂質(zhì),制備空白脂質(zhì)體(Lipo)及EVO@Lipo,取1 mL至10 mL容量瓶中,加入三氯甲烷-甲醇(1∶1,v/v)超聲破乳,并稀釋定容至10 mL,15 000 r·min-1離心15 min,取上清及EVO對(duì)照品溶液各20 μL進(jìn)樣分析。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以甲醇為溶劑,制備濃度為1、5、10、20、100 μg·mL-1的EVO對(duì)照品溶液,15 000 r·min-1離心15 min,取上清按色譜條件測(cè)定,以藥物濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 EVO@Lipo的制備與包封率測(cè)定

取0.2 mg EVO及脂質(zhì)溶于甲醇-三氯甲烷中,超聲溶解,于37 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶劑揮干,形成干燥薄膜,向燒瓶中加入1 mL超純水,超聲水化,探頭超聲(工作1 s,間歇1 s),空白脂質(zhì)體的制備方法除不加入EVO外,其余步驟與條件相同。

取1 mL EVO@Lipo溶液,過(guò)0.45 μm濾膜,取過(guò)膜后的液體1 mL,加入1 mL三氯甲烷-甲醇(1∶1,v/v)超聲破乳,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容,隨后15 000 r·min-1離心15 min,取上清測(cè)定含量,得到其質(zhì)量記為WLipo。取脂質(zhì)體1 mL,加入1 mL三氯甲烷超聲破乳,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容,15 000 r·min-1離心15 min,取上清測(cè)定含量,得到其質(zhì)量記為WTotal。包封率(Encapsulation efficiency,EE%)按下式計(jì)算:

1.7 處方及制備工藝優(yōu)化

1.7.1 影響因素考察 由于本實(shí)驗(yàn)脂質(zhì)的組成由提取溶劑決定,故提取溶劑是本實(shí)驗(yàn)重要的影響因素,除此之外,在脂質(zhì)體的制備過(guò)程中,藥載比也是常見(jiàn)且重要的影響因素。經(jīng)過(guò)前期的因素篩選,我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體的制備過(guò)程中探頭超聲的條件會(huì)造成粒徑及粒子濃度的變化,因此我們對(duì)超聲過(guò)程的時(shí)間及功率進(jìn)行單因素篩選,并對(duì)脂質(zhì)體的粒徑及粒子濃度進(jìn)行測(cè)定,觀察其變化。

1.7.2 正交試驗(yàn) 為確定脂質(zhì)體載藥的最優(yōu)條件,以提取溶劑、藥脂比、超聲條件3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn),通過(guò)包封率進(jìn)行篩選。

1.8 EVO@Lipo的表征

1.8.1 形貌 取EVO@Lipo稀釋后將其烘干,噴金鍍膜后,使用SEM觀察形貌。

1.8.2 粒徑、PDI、電位 取EVO@Lipo稀釋后采用NTA測(cè)定粒徑,DLS測(cè)定PDI及Zeta電位。

1.8.3 差示掃描量熱(DSC)分析 取EVO、Lipo、物理混合物及EVO@Lipo的凍干樣品置于坩堝內(nèi),測(cè)定0～300 ℃的DSC曲線。

1.8.4 傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 取EVO、Lipo、物理混合物及EVO@Lipo的凍干樣品,KBr壓片后,在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

1.9 體外釋放度測(cè)定

選擇膜透析法測(cè)定脂質(zhì)體的體外釋放度[3]。釋放介質(zhì)為30%乙醇的PBS溶液(pH 1.2、pH 6.8),精密吸取EVO及EVO@Lipo溶液各3份,置于處理好的透析袋中(Mw=8 000～14 000 Da),密封后置于100 mL釋放介質(zhì)中,在37 ℃,100 r·min-1條件下恒溫震蕩。分別在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h吸取透析液2 mL,并立即補(bǔ)充等量同溫度的釋放介質(zhì),保持藥物釋放處于漏槽狀態(tài)。隨后將樣品過(guò)0.45 μm的濾膜,取續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算累計(jì)釋放量Qn和釋放百分率F。

式中Cn為第n次取樣時(shí)的EVO濃度,Ci為第i次取樣時(shí)的EVO濃度,V0為釋放介質(zhì)體積,Vi為每次取樣的體積,W為樣品中EVO總量。

1.10 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 EVNs的表征

2.1.1 形貌 如圖1所示,提取得到的EVNs形貌為不規(guī)則圓球狀,粒子大小為200 nm左右。

圖1 EVNs的SEM圖像

2.1.2 粒徑、PDI、Zeta電位 如表1所示,提取的EVNs平均粒徑為(230.4±3.3)nm,與SEM圖像中的結(jié)果一致。

表1 EVNs的粒徑、PDI及Zeta電位

2.2 EVO體外分析方法建立

2.2.1 專屬性 如圖2所示，EVO的HPLC圖譜中,脂質(zhì)體在EVO出峰的位置沒(méi)有雜峰干擾,表明專屬性符合測(cè)試要求。

圖2 EVO及EVO@Lipo溶液的HPLC圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=301 768X+81 082,R2=1,EVO在1～100 μg·mL-1峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該測(cè)定方法及條件下,EVO的精密度重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性均符合要求。在液相條件下未檢出EVO,表明其在水中的溶解度極低。

2.3 EVO@Lipo處方工藝篩選

2.3.1 脂質(zhì)提取溶劑篩選 如表2所示,三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、乙醇-二氯甲烷、二氯甲烷-三氯甲烷組脂質(zhì)提取率大于5%,其中乙醇-二氯甲烷組提取率接近10%,其余各組脂質(zhì)提取率均較低。制備得到的空白脂質(zhì)體粒徑均處于100～200 nm,其粒子濃度也處于同一數(shù)量級(jí)1010。三氯甲烷、乙醇-三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷、丙酮-二氯甲烷組粒度RSD值小于0.02。

表2 不同提取溶劑下脂質(zhì)提取率及空白脂質(zhì)體粒徑

綜合以上指標(biāo)的分析,可以優(yōu)先選用三氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、乙醇-二氯甲烷3組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),乙醇-三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮-二氯甲烷3組作為備選。

2.3.2 超聲因素考察 結(jié)果見(jiàn)表3～4,當(dāng)超聲時(shí)間改變時(shí)粒徑及粒子濃度變化較大,故選擇超聲時(shí)間為影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn),超聲功率選用60 W。

表3 超聲時(shí)間對(duì)粒徑的影響

表4 超聲功率對(duì)粒徑的影響

2.3.3 正交試驗(yàn) 以A(脂質(zhì)提取溶劑),B(藥脂比),C(超聲時(shí)間)為3個(gè)因素,進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn),見(jiàn)表5。

表5 正交試驗(yàn)因素

從表6中數(shù)據(jù)可得，極差分析證明，各因素對(duì)包封率的影響程度為：B>A>C，最佳實(shí)驗(yàn)組合為A2B3C3，即以甲醇-三氯甲烷為脂質(zhì)提取溶劑，藥脂比為1∶50，超聲總時(shí)長(zhǎng)為15 min，經(jīng)驗(yàn)證，該處方的包封率為88.21%，藥物濃度為16.7 μg·mL-1。方差分析結(jié)果顯示3種因素對(duì)包封率的影響不顯著(表7)。

表6 正交試驗(yàn)分組及結(jié)果

表7 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 EVO@Lipo表征

2.4.1 形貌 SEM觀察顯示,EVO@Lipo的外觀呈球形,分散較均勻,無(wú)明顯聚集現(xiàn)象,粒徑約150 nm。見(jiàn)圖3。

圖3 EVO@Lipo的SEM圖像

2.4.2 粒徑、PDI、Zeta電位 制備得到的EVO@Lipo平均粒徑為(194.9±2.4)nm,PDI為0.22±0.01,證明其均一性良好,Zeta電位為(-35.3±1.16)mV，證明該體系穩(wěn)定。見(jiàn)表8。

表8 EVO@Lipo的粒徑、PDI及Zeta電位

2.4.3 DSC分析 如圖4可見(jiàn),對(duì)DSC曲線進(jìn)行分析,EVO的熔融吸熱峰位于286 ℃,Lipo在129 ℃出現(xiàn)吸熱峰;二者的物理混合物分別在126 ℃及274 ℃有2個(gè)吸熱峰,其中EVO吸熱峰的偏移可能暗示在加熱過(guò)程中有新相形成;EVO@Lipo的吸熱峰出現(xiàn)在139 ℃,且不存在EVO的吸熱峰,證明EVO可能以分子或無(wú)定型相態(tài)存在。

圖4 DSC曲線變化

2.4.4 傅里葉變換紅外光譜 如圖5所示，EVO的紅外光譜圖中,3 220 cm-1為N—H的伸縮振動(dòng)吸收峰,1 700～1 600 cm-1之間的峰為苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)峰,它們是苯環(huán)的特征振動(dòng),除此之外,1 629 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰;Lipo在3 374 cm-1及2 930 cm-1分別出現(xiàn)O—H伸縮振動(dòng)及C—H伸縮振動(dòng)吸收峰;在物理混合物中,1 629 cm-1為EVO的C=O伸縮振動(dòng)吸收峰,2 931 cm-1為脂質(zhì)的C—H伸縮振動(dòng)吸收峰,基本是二者各自圖譜的疊加,而在EVO@Lipo中,EVO的N—H伸縮振動(dòng)吸收峰為3 221 cm-1,C=O伸縮振動(dòng)吸收峰移動(dòng)至1 606 cm-1,C—H伸縮振動(dòng)吸收峰移動(dòng)至2 941 cm-1,證明EVO與脂質(zhì)發(fā)生了相互作用。

圖5 紅外圖譜變化

2.5 體外釋放度實(shí)驗(yàn)

如圖6所示,當(dāng)pH為1.2和6.8時(shí),對(duì)照品EVO在1 h時(shí)釋放度均到達(dá)50%,2 h時(shí),釋放度分別達(dá)到76%和85%;而將其制備成脂質(zhì)體后,在24 h內(nèi),其體外釋藥速度降低,說(shuō)明將EVO制備成脂質(zhì)體后,具有一定的緩釋作用。

圖6 EVO及EVO@Lipo在PBS中的累計(jì)釋放度

3 討論

EVNs具有蛋白脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu),被膜材料包裹的囊腔為活性分子的裝載提供了空間,具有廣泛的運(yùn)載能力,可裝載親疏水藥物和核酸藥物等[8-9]。此外,借助其納米級(jí)特性,EVNs還可以改善藥物的滲透性和組織滲透性。EVNs通常以2種方式作為載體,一種是直接使用分離的EVNs進(jìn)行藥物裝載,另一種方法是提取EVNs的脂質(zhì)組分并重新組裝,或插入功能基團(tuán)作為復(fù)合載體。目前囊泡類載體的載藥方法主要包括共孵育、電穿孔、超聲、凍融、皂苷增溶等[17]。除了直接將EVNs用作藥物載體,大多數(shù)會(huì)先提取EVNs的脂質(zhì)后再進(jìn)行載藥或工程化修飾,該過(guò)程去除了蛋白、核酸等水性成分,既有利于減少免疫原性,也避免制備載藥制劑過(guò)程因有機(jī)溶劑的加入導(dǎo)致蛋白等成分的沉淀。

EVO作為一種具有多種藥理活性的生物堿類化合物,存在水溶性差,生物利用度低等問(wèn)題,可采用制劑學(xué)手段加以改善。在本文中,我們從生姜EVNs中提取脂質(zhì),制備載EVO的脂質(zhì)體。通過(guò)不同提取溶劑的篩選,可以變換處方中的脂質(zhì)組成,最終制備的載藥脂質(zhì)體能增大EVO的溶解度,并使其在體外緩慢釋放,從不同pH條件下的溶出曲線看,EVO的釋放并未受pH變化影響。本研究為研發(fā)藥源性功能載體,以期協(xié)同增強(qiáng)EVO的藥效提供了參考方法。