半滑舌鰨白細(xì)胞介素12的p35a和p40c亞基在哈維氏弧菌感染下的表達(dá)和調(diào)控分析*

張志華 馮 博 朱騰飛 郝先才 王 倩 邵長(zhǎng)偉 王洪巖

半滑舌鰨白細(xì)胞介素12的和亞基在哈維氏弧菌感染下的表達(dá)和調(diào)控分析*

張志華1,2馮 博1,2朱騰飛2郝先才2王 倩2邵長(zhǎng)偉2王洪巖2①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071)

本研究以海水養(yǎng)殖魚(yú)類半滑舌鰨()為研究對(duì)象，克隆了白細(xì)胞介素12 (IL-12)的亞基和亞基的基因編碼區(qū)序列，編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為651 bp和984 bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，半滑舌鰨的和分別與其他魚(yú)類對(duì)應(yīng)的基因聚為一支。氨基酸同源性分析顯示，與紅鰭東方鲀()相似性最高，與三棘刺魚(yú)()相似性最高，分別為52.04%和48.67%。組織表達(dá)分析顯示，在鰓、腦、心和卵巢中表達(dá)量較高，在肝、脾、鰓和心中表達(dá)量較高。通過(guò)哈維氏弧菌()感染實(shí)驗(yàn)，分析了半滑舌鰨及其相關(guān)基因(和)在哈維氏弧菌感染過(guò)程中的表達(dá)模式，在脾中，48 h表達(dá)顯著上升(<0.05)，之后表達(dá)逐漸下降；在肝和腸中，72 h表達(dá)顯著上升。在脾、肝中，6 h表達(dá)顯著上升；在腎中，48 h產(chǎn)生上調(diào)；在腸中，6 h開(kāi)始上調(diào)，并在48 h上升至最高點(diǎn)。在肝和腸中，均在表達(dá)上調(diào)之前顯著升高，在脾中晚于上調(diào)表達(dá)；在肝、脾、腎、腸中表達(dá)趨勢(shì)中均與的表達(dá)趨勢(shì)相反。將半滑舌鰨淋巴細(xì)胞過(guò)表達(dá)和基因后，檢測(cè)了受不同濃度脂多糖(LPS)刺激后干擾素()、腫瘤壞死因子(和)等免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，能夠顯著提高在LPS刺激下的表達(dá)水平。上述結(jié)果表明，IL-12的亞基和亞基能夠響應(yīng)哈維氏弧菌對(duì)半滑舌鰨的刺激，過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)誘導(dǎo)基因的表達(dá)來(lái)參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。研究結(jié)果可為IL-12作為半滑舌鰨抗哈維氏弧菌疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

半滑舌鰨；免疫應(yīng)答；白細(xì)胞介素12；哈維氏弧菌

白細(xì)胞介素12 (interleukin 12，IL-12)是一種在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有多效效應(yīng)的細(xì)胞因子(Watford, 2003)。IL-12蛋白是由P35亞基和P40亞基通過(guò)二硫鍵共價(jià)連接形成的異源二聚體(Jones, 2011)，主要由抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)和吞噬細(xì)胞產(chǎn)生(Vignali, 2012)。Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)識(shí)別病原相關(guān)分子模式介導(dǎo)IL-12的產(chǎn)生和釋放。在樹(shù)突狀細(xì)胞中，病原體通過(guò)結(jié)合TLR刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生初始的IL-12。而在巨噬細(xì)胞中，IL-12的產(chǎn)生必須有干擾素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)等輔助細(xì)胞因子的參與(Gee, 2009)。研究表明，P35亞基和P40亞基在同一細(xì)胞中表達(dá)，才能產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的IL-12異源二聚體(Schoenhaut, 1992)。在缺乏P35亞基時(shí)P40亞基以單體或同二聚體的形式分泌，并與IL-12受體結(jié)合，從而抑制IL-12的活性。P35亞基不能單獨(dú)分泌到胞外，只能在與P40亞基結(jié)合后才能共同分泌，由于P35亞基的mRNA表達(dá)量較低，被認(rèn)為是IL-12異源二聚體形成的限制因素(Gillessen, 1995)。前期研究表明，CD4+T細(xì)胞與APCs結(jié)合后，IL-12作為主要細(xì)胞因子，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化(Manetti, 1993)，而IL-10能夠抑制Th1細(xì)胞分化(Hsieh, 1993)。綜上所述，IL-12協(xié)調(diào)先天性免疫和適應(yīng)性免疫，參與了宿主和病原體之間的相互作用，在清除細(xì)胞內(nèi)病原體中具有重要作用(Prochazkova, 2012)。

半滑舌鰨是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(Song, 2016)，工廠化高密度養(yǎng)殖程度較高，以哈維氏弧菌()為主的細(xì)菌病在其養(yǎng)殖過(guò)程中造成了較高的死亡率，迫切需要開(kāi)展免疫防控技術(shù)研究，提高半滑舌鰨對(duì)哈維氏弧菌病的抗病力。本課題組已完成半滑舌鰨全基因組測(cè)序(Chen, 2014)，前期利用全基因組選擇技術(shù)篩選出對(duì)哈維氏弧菌病抗病力高的親魚(yú)(Liu, 2018)；克隆與分析了、等多個(gè)與哈維氏弧菌病相關(guān)的免疫基因(Li, 2020; Wang, 2019; Wei, 2018a、2018b、2019)。本研究克隆半滑舌鰨和的編碼序列，并分析、及相關(guān)免疫基因(和)在半滑舌鰨哈維氏弧菌感染過(guò)程中的表達(dá)模式。同時(shí)，利用半滑舌鰨淋巴細(xì)胞過(guò)表達(dá)和，并進(jìn)行LPS刺激，探究半滑舌鰨IL-12參與免疫應(yīng)答的可能調(diào)控途徑，以期為研制半滑舌鰨哈維氏弧菌病的疫苗佐劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

本實(shí)驗(yàn)所用半滑舌鰨均來(lái)自明波水產(chǎn)養(yǎng)殖公司(山東萊州)。隨機(jī)取3條健康的半滑舌鰨成魚(yú)，麻醉后分別取胃、腸、脾臟、肝臟、心臟、腎臟、性腺、鰓、腦和肌肉，分裝至凍存管后迅速在液氮中冷凍，取出后，保存于–80℃超低溫冰箱。哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)使用40條健康半滑舌鰨，體長(zhǎng)為(41.0±2.7) cm，體重為(438.4±53.0) g，具體實(shí)驗(yàn)方案參照之前操作步驟(Wei, 2018b)，腹腔注射的哈維氏弧菌濃度為1×104CFU/mL，注射劑量為4 μL/g。分別在注射后的6、16、48、72和96 h進(jìn)行樣品采集，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)選取5條魚(yú)，將魚(yú)麻醉，采集肝臟、腎臟、脾臟、腸4個(gè)免疫相關(guān)組織，采集的樣品用錫紙包裹后迅速放入液氮中，之后保存于–80℃超低溫冰箱。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法提取半滑舌鰨各組織中的RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，之后使用極微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度與純度，從而獲得符合實(shí)驗(yàn)要求的RNA。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。

1.3 p35a和p40c基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)已發(fā)表的半滑舌鰨全基因組序列獲得和的預(yù)測(cè)序列，根據(jù)序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，以免疫組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證編碼區(qū)序列，PCR反應(yīng)體系：La酶(TaKaRa) 0.5 μL，dNTP 8 μL，10×buffer 5 μL，滅菌去離子水33.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL；反應(yīng)程序：94℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)(98℃ 12 s，65℃ 30s，72℃ 2 min)，72℃ 10 min。之后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，切下單一條帶的PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒(Vazyme)進(jìn)行回收純化，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-T1 (TIANGEN)載體，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)基因克隆實(shí)驗(yàn)，最后挑取陽(yáng)性克隆交由華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物學(xué)分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

測(cè)序后的結(jié)果使用DNAMAN和SnapGene進(jìn)行比對(duì)和分析，得到所克隆的半滑舌鰨的和的編碼序列，根據(jù)編碼區(qū)序列使用ExPASy (http://web. expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)蛋白分子量及等電點(diǎn)；利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用PyMOL預(yù)測(cè)IL-12的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型；多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建所需的氨基酸序列均來(lái)源于Ensemble和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)；通過(guò)MEGA 7.0，使用鄰接法(neighbor joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(bootstrap＝1000)。

1.5 p35a和p40c及相關(guān)基因表達(dá)模式檢測(cè)

選取各組織中1 μg的RNA，利用Prime Script RT reagent試劑盒(TaKaRa, 日本)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。通過(guò)-qF/R和-qF/R引物(表1)，利用Quantinova SYBR Green PCR試劑盒(QiaQen)進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為20 μL，分別包含1 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix (2×)、2 μL ROX Reference Dye、0.7 μmol/L的上游和下游引物以及5.6μL無(wú)菌水。反應(yīng)在ABI StepOnePlus_Real-Time PCR System (Applied Biosystems, 美國(guó))上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95℃2 min；95℃ 5 s, 60℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s, 60℃ 1 min, +1℃/min, 95℃ 15 s。使用-作為內(nèi)參(-qF/R) (表1)。每個(gè)反應(yīng)體系重復(fù)3次。使用2–ΔΔCt方法分析、及其相關(guān)基因在半滑舌鰨各組織、哈維氏弧菌感染的免疫組織及細(xì)胞樣品中的表達(dá)水平。使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，設(shè)定<0.05為差異顯著。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物

Tab.1 Primers used in the experiments

1.6 半滑舌鰨p35a和p40c過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

使用ClonExpress Ⅱ One Step cloning kit-C112 (Vazyme)對(duì)pHAGE載體和、的編碼區(qū)序列分別進(jìn)行重組，得到pHAGE-和pHAGE-重組載體。將重組后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)鑒定出的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，以確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。篩選準(zhǔn)確的單細(xì)胞克隆菌株進(jìn)行培養(yǎng)，使用EndoFree mini plasmid kit Ⅱ(TIANGEN)，獲得半滑舌鰨的和過(guò)表達(dá)載體。

1.7 半滑舌鰨原代細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與LPS處理

將健康的半滑舌鰨放于18℃～20℃高雙抗消毒海水(1000 μg/mL鏈霉素，1000 IU/mL青霉素)中暫養(yǎng)12～24 h后，在實(shí)驗(yàn)前將魚(yú)放入75%酒精中浸泡1～2 min，于超凈工作臺(tái)中，用注射器抽取半滑舌鰨血液，使用含有抗凝劑的PBS重懸細(xì)胞，過(guò)40 μm細(xì)胞篩，再用PBS漂洗3遍，收集沉淀。之后，用5% FBS-DMEM/ F12培養(yǎng)液充分懸浮并均勻接種于T25培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至約2×106個(gè)/mL，在24℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)。24 h后，將細(xì)胞所用培養(yǎng)液更換為DMEM/F12，分別添加10%胎牛血清(FBS)、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素、40 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF和40 ng/mL IGF-I。使用Lipo2000 (Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每孔添加2.5 μg質(zhì)粒(對(duì)照組添加空質(zhì)粒)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作。分別用不同濃度的LPS (0、1、10 mg/L)進(jìn)行處理，在24 h收集細(xì)胞置于–80℃冰箱中，留待后續(xù)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 p35a和p40c基因編碼區(qū)克隆、序列分析和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)

完成了半滑舌鰨和基因編碼區(qū)序列的克隆，其中，的ORF為651 bp，編碼216個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量為24.11 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為7.49 (圖1)；的ORF為984 bp，編碼327個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量為37.78 kDa，pI為6.57(圖2)。將和的cDNA比對(duì)基因組DNA，顯示和都包含7個(gè)外顯子。

通過(guò)SMART進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，P35a蛋白中存在1個(gè)IL-12蛋白結(jié)構(gòu)域；P40c存在3個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，分別為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(IG)、IL-12p40_c結(jié)構(gòu)域和Ⅰ類細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)域(d1f42a3)。其中，P40c還具有1個(gè)信號(hào)肽(圖3)。使用PyMOL同源建模半滑舌鰨P35a和P40c的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，半滑舌鰨的P35a蛋白含有較多的α-螺旋，為P35典型四螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；半滑舌鰨P40c蛋白則含有較多的β折疊；P35a蛋白和P40c蛋白以類似于配體和受體結(jié)合的方式，共價(jià)結(jié)合形成異源二聚體(圖4)。

圖1 半滑舌鰨p35a基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列

方框內(nèi)為起始密碼子、終止密碼子。圖2同

The box contains start codon and stop codon. The same as in Fig.2

圖2 半滑舌鰨p40c基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列

圖3 半滑舌鰨p35a和p40c的基因結(jié)構(gòu)示意圖及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖4 P35a、P40c和IL-12蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

A: P35a; B: P40c; C: IL-12

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和多序列比對(duì)分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，P35與P40均聚為4支，其中，P35分為魚(yú)的P35a、P35b，鳥(niǎo)類的P35和哺乳動(dòng)物的P35 (圖5A)，P40分別為魚(yú)類的P40a、P40b，P40c以及鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物的P40 (圖5B)。半滑舌鰨的P35和P40分別與魚(yú)類的P35a和P40c聚為一支，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化關(guān)系上更為接近。

半滑舌鰨P35a和P40c蛋白序列與其他物種蛋白序列的比對(duì)分析結(jié)果見(jiàn)表2 (所用物種氨基酸序列同系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)所用氨基酸序列一致)。P35a蛋白與紅鰭東方鲀的P35a蛋白相似性最高，為52.04%。P40c蛋白與三棘刺魚(yú)()的P40c蛋白的序列相似性最高，為48.67%。

2.3 組織表達(dá)模式

和在半滑舌鰨不同組織的表達(dá)顯示，基因在鰓、心、腦和卵巢等組織表達(dá)水平較高，在其他組織中也有一定程度表達(dá)；基因在肝中表達(dá)水平最高，在脾和鰓中有較高表達(dá)，在心臟、精巢和胃中也有一定程度的表達(dá)，而在腎和肌肉中幾乎不表達(dá)(圖6)。

2.4 p35a和p40c在哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)分析

哈維氏弧菌感染后，和在脾、肝、腎和腸中均有顯著性表達(dá)差異。在脾臟和肝臟中的表達(dá)模式相似。在脾中，在6 h顯著升高，之后表達(dá)逐漸降低；在48 h顯著升高，之后表達(dá)逐漸降低。在肝中，同樣在6 h顯著升高；但在72 h才顯著升高。在腎和腸中，和則呈現(xiàn)出與之不同的表達(dá)模式。在腸中，率先在6 h上調(diào)，之后持續(xù)上調(diào)到48 h表達(dá)最高，維持高表達(dá)到72 h，之后在96 h與一起下調(diào)。在6 h升高，中間表達(dá)量降低，于48 h表達(dá)最高，之后表達(dá)量逐漸下降；在48 h顯著升高，之后逐漸降低(圖7)。

2.5 IL-12相關(guān)基因(ifn-γ、il-10)在哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)分析

哈維氏弧菌注射后，在脾臟和腸道中的表達(dá)模式相似，表達(dá)在6 h開(kāi)始升高，在16 h達(dá)到最高，之后表達(dá)逐漸下降。在脾中，16 h表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，在開(kāi)始下降后的第48小時(shí)達(dá)到最高，之后表達(dá)逐漸下降；在腸中差異情況較小。和在腎臟和肝臟中的表達(dá)模式相似，和均在6 h顯著上調(diào)，之后在脾中表達(dá)逐漸降低；會(huì)在肝中的16 h維持一定的高表達(dá)，直到48 h才和一起逐漸下降(圖8)。

2.6 半滑舌鰨相關(guān)基因在淋巴細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pHAGE- p35a和pHAGE-p40c后的表達(dá)模式

轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組和基因表達(dá)量較低，且在不同濃度的LPS刺激后，表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。轉(zhuǎn)染pHAGE-p35a和pHAGE-p40c載體的實(shí)驗(yàn)組，和基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組 (圖9)。

圖5 P35a (A)和P40c (B)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

氨基酸序列號(hào)：

P35a：綠河鲀(H3C7F9)；紅鰭東方鲀(H2SI85)；青鳉(XP_004075675.1)；三棘刺魚(yú)(G3P753); 劍尾魚(yú)(XP_023207637.1)；羅非魚(yú)(I3J6P0)

P35b：綠河鲀(Q6UAL9)；青鳉(XP_004079386.2)；三棘刺魚(yú)(G3PKZ2)；劍尾魚(yú)(XP_023190996.1)。

P35：鴨(U3IER1)；火雞(G1NDR2)；小鼠(P43431)；馬(Q9XSQ6)；人(P29459)；豬(Q29053)；牛(P54349)。

P40c：青鳉(H2L9T4)；羅非魚(yú)(I3KA75)；三棘刺魚(yú)(G3NJZ0)；庸鰈(D0QTF8)。

P40b：斑馬魚(yú)(A8WH95)；鯉魚(yú)(Q2PCT1)；三棘刺魚(yú)(G3QAY2)；青鳉(H2LA74)；羅非魚(yú)(I3JPN9)。

P40a：斑馬魚(yú)(Q6F3Q9)；鯉魚(yú)(Q2PD23)；青鳉(H2LTF6)；羅非魚(yú)(I3KMB3)；海鱸魚(yú)(Q1KX13)；三棘刺魚(yú)(G3Q3E4)。

P40：雞(Q6X0K9)；鼠(P43432)；人(P29460)；牛(P46282)

Amino acid sequence number:

P35a:(H3C7F9);(H2SI85);(XP_004075675.1);(G3P753);(XP_023207637.1);(I3J6P0).

P35b:(Q6UAL9);(XP_004079386.2);(G3PKZ2);(XP_023190996.1).

P35:(U3IER1);(G1NDR2);(P43431);(Q9XSQ6);(P29459);(Q29053);(P54349).

P40c:(H2L9T4);(I3KA75);(G3NJZ0);(D0QTF8).

P40b:(A8WH95);(Q2PCT1);(G3QAY2);(H2LA74);(I3JPN9).

P40a:(Q6F3Q9);(Q2PD23);(H2LTF6);(I3KMB3);(Q1KX13);(G3Q3E4).

P40:(Q6X0K9);(P43432);(P29460);(P46282)

表2 半滑舌鰨P35a和P40c蛋白序列與其他物種蛋白序列的相似性

Tab.2 Similarity of P35a and P40C protein sequences between C. semilaevis and other species

對(duì)照組表達(dá)量在不同濃度的LPS刺激下，隨著LPS濃度的增加，表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染的過(guò)表達(dá)載體后，的表達(dá)量上升幅度顯著高于對(duì)照組。、和基因的表達(dá)量在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中均沒(méi)有顯著變化(圖10)。

3 討論

本研究獲得了半滑舌鰨亞基和亞基基因的編碼序列，進(jìn)化樹(shù)分析表明它們分別屬于魚(yú)類和亞型。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，和基因都含有典型的IL-12家族結(jié)構(gòu)域，且都不含跨膜結(jié)構(gòu)域還含有亞基都具有的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(IG)和Ⅰ類細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)域(d1f42a3)。前期研究報(bào)道，與具有相似結(jié)構(gòu)域的造血細(xì)胞因子受體家族成員IL-6受體()，可以通過(guò)蛋白質(zhì)水解或選擇性剪接的方式以可溶性形式(缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域)從細(xì)胞中釋放，然后可溶性IL-6R和IL-6在溶液中結(jié)合成復(fù)合物，介導(dǎo)下游信號(hào)通路的調(diào)控(Collison, 2012; Vignali, 2012)。因此，可以把IL-12理解成細(xì)胞因子與可溶性細(xì)胞因子受體共價(jià)結(jié)合形成的復(fù)合物。組織表達(dá)結(jié)果顯示，主要在鰓、腦、心和卵巢中具有較高表達(dá)，主要在肝、鰓、心臟和精巢中有較高表達(dá)。均在鰓中高表達(dá)，可能是因?yàn)轹w是病原體首先侵入魚(yú)體的器官。

本研究分析了半滑舌鰨和在哈維氏弧菌感染后的時(shí)空表達(dá)特征。免疫器官中的和及相關(guān)基因(和)存在時(shí)空表達(dá)差異性。在脾和肝中，和不在同一時(shí)間高表達(dá)，但亞基也不會(huì)以單體形式存在于細(xì)胞中(D'Andrea, 1992)。目前，已在草魚(yú)()、大西洋鮭()等硬骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了亞基和亞基的多個(gè)亞型(Pandit, 2015; Wang, 2014b)，表明半滑舌鰨中可能還具有亞基的其他亞型。亞基的同源二聚體可以通過(guò)結(jié)合IL-12受體來(lái)抑制IL-12的產(chǎn)生(Heinzel, 1997)，但結(jié)合在脾和肝中的表達(dá)模式，亞基更可能是與亞基的其他亞型形成IL-12在免疫器官中發(fā)揮調(diào)控作用。因此，推測(cè)在半滑舌鰨中存在多個(gè)亞基和亞基的亞型。在腸中，和的表達(dá)趨勢(shì)一致，表明半滑舌鰨IL-12的/亞型在應(yīng)對(duì)哈維氏弧菌感染時(shí)可能在腸中發(fā)揮相應(yīng)作用。而在腎中，由于表達(dá)量變化不明顯以及其組織表達(dá)量低，還需要進(jìn)一步探究和在腎臟中是否響應(yīng)哈維氏弧菌感染。上述結(jié)果表明，IL-12的不同亞型可能在不同的免疫器官中發(fā)揮不同的免疫功能。

圖6 p35a(A)和p40c(B)基因在半滑舌鰨中的組織表達(dá)模式

數(shù)據(jù)用3個(gè)獨(dú)立個(gè)體的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(=3)。不同字母間表示差異顯著(<0.05)

Data were the Mean±SE of three independent individuals (=3). Different letters represent significant difference (<0.05)

圖7 p35a和p40c mRNA在哈維氏弧菌感染后的半滑舌鰨免疫組織中的表達(dá)模式

字母的大小寫(xiě)標(biāo)注僅用來(lái)區(qū)分不同基因間的顯著性，不同字母間表示差異顯著(<0.05)。下同

The case labeling of letters is only used to distinguish the significance between different genes, and the difference with different letters was significant (<0.05). The same as below

圖8 ifn-γ和il-10在哈維氏弧菌感染后的半滑舌鰨免疫組織中的表達(dá)模式

圖9 細(xì)胞過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中p35a和p40c基因的表達(dá)模式

對(duì)照組(C)：轉(zhuǎn)染空載體；實(shí)驗(yàn)組(P)：和共轉(zhuǎn)，均用0、1、10 ng/L的LPS進(jìn)行刺激。組別命名為C0、C1、C10、P0、P1和P10。下同

Control group (C): Transfected with empty vector; Experimental group (P): Co-transfected withand. Stimulated with 0, 1, 10 ng/L LPS. The groups were named as C0, C1, C10, P0, P1, and P10. The same as below

在哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)中，還檢測(cè)了和在半滑舌鰨不同免疫組織中的表達(dá)模式。在脾中，呈現(xiàn)出典型的IL-12調(diào)控模式(Wang, 2014a)，在6 h升高后，與其他亞型的亞基產(chǎn)生IL-12，從而誘導(dǎo)在16 h顯著升高；在48 h急劇升高，抑制IL-12的產(chǎn)生，從而使和在48 h之后的表達(dá)逐漸降低。在腸中，在IL-12表達(dá)升高前高表達(dá)，之后下降，并沒(méi)有因表達(dá)量升高而維持在一個(gè)較高水平，這暗示在腸中可能主要發(fā)揮激活I(lǐng)L-12細(xì)胞因子產(chǎn)生的功能(Zhang, 2008)。而作為T(mén)h2免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞因子，其表達(dá)均在IL-12高表達(dá)后被抑制，表達(dá)模式和發(fā)揮的功能較為單一，這可能是由于Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞的分化途徑相對(duì)較為保守(Collison, 2012)。作為與IL-12相關(guān)的細(xì)胞因子，發(fā)揮功能呈現(xiàn)出時(shí)空多樣性，側(cè)面佐證了IL-12可能在不同器官中對(duì)相關(guān)的免疫應(yīng)答具有差異調(diào)控作用，這表明IL-12的調(diào)控方式可能較為復(fù)雜。到目前為止，IL-12受體在魚(yú)類中還未確定，哺乳動(dòng)物的IL-12受體由亞基1和亞基2構(gòu)成。由于魚(yú)類基因組復(fù)制事件，免疫基因(細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體)通常以2個(gè)拷貝的形式存在(Husain, 2012)。IL-12配體和受體亞單位的多樣性組合，進(jìn)一步證明魚(yú)類IL-12調(diào)控系統(tǒng)的復(fù)雜性。因此，IL-12細(xì)胞因子在魚(yú)類中通過(guò)多種同源基因的擴(kuò)增，共享配體和受體中的亞基，可能組成了一個(gè)極其復(fù)雜的內(nèi)部調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來(lái)微調(diào)它們的免疫反應(yīng)。

在LPS刺激半滑舌鰨淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，的表達(dá)量響應(yīng)了LPS刺激，和表達(dá)量變化對(duì)LPS刺激的響應(yīng)不顯著?？赡芤?yàn)?亞型不是體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中主要響應(yīng)LPS的免疫蛋白。在之前的研究中，虹鱒不同亞型的IL-12分別針對(duì)不同的刺激源(病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng))展現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。其中，/c亞型針對(duì)病毒和寄生蟲(chóng)感染，表達(dá)明顯上調(diào)，而針對(duì)細(xì)菌感染，表達(dá)上調(diào)不顯著(Wang, 2014b)。在過(guò)表達(dá)和后，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量響應(yīng)LPS刺激的上升幅度明顯高于對(duì)照組，表明IL-12的/亞型能夠通過(guò)誘導(dǎo)基因的表達(dá)，參與半滑舌鰨淋巴細(xì)胞響應(yīng)LPS刺激，提升機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。

圖10 LPS刺激半滑舌鰨過(guò)表達(dá)p35a和p40c淋巴細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)模式

綜上所述，IL-12是半滑舌鰨響應(yīng)哈維氏弧菌病，參與免疫調(diào)控并提升免疫應(yīng)答水平的重要細(xì)胞因子。因此，可以使用重組的IL-12作為半滑舌鰨的哈維氏弧菌疫苗的佐劑之一，但由于半滑舌鰨IL-12參與的免疫應(yīng)答非常復(fù)雜，需進(jìn)一步研究半滑舌鰨IL-12的所有組成亞基，探究不同組成的IL-12的結(jié)構(gòu)特征和免疫調(diào)控模式，從而提高半滑舌鰨的IL-12作為疫苗佐劑所增強(qiáng)的免疫效果。

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Expression and Regulation Analysis of theandSubunits of Interleukin 12 inInfected by

ZHANG Zhihua1,2, FENG Bo1,2, ZHU Tengfei2, HAO Xiancai2, WANG Qian2, SHAO Changwei2, WANG Hongyan2①

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao, Shandong 266071, China)

Interleukin 12 (IL-12), a key molecular switch in the immune response, is a pleiotropic cytokine composed of theandsubunits. It has been proven that IL-12 can be used as a vaccine adjuvant to enhance the immune response level of fish, and is used in the development of vaccines against pathogen infection. In this study, we cloned the coding regions of thesubunit andsubunit of IL-12 in Chinese tongue sole (), with a length of 651 bp and 984 bp, respectively. The phylogenetic analysis showed that theandofwere clustered with the corresponding genes in other fishes. The sequence of amino acid homology analysis showed thatandofhad the highest similarity with52.04%)48.67%tissue expression analysis showed thatwas highly expressed in the gill, brain, heart, and ovary, andwas highly expressed in the liver, spleen, gill, and heart. We further analyzed the expression patterns of,, and their related genes (-and-) after infection with Vibrio harveyi. The expression ofincreased significantly at 48 h (<0.05), and then gradually decreased in the spleen, and its expression increased significantly at 72 h in the liver and intestine. The expression ofincreased significantly at 6 h in spleen and liver, and at 48 h in kidney. Its expression also began to increase at 6 h and peaked at 48 h in the intestine. The expression ofincreased significantly before the upregulated expression ofin the liver and intestine, and later thanin the spleen. The expression ofwas opposite to that ofin the liver, spleen, kidney, and intestine. The expression of the immune related cytokines (-,-,-,and-) in the lymphocytes ofwas detected after the overexpression of theandgenes. The results showed thatandcould significantly increase the expression of-under lipopolysaccharide stimulation. The results indicate that theandsubunits of IL-12 respond to stimulation by V.harveyi in, and then participate in the immune response by inducing the expression of the-gene, which provides a theoretical basis for the development of IL-12 as an adjuvant for thevaccine against V. harveyi.

; Immune response; Interleukin 12;

S941.42+4

A

2095-9869(2022)03-0012-12

10.19663/j.issn2095-9869.20210303001

http://www.yykxjz.cn/

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WANG Hongyan, E-mail: wanghongyan@ysfri.ac.cn

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0900301)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2020TD19)和財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系共同資助[This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0900301), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD19), and China Agriculture Research System of MOF and MARA]. 張志華，E-mail: zhangzh0115@163.com

王洪巖，E-mail: wanghongyan@ysfri.ac.cn

2021-03-03,

2021-03-22

(編輯 馮小花)