中華蛸vasa基因的克隆及表達(dá)分析*

劉宇巖 李鳳輝 邊 力 朱文靜 陳四清 曲江波 常 青 劉長琳 葛建龍

中華蛸基因的克隆及表達(dá)分析*

劉宇巖1,2李鳳輝2邊 力2朱文靜2陳四清2①曲江波3常 青2劉長琳2葛建龍2

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071； 3. 煙臺(tái)開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司 山東 煙臺(tái) 264006)

基因編碼的蛋白是DEAD-box (Asp-Glu-Ala-Asp)蛋白家族成員，對(duì)真核生物生殖細(xì)胞的形成具有關(guān)鍵作用。本研究使用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆了中華蛸()基因全長，共2438 bp，其中，開放閱讀框長2067 bp，編碼688個(gè)氨基酸，5′-UTR長128 bp，3′-UTR長244 bp (包含A尾巴)?；贓xPASy、Signal 4.1、TMHMM、SMART等在線軟件對(duì)基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，得出其氨基酸分子量為76580.53 Da，理論等電點(diǎn)為5.89。無信號(hào)肽，跨膜區(qū)域沒有明顯的信號(hào)，因此，推測其為胞內(nèi)蛋白，不屬于膜蛋白。該蛋白具有DEXDc和HELICc 2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，而且有9個(gè)DEAD-box家族蛋白的典型保守區(qū)域，表明所得cDNA屬于基因家族。使用qRT-PCR對(duì)中華蛸各時(shí)期胚胎、初孵幼體及2個(gè)發(fā)育時(shí)期的卵巢及雌雄不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，基因在性腺中特異性表達(dá)，且在卵巢中的表達(dá)大于精巢，未成熟和成熟卵巢中均有mRNA表達(dá)，且未成熟期表達(dá)量較高。因此，推測基因可能在卵巢發(fā)育過程和功能維持等方面起到重要作用。在中華蛸早期胚胎發(fā)育階段，均能檢測到基因轉(zhuǎn)錄本，前10 d微弱表達(dá)，從第13天開始，表達(dá)量逐漸上升，至第19天達(dá)到最高。在初孵幼體階段，分別在第8天和第20天出現(xiàn)最低和最高表達(dá)量。本研究結(jié)果可為中華蛸原始生殖細(xì)胞起源、遷移和分化提供理論資料，有助于加深對(duì)中華蛸卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生過程的理解。

中華蛸；；基因克?。槐磉_(dá)分析

基因編碼的蛋白是DEAD-box (Asp-Glu- Ala-Asp)蛋白家族成員，該蛋白參與多種細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，RNA剪切、修飾和代謝，核內(nèi)mRNA的運(yùn)輸及降解等(Dehghani, 2015)。Schüpbach等(1986)首次在黑腹果蠅()中發(fā)現(xiàn)的存在，證明其屬母源基因，是生殖質(zhì)的前體，在生殖細(xì)胞分化中發(fā)揮作用(Hay, 1988)。原始生殖細(xì)胞(PGCs)是由細(xì)胞分化而來，發(fā)育早期從體細(xì)胞中掉落，隨后經(jīng)過一系列復(fù)雜的趨化因子作用發(fā)生轉(zhuǎn)移，至生殖脊時(shí)精卵結(jié)合促使原始性腺形成。隨后通過一系列的分裂增殖與分化過程，在性成熟階段由卵巢和精巢分泌成熟的配子(胡翔, 2015)。近年來，一些分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)幫助了PGCs的鑒定，硬骨魚PGCs的第1個(gè)分子標(biāo)記是基因(Olsen,1997)?；蚓哂懈叨缺Ｊ匦?，繼在果蠅體內(nèi)被克隆后，在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物相繼展開研究，如家蠶() (Cao, 2012)、雞() (Tsunekawa, 2000)和小鼠()(Reunov, 2015)等?；蜃鳛槟冈葱曰?，在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，因此，可能在生殖發(fā)育的調(diào)控過程中發(fā)揮作用。目前，已在多種魚類成功克隆序列并得到其同源基因，如斑馬魚()(Kr?vel, 2004)、青鳉() (Herpin, 2007)、文昌魚() (Wu, 2011)和七彩神仙魚() (林睿涓等, 2017)等，并深入研究了在早期性腺分化及發(fā)育過程中發(fā)揮的作用。但未見有關(guān)中華蛸()基因的報(bào)道。

中華蛸屬于八腕目(Octopoda)、蛸科(Octopodidae)、蛸屬，在浙江、福建和廣東等近海區(qū)域廣泛分布。中華蛸喜穴居，肉質(zhì)鮮美，蛋白質(zhì)含量豐富且營養(yǎng)均衡(鄭小東等, 2011)，生鮮即食，加工后曬干也可，能食部分占比很高(92%以上)，頗受人們喜愛。中華蛸作為我國重要的經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)類，已開展了對(duì)其人工養(yǎng)殖及繁育的研究(蔡厚才等, 2009; 鄭小東等, 2011)，但目前對(duì)中華蛸繁育機(jī)制的研究仍處于探索階段。中華蛸卵母細(xì)胞發(fā)育不同步，屬分批產(chǎn)卵，給規(guī)模化苗種繁育增加了困難，工廠化養(yǎng)殖仍需努力。是生殖細(xì)胞的分子標(biāo)記物，開展基因克隆和表達(dá)研究，可為中華蛸人工繁育和養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。本研究以中華蛸為對(duì)象，運(yùn)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆中華蛸基因，并使用熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)對(duì)其早期發(fā)育階段及各器官組織的表達(dá)狀況進(jìn)行檢測，旨在完善中華蛸分子生物學(xué)和生殖調(diào)控方面的知識(shí)，為其生殖細(xì)胞的分化、早期性別鑒定及性別決定機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐，為實(shí)現(xiàn)工廠化繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品制備

實(shí)驗(yàn)用中華蛸親體在浙江南麂島海域捕獲，經(jīng)長途運(yùn)輸至山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)天源水產(chǎn)有限公司進(jìn)行人工培育，養(yǎng)殖水溫為23.2℃～25.6℃，鹽度為30～ 32，日換水量100%～200%。分別取活力旺盛、體質(zhì)量為1.0～1.5 kg的雌雄成體中華蛸各3尾，觀察其右側(cè)第3條腕確認(rèn)雌雄，經(jīng)MgCl2(濃度為20 g/L)麻醉后迅速解剖，分別取其卵巢、精巢、鰓、心臟、腎臟、肝胰腺、大腦、視腺和皮膚。所用受精卵、孵化出膜后幼體均由成體中華蛸自然產(chǎn)卵、人工培育而來。培育水溫為23.8℃～26.0℃，溶氧> 5.0 mg/L，受精卵孵化27 d得到初孵幼體。幼體孵出后，移入專用水泥池(6 m×2 m×1.5 m)。根據(jù)幼體密度和大小投喂合適密度的鹵蟲()，并連續(xù)充氣確保氧氣充足，前3 d使用靜水培育，第4天使用流水，換水量為50%～ 70%，并進(jìn)行吸底、排污。收集不同發(fā)育時(shí)間的受精卵(5、10、13、16、19、21、24和27 d)、孵化出膜后幼體(2、5、8、11、14、17、20、23和26 d)及未成熟、成熟期的卵巢若干，未成熟期體重為(182.31± 20.29) g，性腺指數(shù)(GSI)為(0.55±0.22)%，卵母細(xì)胞直徑在80～100 μm之間；成熟期體重為(1326±100) g，GSI為(5.19±0.81)%，卵母細(xì)胞直徑在400～500 μm之間。所有樣品均快速裝入含有RNA保存液的2.0 mL無酶管中，并在4℃冰箱放置12 h，保證保存液完全滲入組織。樣品帶回后貼上標(biāo)簽，轉(zhuǎn)入–80℃冰箱，防止RNA降解，用于后續(xù)基因克隆和表達(dá)分析。

1.2 主要試劑

SMARTTMRACE cDNA amplification試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent with gDNA eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、PremixTM(TaKaRaTMV 2.0)大腸桿菌() DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞和pMDTM18T vector cloning試劑盒均購自TaKaRa公司，SteadyPure DNA凝膠回收試劑盒購自艾克瑞生物，動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(DP431)購自天根生化科技有限公司，ChamQTMSYBR Color qPCR master mix試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

本實(shí)驗(yàn)總RNA的提取使用動(dòng)物RNA提取試劑盒(DP431)，并參照其說明書提取中華蛸胚胎、孵化出膜后幼體各個(gè)時(shí)期和成體不同組織的總RNA。根據(jù)目的片段的長短采用不同濃度(1%～2%)的瓊脂糖制成凝膠，點(diǎn)樣后檢測RNA的質(zhì)量(條帶是否清晰)，使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, 美國)微量分光光度計(jì)檢測RNA的純度及濃度(用量1 μL)。5′RACE、3′RACE模板鏈的制備按照SMARTTMRACE cDNA amplification kit說明進(jìn)行。

1.4 vasa基因核心序列克隆

從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的中華蛸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的注釋信息，篩選比對(duì)得到基因的部分cDNA序列。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物擴(kuò)增核心序列(表1)，以中華蛸成熟卵巢組織cDNA為模板分別進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系：10 μL PremixTM(LATMV2.0)，正向引物F (10 μmol/L) 0.8 μL，反向引物R (10 μmol/L) 0.8 μL，cDNA模板(1 μg/μL) 1 μL，ddH2O 6.4 μL補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃40 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物擴(kuò)增完成后，在電泳板中檢測擴(kuò)增條帶，切膠儀(DUT-48超薄型)下觀察合適的條帶，并用SteadyPure DNA回收DNA。純化后的DNA連接到pMD18-T vector中，連接體系：pMD18-T vector 1 μL, Solution Ⅰ 5 μL及DNA純化產(chǎn)物4 μL)，并置于PCR反應(yīng)儀中反應(yīng)3 h (16℃)。之后轉(zhuǎn)入冰上融化的DH5α感受態(tài)細(xì)胞過夜培養(yǎng)，篩選陽性單克隆并進(jìn)行菌落PCR鑒定，將含有目的基因的菌液測序(華大基因)。

1.5 vasa基因全長克隆

測序后，經(jīng)拼接比對(duì)確認(rèn)為核心序列，設(shè)計(jì)RACE特異性引物5′GSP-1、5′GSP-2、3′GSP-1和3′GSP-2，使用巢式PCR進(jìn)行3′和5′ RACE擴(kuò)增，5′端擴(kuò)增：5′RACE cDNA為模板，先用5′GSP-1與RACE通用引物UPM-long組合完成第1次反應(yīng)；接著用第1次反應(yīng)獲取的目的液稀釋后為模板，5′GSP-2與RACE通用引物UPM-short或NUP組合完成第2次反應(yīng)。3′端擴(kuò)增：3′RACE cDNA為模板，3′GSP-1與RACE通用引物UPM-long組合完成第1次反應(yīng)；用第1次反應(yīng)獲取的目的液稀釋后為模板，3′GSP-2與RACE通用引物UPM-short或NUP組合進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL PremixTM(LATMV 2.0)，3′或5′特異性引物(10 μmol/L) 0.8 μL，UPM (或NUP) 0.8 μL，RACE-cDNA模板(1 μg/μL) 1 μL，ddH2O 6.4 μL補(bǔ)齊。反應(yīng)程序流程：94℃ 5 min；94℃ 30 s，3′和5′特異性引物退火溫度30 s，72℃ 1 min，反應(yīng)30次；72℃ 10 min。獲取的產(chǎn)物檢測后進(jìn)行回收、純化，之后連接轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，挑陽性菌株測序(華大基因公司)。

1.6 vasa基因序列分析

測序完成的片段使用Contig Express 9.1軟件進(jìn)行拼接、驗(yàn)證，并用BLAST工具(https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)得到的cDNA是DEAD-box家族的基因。使用OFR Finder (http://www.ncbi.nlm.Nih.gov/projects/gorf/Orfig. cgi)在線軟件推導(dǎo)基因的開放閱讀框，利用ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/)網(wǎng)站分析分子量、理論等電點(diǎn)，利用Signal4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號(hào)肽，使用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)進(jìn)行跨膜區(qū)分析，利用SMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)和NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。將與其他已知物種的氨基酸序列使用NCBI進(jìn)行同源蛋白比對(duì)，并使用DNAMAN對(duì)同源蛋白多重比較，利用MEGA 5.2軟件使用鄰近法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Koichiro, 2011)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取不同發(fā)育時(shí)間的胚胎、孵化出膜后幼體、2個(gè)時(shí)期的卵巢和不同組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將每個(gè)樣品濃度加無菌無酶水補(bǔ)齊至50 ng/μL，根據(jù)基因的核心序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)2對(duì)熒光定量特異性引物-RT-F/R，以β-actin為內(nèi)參基因，使用StepOneTMReal-time PCR system (IBM, 美國)，配制20 μL反應(yīng)體系：ChamQTMSYBR color qPCR master mix (2×) 10 μL，ROX reference dyeⅠ(50×) 0.4 μL，-RT-F (10 μmol/L) 0.4 μL，-RT-R (10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA模板(50 ng/μL) 2 μL，ddH2O 6.8 μL補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：95℃ 30 s (預(yù)變性)；(95℃ 10 s；60℃ 30 s，然后95℃15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s) 40個(gè)循環(huán)。所有檢測樣本設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后查看熔解曲線是否正常。根據(jù)所測數(shù)據(jù)，采用2–??Ct法算出基因相對(duì)表達(dá)豐度，求其平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)，使用SPSS 17.0軟件對(duì)表達(dá)量進(jìn)行方差檢驗(yàn)，<0.05被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Os-vasa基因序列分析

中華蛸基因全長為2438 bp，命名為其ORF長度為2067 bp，預(yù)測蛋白有688個(gè)氨基酸，5′-UTR長128 bp，3′-UTR長244 bp (包含A尾巴)，理論等電點(diǎn)為5.89，氨基酸分子質(zhì)量76 580.53 Da，無信號(hào)肽，跨膜區(qū)域沒有明顯的信號(hào)，推測其為胞內(nèi)蛋白，不屬于膜蛋白。具有基因的DEXDc和HELICc 2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，且包含DEAD-box家族蛋白的典型特點(diǎn)：9個(gè)保守區(qū)域，分別為AQTGSGKT(I)、PVLTLLLQ (Q)、PTRELA (Ⅰa)、TPGRI (Ⅰb)、DEAD (Ⅱ)、SAT (Ⅲ)、RGLD (Ⅴ)、LVFVE (Ⅳ)和HRIGRTGR(Ⅵ)。另外，預(yù)測的氨基酸序列N端有多個(gè)RG重復(fù)序列，C末端存在基因常見的保守結(jié)構(gòu)色氨酸(W)殘基和酸性氨基酸殘基(EEEE)，序列中存在多個(gè)GG重復(fù)序列(圖1)。

表1 本研究所用引物名稱和序列

Tab.1 Names and sequences of primers used in this study

2.2 氨基酸序列多物種比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過在線軟件NCBI blastx和DNAMAN軟件，將中華蛸氨基酸序列與其他物種的基因編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與加州雙斑蛸()同源性最高(98%)，其次是虎斑烏賊()(68.74%)、太平洋牡蠣()(67.36%)、蝦夷扇貝()(66.12%)、青螺()(65.15%)海兔()(63%)和紫貽貝()(62%)，與人類()、小鼠()同源性較低，分別為54%和53%。另外，DEXDc和HELICc 2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列保守性較高(圖2)。

為了分析基因在不同物種中的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 5.2軟件對(duì)中華蛸及其他13個(gè)物種的DEAD-box蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果顯示，無脊椎動(dòng)物和軟體動(dòng)物，脊椎動(dòng)物各聚一支，其中，中華蛸先與加州雙斑蛸、虎斑烏賊聚為一支，這表明它們的親緣關(guān)系較近，基因在頭足類中可能較為保守，獨(dú)立形成分支后再與軟體動(dòng)物的腹足綱(Gastropoda)和瓣鰓綱(Lamellibranchia)聚為一支。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中呈現(xiàn)的結(jié)果與中華蛸在生物學(xué)分類中的地位基本一致。

2.3 vasa在不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的表達(dá)分析

在胚胎時(shí)期的qRT-PCR檢測結(jié)果如圖4所示，基因在發(fā)育前10 d微弱表達(dá)，從第13天開始，表達(dá)量逐漸上升，至第19天達(dá)到最高，之后表達(dá)量又開始下降，一直到孵化出膜。在仔蛸階段，從出膜到17日齡，基因表達(dá)量都維持在較低水平，8日齡幾乎檢測不到表達(dá)信號(hào)，從20～23日齡期間的表達(dá)量較高，且在20日齡表達(dá)量最高，后期階段(26和29日齡)又維持在較低水平(圖5)。

中華蛸雌性個(gè)體和雄性個(gè)體各組織的qRT-PCR檢測結(jié)果如圖6所示，基因無論在雌性還是雄性個(gè)體性腺組織的表達(dá)量均較高，在其他組織中表達(dá)量均很低，并且在卵巢中的表達(dá)量高于精巢。

取未成熟的卵巢和成熟期的卵巢進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示(圖7)，未成熟卵巢表達(dá)量顯著高于成熟卵巢(<0.05)，未成熟期的表達(dá)量是成熟期的15.6倍左右。

3 討論

本研究從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的中華蛸性腺轉(zhuǎn)錄組注釋中篩選得到基因的部分片段，并通過NCBI進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，使用RACE技術(shù)首次克隆了基因cDNA序列，并以命名其全長為2438 bp，共編碼688個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.89，氨基酸分子質(zhì)量為76 580.53 Da。蛋白屬于DEAD-box蛋白家族，Ia-Ib和Ⅱ～Ⅵ這9個(gè)保守區(qū)域是DEAD-box家族蛋白共有的特點(diǎn)(Tanner, 2001)，在大部分DEAD-box蛋白家族成員中保守性表達(dá)。本研究得到的基因同樣發(fā)現(xiàn)了這9個(gè)保守基序的存在，每個(gè)保守基序都行使著特殊的生理功能，其中，Q motif框在ATP的結(jié)合與水解過程中發(fā)揮重要作用，谷氨酰胺殘基加上N可以參與氫鍵的形成，與功能性區(qū)域Ⅰ也有關(guān)聯(lián)，例如，相互配合促使ATP、RNA兩兩結(jié)合(Rocak, 2004)。motifⅠ～Ⅲ又可以相互作用形成一個(gè)ATP水解的作用口袋(Caruthers, 2002)。motifⅠa和motifⅠb則主要參與RNA的結(jié)合過程，motif Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ參與ATP酶和解旋酶的活性調(diào)節(jié)(Cordin, 2006)。經(jīng)編碼氨基酸的多序列比對(duì)，在保守基序區(qū)域，物種間呈現(xiàn)高度保守性，僅有少數(shù)氨基酸殘基存在差異，表明基因在進(jìn)化過程中較為保守。另外，在基因中發(fā)現(xiàn)了一些基因的普遍性特征，例如，存在多個(gè)GG重復(fù)序列，氨基酸C末端存在酸性氨基酸殘基，終止密碼子前端有1個(gè)色氨酸殘基。GG基序參與蛋白因子elF4A的相互作用(Rogers,2002)，C末端的酸性氨基酸殘基常與RNA結(jié)合過程有關(guān)(Fabioux, 2004)。RGG重復(fù)區(qū)也具有相似性，在昆蟲和脊索動(dòng)物中普遍存在且大多數(shù)位于vasa蛋白的N端，但并不普遍存在于所有vasa蛋白，例如，在馬氏珠母貝() (劉雅等, 2017)、刺參() (隋娟等, 2008)的vasa蛋白的N端未發(fā)現(xiàn)RGG重復(fù)區(qū)的存在，本研究結(jié)果也是如此，說明這些序列并不是不可或缺的，其行使的功能具有可替代性。功能結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示，基因具有DEADc和HELICc 2個(gè)結(jié)構(gòu)域，這些都是vasa蛋白家族特有的，表明所得cDNA屬于基因家族且高度保守。

圖1 Os-vasa基因cDNA序列全長和編碼的氨基酸序列

起始密碼子ATG和終止密碼子TAA均用灰色陰影標(biāo)出；PolyA用雙下劃線標(biāo)出；GG重復(fù)序列、酸性氨基酸和色氨酸用方框標(biāo)出；DExDc和HELICc 2個(gè)功能域用下劃線標(biāo)出；陰影加方框部分是Os-vasa保守基序

Start codon (ATG) and stop codon (TAA) are marked with gray shadow, and PolyA is marked with double underline; Nucleotide with a frame represents GG repeat sequence, acidic amino acid and tryptophan; Open reading fragment; DExDc and HELICc functional domains are underlined; Sequences in gray background and frame represents the Os-vasa conserved motifs

圖2 中華蛸Os-vasa編碼氨基酸序列與其他物種同源序列比對(duì)

陰影部分表示氨基酸同源，左邊為物種名稱，右邊為比對(duì)到的氨基酸位置。各物種蛋白NCBI登錄號(hào)：加州雙斑蛸(KOF70288.1)、虎斑烏賊(CAE1321294.1)、太平洋牡蠣(XP_034310873.1)、蝦夷扇貝(XP_021370694.1)、青螺(XP_009057808.1)、海兔(XP_005113588.2)、紫貽貝(BAJ15435.1)

The shaded area indicates amino acid homology species. Species NCBI Login No:(KOF70288.1),(CAE1321294.1),(XP_034310873.1),(XP_021370694.1),(XP_009057808.1),(XP_005113588.2),(BAJ15435.1)

圖3 不同物種vasa蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

所用到的物種基因序列登錄號(hào)：蝦夷扇貝(XP_021370694.1)、歐洲大扇貝(XP_033738811.1)、紫貽貝(BAJ15435.1)、太平洋牡蠣(XP_034310873.1)、馬氏珠母貝(BAM75192.1)、青螺(XP_009057808.1)、海兔(XP_005113588.2)、虎斑烏賊(CAE1321294.1)、加州雙斑蛸(KOF70288.1)、人類(CAB70750.1)、小鼠(NP_034159.1)、環(huán)紋圓天竺鯛(XP_030008903.1)、深裂眶鋸雀鯛(XP_008278033.1)

The Accession number ofgene sequence were used:(XP_021370694.1),(XP_033738811.1),(BAJ15435.1),(XP_034310873.1),(BAM75192.1),(XP_009057808.1),(XP_005113588.2),(CAE1321294.1),(KOF70288.1),(CAB70750.1),(NP_034159.1),(XP_030008903.1),(XP_008278033.1)

圖4 Os-vasa mRNA在胚胎發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

柱上不同字母代表具有顯著差異(＜0.05)，下同

Bar with different letters indicate significant differences (0.05), the same as below

圖5 Os-vasa mRNA在不同發(fā)育時(shí)期仔蛸中的相對(duì)表達(dá)量

中華蛸氨基酸序列與其他物種基因編碼的氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示，與加州雙斑蛸相似度較高，達(dá)98%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，中華蛸蛋白先與加州雙斑蛸、虎斑烏賊聚為一支，預(yù)示中華蛸基因在生物體中發(fā)揮的功能與頭足類中其他物種高度相似，然后再與軟體動(dòng)物中腹足綱和瓣鰓綱聚為一支，與脊椎動(dòng)物則親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的分子學(xué)進(jìn)化地位與中華蛸的生物學(xué)分類地位是相符的。

圖6 Os-vasa mRNA在雌雄中華蛸不同組織中的表達(dá)

Br：大腦；He：心臟；Og：視腺；Ki：腎；Li：肝胰腺；Gi：鰓；Ca：胴??；Sk：皮膚；Go：性腺

Br: Brain; He: Heart; Og: Optic gland; Ki: Kidney; Li: Liver; Gi: Gill; Ca: Carcass; Sk: Skin; Go: Gonad

圖7 Os-vasa mRNA在卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)

IO：未成熟卵巢；MO：成熟卵巢

IO: Immature ovary; MO: Mature ovary

基因組織qRT-PCR結(jié)果顯示，其在中華蛸卵巢和精巢中高表達(dá)，而在中華蛸其他組織中表達(dá)量較低，甚至檢測不到表達(dá)信號(hào)，差異極顯著(<0.01)。這一結(jié)果和多數(shù)報(bào)道的物種mRNA表達(dá)模式一致，如櫛孔扇貝()(邵明瑜等, 2007)、馬氏珠母貝、太平洋藍(lán)鰭金槍魚() (Nagasawa,2009)。研究表明，通過RNAi技術(shù)使用dsRNA處理太平洋牡蠣性腺會(huì)導(dǎo)致mRNA沉默，性腺mRNA表達(dá)水平明顯降低，vasa蛋白表達(dá)量也隨之降低或者不表達(dá)，且大部分太平洋牡蠣不育(Fabioux, 2009)。基因在生殖細(xì)胞的特異性表達(dá)模式表明其參與調(diào)控生殖細(xì)胞發(fā)育過程并發(fā)揮重要作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，除在性腺組織中表達(dá)外，在其他組織也有表達(dá)，例如，在半滑舌鰨()(Hay, 1988)的心臟組織，在虹鱒()(Wu, 2014)的腦和心臟組織，在小鼠(Zamboni, 1983)的腎和腎上腺組織都檢測到基因的表達(dá)。基因不僅參與生殖細(xì)胞發(fā)育，還可能通過調(diào)節(jié)有關(guān)mRNAs的轉(zhuǎn)錄參與體細(xì)胞的分化(Ikenishi, 2000)。基因具體行使的功能隨著生物體的進(jìn)化演變而存在差異，仍需要大量的研究工作來闡明。

?zhan-Kizil等(2009)研究表明，mRNA在夏威夷明鉤蝦()的1～16-細(xì)胞期均能檢測到，且32-細(xì)胞期前均定位在生殖細(xì)胞中；中國對(duì)蝦()最早從2-細(xì)胞期開始能檢測到mRNA的表達(dá)，且在后期表達(dá)沒有消失，但有減弱趨勢，出膜后表達(dá)信號(hào)消失(周倩如, 2007)。在模式生物斑馬魚中，mRNA表達(dá)信號(hào)貫穿整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期，在胚胎發(fā)育早期存在于各個(gè)細(xì)胞中，并隨著胚胎的發(fā)育逐漸在生殖質(zhì)區(qū)域聚集，mRNA是斑馬魚生殖質(zhì)的重要組成成分(周倩如等, 2007)。本研究中，mRNA在發(fā)育10 d前微弱表達(dá)，從第13天開始表達(dá)量逐漸上升，至19 d達(dá)到最高，之后表達(dá)量又開始下降。在斑馬魚、櫛孔扇貝中，mRNA具有母源性特征遺傳，在生殖過程中，隨著配子的發(fā)生傳遞給下一代，分配到原始生殖質(zhì)中，即早期mRNA是由母系基因組傳遞給胚胎的(徐紅艷等, 2010)。中華蛸可能在第13天細(xì)胞發(fā)生了分化，體細(xì)胞分化為原始生殖細(xì)胞(PGCs)，原始生殖細(xì)胞逐漸積累并在第19天達(dá)到頂峰。隨后從21 d到出膜階段，各個(gè)組織器官逐漸發(fā)育形成，是體細(xì)胞分裂生殖的時(shí)期，體細(xì)胞數(shù)量大增，而生殖細(xì)胞的數(shù)量所占的比例減少，因此，mRNA表達(dá)逐漸降低。這一表達(dá)結(jié)果和七彩神仙魚相似(林睿涓等, 2017)，推測中華蛸的原始生殖細(xì)胞在13 d時(shí)形成?；蛟诓煌l(fā)育時(shí)期仔蛸中的表達(dá)結(jié)果顯示，從出膜到17日齡，基因表達(dá)量都維持在較低水平，8日齡幾乎檢測不到表達(dá)信號(hào)，這可能因?yàn)殡S著受精過程的發(fā)生，母源性的mRNA被激活以維持合子早期發(fā)育所需，隨著發(fā)育的進(jìn)行，母源性mRNA逐漸被消耗，仔蛸完成正常的生命活動(dòng)則需依賴于自身基因組合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(許莉佳等, 2012)；隨著發(fā)育的推進(jìn)，PGCs將穿過胚胎各組織(體細(xì)胞組織)在性原基聚集，并結(jié)合周圍的體細(xì)胞，形成完整的初始生殖腺，進(jìn)而分化為卵巢或精巢(朱新平等, 2017)。七彩神仙魚出膜后30日齡和40日齡的表達(dá)量較高，認(rèn)為PGCs在分子水平可能已經(jīng)開始分化(林睿涓等, 2017)。本研究結(jié)果與其相似，出膜后第20天和第23天mRNA表達(dá)量較高，之后又維持穩(wěn)定，推測第20天和第23天中華蛸的PGCs在分子水平可能已經(jīng)開始分化，但這時(shí)期的高表達(dá)與性腺分化是否有關(guān)，仍需進(jìn)一步在組織學(xué)水平進(jìn)行鑒定。

未成熟的卵巢和成熟期的卵巢RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，中華蛸未成熟和成熟卵巢均有mRNA表達(dá)，并且未成熟期表達(dá)量較高。斑馬魚卵母細(xì)胞原位雜交結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞的各階段，mRNA表達(dá)量存在差異，在Ⅱ期卵母細(xì)胞表達(dá)量最高，且定位到細(xì)胞質(zhì)中，在第Ⅲ期開始下降并在后期表達(dá)量趨于穩(wěn)定(項(xiàng)方, 2004)。對(duì)中華鱉()卵子發(fā)生的4個(gè)時(shí)期進(jìn)行熒光原位雜交，在初級(jí)卵母細(xì)胞和最早期生長期卵母細(xì)胞檢測出高表達(dá)信號(hào)，并認(rèn)為與細(xì)胞進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存有關(guān)，從生長期后表達(dá)信號(hào)逐漸減弱(朱新平等, 2017)。革胡子鯰()在性腺發(fā)育階段qRT-PCR相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，與成熟卵母細(xì)胞(Ⅲ期和Ⅳ期卵母細(xì)胞)相比，未成熟卵母細(xì)胞(Ⅰ期和Ⅱ期)的轉(zhuǎn)錄本較高(Raghuveer, 2010)。在羅非魚(spp)(Kobayashi, 2000)和銀鯽()(Xu, 2005)的研究中也有同樣發(fā)現(xiàn)。中華蛸mRNA在雌性生殖細(xì)胞的表達(dá)圖譜與它們較為類似，未成熟期表達(dá)量較高，可能與此時(shí)期卵母細(xì)胞中RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)大量積累有關(guān)；而在成熟期表達(dá)量減弱，這可能與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴(kuò)散使成熟卵細(xì)胞卵黃蛋白原的含量增加有關(guān)，而且隨著卵母細(xì)胞體積的增大，mRNA相對(duì)密度減少。mRNA在卵巢發(fā)育各時(shí)期的差異性表達(dá)表明，mRNA與卵子發(fā)生密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究克隆了中華蛸基因cDNA的全長序列，并以命名，對(duì)中華蛸胚胎發(fā)育、初孵幼體、卵巢的不同時(shí)期與中華蛸不同組織進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果顯示，中華蛸基因全長為2438 bp，其ORF長為2067 bp，編碼688個(gè)氨基酸。氨基酸同源性序列分析表明，中華蛸與加州雙斑蛸同源性最高。基因表達(dá)結(jié)果顯示，基因主要在性腺中表達(dá)，且在卵巢的表達(dá)量高于精巢；基因在中華蛸胚胎發(fā)育時(shí)期和出膜后29 d均有表達(dá)，胚胎期第19天表達(dá)量較高，出膜后第20天和第23天表達(dá)量較高；中華蛸未成熟和成熟卵巢均有mRNA表達(dá)，且未成熟期表達(dá)量較高。本研究結(jié)果可為中華蛸的性分化、生殖細(xì)胞分子標(biāo)記及發(fā)育研究提供參考。

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Cloning and Expression of theGene in the

LIU Yuyan1,2, LI Fenghui2, BIAN Li2, ZHU Wenjing2, CHEN Siqing2①, QU Jiangbo3, CHANG Qing2, LIU Changlin2, GE Jianlong2

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China; 3. Tianyuan Aquaculture Co., Ltd of Yantai Economic Development Zone, Yantai, Shandong 264006, China)

Thegene is a member of the DEAD-box family of proteins and plays a key role in the formation of germ cells ineukaryotes. In this study, we cloned the full length (2438 bp) ofcDNA ()rapid amplification of cDNA end (RACE) methods. With an open reading frame (ORF) of 2067 bp, encoding 688 amino acids, a 5′UTR of 128 bp, a 3′UTR of 244 bp, and included an A-tail. Based on ExPASy, Signal4.1, TMHMM, and SMART biological analysis, the ORF encoded a putative protein, with a predicted molecular weight of 76 580.53 Da, and the theoretical isoelectric point was 5.89. No signal peptide site was detected, and there was a significant signal in the transmembrane region; therefore, it was presumed to be an intracellular protein, and not a membrane protein. There were two domains, DEXDc and HELICc, and nine conserved motifs of the DEAD-box family, indicating that the cDNA cloned in this study belonged to the family of. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression patterns of thegene at different stages of the embryo and larva, in the ovaries at two growth stages, and in specific tissues for males and females. The results showed that thegene was especially expressed in the gonads, and the expression level in the ovary was significantly higher than that in the testis;mRNA was expressed in both immature and mature ovaries, and the transcript level of the immature stage was evidently higher than the mature stage, revealing that thegene might play an important role in the development process and the maintenance of ovarian functions.gene transcripts were detected at whole embryonic developmental stages, were weakly expressed first 10 days, and gradually increased from the 13th day to the highest level on the 19th day. In the larval stages,exhibited the lowest and highest expression on the 8th day post-hatching and the 20th day, respectively. The findings of this study can provide information for the study of primordial germ cell origin and migration and differentiation, and can contribute to the understanding of ovarian development and oogenesis of

;; Gene cloning; Expression analysis

S965

A

2095-9869(2022)03-0118-11

10.19663/j.issn2095-9869.20210407001

http://www.yykxjz.cn/

劉宇巖, 李鳳輝, 邊力, 朱文靜, 陳四清, 曲江波, 常青, 劉長琳, 葛建龍. 中華蛸基因的克隆及表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(3): 118–128

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CHEN Siqing, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

* 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金和中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2020GH02)共同資助 [This work was supported by China Agriculture Research System of MOF and MARA, and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020GH02)]. 劉宇巖，E-mail: 157107719@qq.com

陳四清，研究員，E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

2021-04-07,

2021-04-29

(編輯 馮小花)