肉桂游離酚提取物改善非酒精性肝細(xì)胞脂肪變性的活性研究

李會(huì)鵬　龐道?！幀帯⌒蠔|旭　鐘賽意　黎爾納　廖森泰　鄒宇曉

摘要：【目的】分析云野肉桂中不同存在形式酚類(lèi)物質(zhì)的含量，并探究其不同存在形式酚類(lèi)提取物對(duì)非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的影響，為熱帶亞熱帶植物肉桂資源的深加工及相關(guān)功能性食品的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坑酶Ａ址臃芭饸浠c—四氯對(duì)苯醌法分析肉桂中不同存在形式的酚類(lèi)物質(zhì)及黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量;體外以游離脂肪酸誘導(dǎo)劑（油酸鈉∶棕櫚酸=2∶1）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞為模型，分析不同濃度的肉桂游離酚/結(jié)合酚提取物對(duì)NAFLD細(xì)胞模型脂滴形成及甘油三酯（TG）含量的影響;體內(nèi)以高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的NAFLD小鼠為模型，探究體外篩選的強(qiáng)活性酚類(lèi)提取物對(duì)小鼠血脂及肝臟中TG和游離脂肪酸含量的影響?！窘Y(jié)果】肉桂多酚主要以游離酚（55.99±0.45 mg GAE/g）的形式存在，含有一定比例的結(jié)合酚（3.21±0.12 mg GAE/g），其中黃酮類(lèi)物質(zhì)（46.49±4.75 mg CE/g）是肉桂的主要酚類(lèi)物質(zhì)之一。云野肉桂游離酚提取物可有效降低NAFLD細(xì)胞模型胞內(nèi)TG的水平。與模型組相比，經(jīng)中和高劑量的肉桂游離酚提取物作用后，細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著降低（P<0.05，下同），分別降低17.07%和26.83%，而結(jié)合酚提取物作用后細(xì)胞內(nèi)TG水平與模型組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量的游離酚提取物干預(yù)后，不僅可以顯著降低小鼠血清中TG、膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，還能顯著降低小鼠肝臟中TG和游離脂肪酸含量，分別降低42.21%和22.22%。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析結(jié)果表明，肉桂游離酚提取物主要由原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1等物質(zhì)組成。【結(jié)論】肉桂游離酚提取物對(duì)NAFLD可能具有較好的改善作用，且原花青素類(lèi)物質(zhì)可能是發(fā)揮改善肝細(xì)胞脂肪變性作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 肉桂提取物;多酚;脂肪變性;NAFLD細(xì)胞模型;小鼠

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）03-0879-12

Effects of Cinnamon cassia free phenolic extract on nonalcoholic hepatocyte steatosis

LI Hui-peng PANG Dao-rui LIU Yao-yao XING Dong-xu

ZHONG Sai-yi LI Er-na LIAO Sen-tai ZOU Yu-xiao

（1College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong? 524088， China; 2Sericultural & Agri-Food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory

of Functional Food， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing/Maoming Branch， Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture， Guangzhou，

Guangdong? 510610， China）

Abstract：【Objective】The contents of different forms of phenols of Cinnamon cassia and the effects of different forms of phenolic extracts on non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD） were studied in order to provide a theoretical basis for the processing of cinnamon resources and the development of functional foods of cinnamon. 【Method】The contents of phenols and flavonoids in cinnamon were analyzed by the Folin phenol method and the sodium borohydride/chloranil based assay（SBC），respectively. HepG2 cells induced by sodium oleate and palmitic acid （2∶1） were used as an in vitro model to analyze the regulation effects of different concentrations of free or bound phenolic extracts of C. cassia on the formation of intracellular lipid droplets. The change of triglyceride（TG） content of different groups was also determined. Compared with the bound phenolic extract，the free polyphenol extract of cinnamon showed a better effect on steatosis. Furthermore，mice fed on a high sugar and high fat diet in combination with streptozotocin（STZ） was used as to model the in vivo effects of the phenolic extracts on serum and liver lipids. 【Result】The results suggested that polyphenols（55.99±0.45 mg GAE/g） existed in cinnamon extracts mainly in free form. Notably，some bound polyphenols（3.21±0.12 mg GAE/g） were also detected. The flavonoids（46.49±4.75 mg CE/g） were the main component of cinnamon polyphenols. The free phenolic extract of the Yunye cultivar of cinnamon can effectively reduce the TG level in vitro. The extracts of medium and high dose groups significantly decreased the TG level by 17.07% and 26.83% relative to that of the model group，respectively（P<0.05，the same below）. There was no significant difference in intracellular TG level between the model group and the bound phenol extract group（P>0.05）. The results of animal experiments showed that the contents of TG，total cholesterol（TC） and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） in the serum of mice decreased significantly after the intervention of high dose free phenol extract. High dose cinnamon free phenol extract also significantly reduced the contents of TG and FFA in the liver of mice，which decreased by 42.21% and 22.22%，respectively. The results of LC-MS/MS showed that procyanidins C1，B2，A2，B3 and B1 may be the main flavonoid compounds of the cinnamon free phenolic extract. 【Conclusion】These results reveal that cinnamon free phenolic extract may have a good effect on NAFLD，and procyanidins may be the main compounds effective against the steatosis of liver cells.

Key words： cinnamon extract; polyphenols; hepatocyte steatosis; cell model of NAFLD; mice

Foundation items： Guangdong Key Field Research and Development Plan Project （2020B020225005）; Innovative Research Team Construction Project for Modern Agricultural Industry Common Key Technologies of Guangdong （2020KJ117）; Emerging Discipline Team Construction Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202119TD）; Independent Research and Development Projects of Maoming Laboratory（2021ZZ004）

0 引言

【研究意義】非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的肝損傷因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的臨床病理綜合癥（中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)，2018）。NAFLD在我國(guó)的患病率高達(dá)25%，已成為我國(guó)第一大慢性肝病且患病年齡逐漸趨于年輕化（Do and Lim，2016）。由于相關(guān)西藥的副作用較多，植物中具有降脂活性的天然產(chǎn)物逐漸受到人們的關(guān)注。肉桂是樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹(shù)皮（侯小濤等，2018），是我國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)認(rèn)定的藥食兩用植物資源。肉桂原產(chǎn)于斯里蘭卡，在我國(guó)主要分布于廣西、廣東、福建、臺(tái)灣等南方地區(qū)。我國(guó)雖然是世界上肉桂最大的出口國(guó)，但多局限于肉桂皮原料和肉桂油粗品的直接出口，不僅缺乏深加工，還造成優(yōu)質(zhì)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。肉桂多酚具有抗氧化（Qin et al.，2014）、調(diào)節(jié)糖脂代謝（姜瓊等，2013;Afrose et al.，2019）的生物活性，且多酚的存在形式可能會(huì)影響其生物活性。因此，探究肉桂不同存在形式的酚類(lèi)提取物對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的影響，對(duì)其資源的開(kāi)發(fā)和高效利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NAFLD一般通過(guò)管理生活方式、手術(shù)治療及服用藥物等方式緩解。研究者主要從胰島素抵抗、肝細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)（遲驍瑋，2021）。但有些藥物具有明顯的副作用，如引發(fā)腹脹和便秘等不良癥狀（陶琦等，2021）。肉桂中已鑒定出的多酚主要為類(lèi)黃酮類(lèi)及其多聚體化合物，包括兒茶素、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、原花青素類(lèi)、縮合單寧和阿魏酸等（胡少平，2014）?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)肉桂的研究主要集中在肉桂提取物的藥理作用上，且取得了一定的成果。Shafiee-Nick等（2012）發(fā)現(xiàn)含有肉桂皮的中草藥混合物可改善糖尿病大鼠高血糖癥，降低血脂和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性。Lopes等（2015）探討了長(zhǎng)期補(bǔ)充肉桂水提物對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)肉桂水提物可減少小鼠體重和脂肪儲(chǔ)存量，有助于預(yù)防或延緩脂質(zhì)紊亂。Tulini等（2016）將富含原花青素的肉桂提取物包埋到固體脂質(zhì)微粒中，改善了其穩(wěn)定性差、味道不好等缺點(diǎn)，有望擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。鐘益寧等（2020）采用濕法制粒技術(shù)，研制了能發(fā)揮降糖作用的肉桂降糖口含片。目前，含肉桂多酚的功能性食品開(kāi)發(fā)正處于起步階段，其市場(chǎng)具有廣闊的前景?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】天然產(chǎn)物來(lái)源豐富且安全性相對(duì)較高，部分天然活性物質(zhì)表現(xiàn)出降脂效果，因此從天然產(chǎn)物中尋找降脂活性成分是目前的前沿研究領(lǐng)域之一。然而，前人對(duì)肉桂酚類(lèi)物質(zhì)的分析多以游離態(tài)多酚含量作為總多酚，往往忽視對(duì)不同存在形式酚類(lèi)物質(zhì)的分析。此外，肉桂不同存在形式的酚類(lèi)物質(zhì)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以華南地區(qū)較為廣泛種植的云野肉桂為原料，分析其不同存在形式的多酚和黃酮含量，并探究游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚提取物對(duì)NAFLD細(xì)胞模型脂肪變性的影響，篩選出較強(qiáng)活性的酚類(lèi)提取物在體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，為肉桂資源的開(kāi)發(fā)和深入利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

云野肉桂由廣西林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所提供，50 ℃烘干后，粉碎過(guò)40目篩保存。軟脂酸、油酸鈉、洛伐他汀和鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購(gòu)自上海凜恩科技發(fā)展有限公司;HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);油紅O染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司;甘油三脂（Triglyceride，TG）、膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）和總蛋白定量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;蘇木素伊紅染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;二甲雙胍購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司;氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉和二甲苯等均為分析純。

主要儀器設(shè)備：UV-1800型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津有限公司）;RW 20 digital均質(zhì)機(jī)（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）;N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）;LDZX-50L型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;SW-CJ-1FD型細(xì)胞超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;THERMO FORMA 370細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）;DMI 4000B光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica微系統(tǒng)有限公司）;SYNERGY H1全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）;YD-AB攤片烤片一體機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）;HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）;SCIEX Q-Trap 6500+（美國(guó)SCIEX公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 肉桂游離酚提取物制備 肉桂游離酚提取物的制備參考Pang等（2017）的方法，并稍作改動(dòng)。稱(chēng)取肉桂粉10 g，按料液比1∶30（w/v）加入70%乙醇，70 KHz下超聲提取0.5 h，4 ℃下離心（4500 r/min，10 min）;收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液;45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并定容至25.0 mL，貯存于冰箱備用。

1. 2. 2 肉桂結(jié)合酚提取物制備 肉桂結(jié)合酚提取物的制備參考Adom和Liu（2002）的方法。向1.2.1得到的肉桂殘?jiān)屑尤? mol/L NaOH溶液15.0 mL，消化振蕩90 min，然后用鹽酸調(diào)pH至2.0，并用適量的乙酸乙酯萃取5次;將萃取液合并，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，定容至10.0 mL后，貯存于冰箱備用。

1. 2. 3 肉桂游離酚/結(jié)合酚提取物中酚類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定 酚類(lèi)物質(zhì)含量采用福林酚法（謝利華，2018）進(jìn)行測(cè)定，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。吸取0.5 mL肉桂游離酚/結(jié)合酚提取物稀釋液，加入2.0 mL去離子水和0.5 mL福林酚試劑后，混勻靜置;再加入5.0 mL 7%碳酸鈉溶液和4.0 mL去離子水，混勻，室溫放置90 min，測(cè)定OD。酚類(lèi)物質(zhì)含量以mg沒(méi)食子酸（GAE）/g表示，以干重計(jì)。

1. 2. 4 肉桂游離酚/結(jié)合酚提取物中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定 黃酮類(lèi)物質(zhì)含量采用硼氫化鈉—四氯對(duì)苯醌法（龐道睿，2018）進(jìn)行測(cè)定，以?xún)翰杷貫闃?biāo)準(zhǔn)品。取1.0 mL樣品稀釋液，氮?dú)獯蹈珊笥靡掖肌臍溥秽?∶1，v/v）復(fù)溶;分別加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液和0.5 mL 74.6 mmol/L AlCl3溶液，室溫反應(yīng)30 min，再加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液，室溫反應(yīng)30 min;加入2.0 mL 8 mmol/L冰醋酸溶液，避光且室溫反應(yīng)15 min;加入1.0 mL 20 mmol/L四氯對(duì)醌溶液，油浴1 h，冷卻后用甲醇定容至4.0 mL，再分別加入1.0 mL 16%香草醛甲醇溶液和2.0 mL濃鹽酸，混勻后暗反應(yīng)15 min，離心，取上清液測(cè)OD。其含量以mg兒茶素（CE）/g表示，以干重計(jì)。

1. 2. 5 NAFLD細(xì)胞模型建立 NAFLD細(xì)胞模型的建立參考殷錦錦等（2014）的方法，稍作改動(dòng)。采用油酸鈉和棕櫚酸（2∶1）誘導(dǎo)建立NAFLD細(xì)胞模型。將HepG2細(xì)胞以每孔4×10接種于96孔板中，進(jìn)行24 h貼壁培養(yǎng)，然后更換含有0.4 mmol/L FFA誘導(dǎo)劑的DMEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)造模24 h。

1. 2. 6 肉桂游離酚/結(jié)合酚提取物對(duì)NAFLD細(xì)胞模型的影響 先通過(guò)CCK-8試劑盒測(cè)定肉桂游離酚/結(jié)合酚提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，確定本研究使用樣品的濃度。將HepG2細(xì)胞以每孔4×104接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換含有不同濃度肉桂酚類(lèi)提取物和0.4 mmol/L FFA誘導(dǎo)劑的DMEM培養(yǎng)基，作用24 h，PBS清洗3次。具體分組如下：空白組：含1% BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);模型組：含0.4 mmol/L FFA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);陽(yáng)性對(duì)照組：含5 μmol/L洛伐他汀和0.4 mmol/L FFA誘導(dǎo)劑DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);試驗(yàn)組：含有不同濃度肉桂游離酚提取物（0.08、0.16、0.32 mg/mL）或肉桂結(jié)合酚提取物（1.5、3.0、6.0 mg/mL）和0.4 mmol/L FFA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。油紅O染色后用顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴的形成情況，并測(cè)定細(xì)胞中TG含量。

1. 2. 7 NAFLD小鼠模型建立 試驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)BALB/c小鼠（4周齡，雄性，體重18～22 g），購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（粵）2016-0041。采用高脂飼料結(jié)合STZ造模。模型組飼喂高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，TP23520）滿(mǎn)2周后，注射100 mg/（kg·bw）STZ輔助造模，并繼續(xù)飼喂4周。眼眶采血檢測(cè)各組小鼠血清TG和TC含量，若與正常組相比，模型組二者含量顯著升高（P<0.05，下同），則模型建立成功（李思錦等，2022）。試驗(yàn)期間所有操作均嚴(yán)格按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)飼養(yǎng)規(guī)范和法律規(guī)定進(jìn)行。

1. 2. 8 肉桂游離酚提取物對(duì)NAFLD小鼠的降脂活性評(píng)價(jià) 在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)之前，按1.2.1的提取方法制備灌胃所需的肉桂游離酚提取物。將肉桂游離酚提取物上清液離心、濃縮、真空冷凍干燥后，保存于-20 ℃冰箱備用。小鼠的灌胃劑量根據(jù)體表面積使用以下公式計(jì)算（閆俐維等，2021）：

小鼠的劑量（mg/kg）=人的劑量（mg/kg）×12.33

結(jié)合Gruenwald等（2010）、Taheri等（2018）的研究結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)置本研究肉桂游離酚提取物的灌胃劑量分別為1、4和8 g/（kg·bw），以鮮重計(jì)。

造模成功后，進(jìn)一步研究肉桂游離酚提取物對(duì)小鼠的降脂活性。按每組6只進(jìn)行分組（表1）。肉桂游離酚提取物灌胃干預(yù)4周后，禁食12 h，麻醉后取血，按照試劑盒的方法檢測(cè)小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。解剖取肝臟，用于分析肝臟指標(biāo)。取100 mg肝臟組織用甲醇∶氯仿（1∶2，v/v）溶液進(jìn)行勻漿，振蕩提取60 min并用氮?dú)獯蹈?，再用適量的異丙醇重新溶解（Wang et al.，2014）。離心取上清液，用于小鼠肝臟TG和FFA含量的測(cè)定。

1. 2. 9 肉桂游離酚提取物組成成分分析 采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法檢測(cè)肉桂游離酚提取物的化學(xué)組成成分。稱(chēng)取50 mg肉桂游離酚提取物凍干粉，溶解于500 μL提取液中。離心（12000 r/min，10 min），取上清液，重復(fù)提取1次;上清液過(guò)濾膜后，保存于進(jìn)樣瓶中。

液相條件：色譜柱為ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相：A為甲醇，B為超純水（加入0.1%甲酸）;梯度洗脫：A溶劑的程序?yàn)?～6 min：95%～50%，7～12 min：50%～5%，12～14 min：5%～5%，14～16 min：5%～95%，二極管陣列紫外檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，紫外檢測(cè)器流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)。

質(zhì)譜條件：采用ESI源，正離子模式下質(zhì)譜電壓5500 V，離子掃描范圍100～800 m/z，溫度550 ℃，氣簾氣35 psi。

1. 2. 10 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠肝臟經(jīng)4%甲醛固定后，用梯度酒精進(jìn)行脫水，然后石蠟包埋切片。HE染色后，參照姚笑睿（2017）的方法對(duì)切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 24.0進(jìn)行方差分析（ANOVA），Duncan’s多重比較方法進(jìn)行顯著性方差分析，以GraphPad Prism 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 肉桂酚類(lèi)提取物中多酚和黃酮含量分析結(jié)果

云野肉桂酚類(lèi)提取物中多酚和黃酮含量測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由圖1-A可知，云野肉桂游離酚含量（55.99±0.45 mg GAE/g）顯著高于結(jié)合酚含量（P<0.05，下同），而與總酚含量（59.20±0.28 mg GAE/g）之間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）。因此，肉桂多酚主要以游離酚的形式存在。由圖1-B可知，游離黃酮含量（42.57±3.20 mg CE/g）顯著高于結(jié)合黃酮含量，而與總黃酮含量（46.49±4.75 mg CE/g）之間無(wú)顯著差異。參考Wang等（2013）的方法，基于酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素的摩爾質(zhì)量，計(jì)算出游離黃酮對(duì)游離酚的貢獻(xiàn)率為44.86%，總黃酮對(duì)總酚的貢獻(xiàn)率為46.50%。由此可知，肉桂黃酮主要以游離黃酮的形式存在，黃酮類(lèi)物質(zhì)是肉桂的主要酚類(lèi)物質(zhì)之一。

2. 2 肉桂酚類(lèi)提取物對(duì)NAFLD細(xì)胞模型的影響

2. 2. 1 游離酚提取物對(duì)NAFLD細(xì)胞模型的影響

通過(guò)CCK-8試劑盒測(cè)定肉桂游離酚提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，當(dāng)提取物濃度為0.04～0.32 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。因此，選擇濃度小于0.32 mg/mL提取物開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。油紅O染色結(jié)果如圖2所示，與空白組相比，模型組內(nèi)紅色脂滴積聚明顯，由此可知積累了大量的脂質(zhì);而不同濃度的肉桂游離酚提取物作用后，一定程度減少了細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴含量。

肉桂游離酚提取物作用后細(xì)胞內(nèi)TG含量如圖3所示。與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)的TG含量顯著升高;與模型組相比，肉桂游離酚提取物低劑量組TG含量降低3.66%，但差異不顯著，中劑量組TG含量顯著降低17.07%，高劑量組TG含量顯著降低26.83%，但高劑量組TG含量與空白組間差異不顯著。

2. 2. 2 結(jié)合酚提取物對(duì)NAFLD細(xì)胞模型的影響

通過(guò)CCK-8試劑盒測(cè)定肉桂結(jié)合酚提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，當(dāng)提取物濃度為0.78～6.25 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。因此，選擇濃度小于6.25 mg/mL肉桂結(jié)合酚提取物開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。油紅O染色結(jié)果如圖4所示，空白組視野內(nèi)有少量的紅色脂滴，而模型組積累了大量的脂質(zhì)且積聚明顯;肉桂結(jié)合酚提取物作用后，細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴未得到明顯改善，仍然積聚明顯。

肉桂結(jié)合酚提取物作用后細(xì)胞內(nèi)TG含量如圖5所示。與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)的TG含量顯著升高;經(jīng)肉桂結(jié)合酚提取物低、中和高劑量作用后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)的TG含量差異不顯著。以上結(jié)果表明，結(jié)合酚提取物處理后，未顯著降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的TG含量。

2. 3 NAFLD小鼠模型的建立

造模成功后，模型組小鼠（圖6-B）與正常組小鼠（圖6-A）相比，毛發(fā)雜亂，且攝食、飲水和排泄量明顯增加。與正常組小鼠體重（27.72±0.75 g）相比，模型組小鼠體重明顯增加，為31.03±1.55 g;模型組小鼠肝臟的重量為2.18±0.42 g，與正常組小鼠（1.33±0.20 g）相比，也有明顯增加。肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，與正常組小鼠（圖6-C）相比，模型組小鼠（圖6-D）肝細(xì)胞排列紊亂，發(fā)生了嚴(yán)重的脂肪樣變性和空泡變性。表明NAFLD小鼠模型建立成功。

2. 4 肉桂游離酚提取物對(duì)小鼠血脂水平的影響

基于體外試驗(yàn)結(jié)果，分析肉桂游離酚提取物對(duì)模型小鼠血脂的影響（表2）。經(jīng)游離酚提取物干預(yù)后，小鼠血清中TG含量與模型組相比顯著降低;分析各組小鼠TC含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中劑量和高劑量的游離酚提取物灌胃干預(yù)后，小鼠血清中TC含量較模型組小鼠分別顯著降低10.39%和25.96%;與模型組小鼠相比，低劑量組小鼠血清中LDL-C含量無(wú)顯著差異，而中劑量組和高劑量組血清中LDL-C含量顯著降低;游離酚提取物干預(yù)后，小鼠血清中HDL-C含量升高，但與模型組相比差異不顯著。因此，肉桂游離酚提取物可降低模型小鼠的TG、TC和LDL-C含量，提高HDL-C含量。

2. 5 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。正常組小鼠肝細(xì)胞大小一致、排列均勻，肝索排列清晰（圖7-A）;模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，發(fā)生嚴(yán)重的脂肪樣變性和空泡變性，排列不規(guī)則，肝索雜亂（圖7-B）;陽(yáng)性藥物組小鼠肝細(xì)胞排列較緊密，空泡變性程度得到改善（圖7-C）。經(jīng)不同濃度的肉桂游離酚提取物作用后，肝細(xì)胞變性程度也得到不同程度緩解;肉桂游離酚提取物低劑量組小鼠肝細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且空泡變性的現(xiàn)象較多（圖7-D）;中劑量組小鼠肝細(xì)胞大小基本一致，排列較規(guī)則，部分區(qū)域仍存在空泡變性現(xiàn)象（圖7-E）;高劑量組小鼠肝細(xì)胞排列較整齊，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度降低，空泡變性細(xì)胞明顯減少（圖7-F）。因此，肉桂游離酚提取物可能對(duì)小鼠脂肪肝有明顯的緩解作用。

2. 6 肉桂游離酚提取物對(duì)小鼠肝臟脂代謝的影響

由圖8-A可知，與空白組小鼠肝臟TG含量（1.54±0.35 mmol/gprot）相比，模型組小鼠的含量（3.08±0.64 mmol/gprot）顯著升高，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝臟中TG含量與空白組差異不顯著;不同劑量的肉桂游離酚提取物灌胃干預(yù)后，各劑量組小鼠肝臟中TG含量均顯著低于模型組小鼠肝臟TG含量。低劑量組小鼠肝臟TG含量為2.03±0.22 mmol/gprot，與模型組小鼠相比降低34.09%;中劑量組和高劑量組小鼠肝臟TG含量分別為2.00±0.09和1.78±0.54 mmol/gprot，較模型組小鼠分別降低35.06%和42.21%。由圖8-B可知，模型組小鼠肝臟FFA含量（0.45±0.05 mmol/gprot）顯著高于空白組小鼠，是正常組小鼠肝臟FFA含量的1.36倍;經(jīng)不同劑量的肉桂游離酚提取物灌胃干預(yù)后，各劑量組小鼠肝臟中FFA含量表現(xiàn)出不同程度的降低。其中，中劑量組和高劑量組肝臟中FFA含量與模型組相比，分別顯著降低17.78%和22.22%。

2. 7 肉桂游離酚提取物成分分析結(jié)果

肉桂游離酚提取物經(jīng)LC-MS/MS分析后，共鑒定出28種化合物，主要由原花青素類(lèi)和糖苷類(lèi)物質(zhì)組成（表3）。原花青素主要包括原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1，其中，原花青素C1含量最高（5384.02±818.06 μg/g），原花青素B2含量（3110.15±474.26 μg/g）次之，原花青素B1含量在原花青素類(lèi)中最少，為120.24±22.32 μg/g。此外，糖苷類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)豐富，含量介于0.02±0.00～7.45±1.00 μg/g。具體物質(zhì)的定性和定量分析見(jiàn)表3。

3 討論

肉桂含有豐富的多酚類(lèi)物質(zhì)，其總酚含量為59.20±0.28 mg GAE/g，明顯高于富含多酚的常規(guī)水果（Sun et al.，2002）。植物多酚主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式存在。游離酚易于提取，可在人體內(nèi)消化吸收;而結(jié)合酚通常以共價(jià)鍵形式（酯鍵、醚鍵和碳—碳鍵）結(jié)合在植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)上（張浩，2021），其可在胃腸道內(nèi)因酶水解而釋放，經(jīng)機(jī)體吸收和代謝發(fā)揮健康益處。有研究表明結(jié)合酚經(jīng)機(jī)體腸道菌群發(fā)酵后可能比游離酚具有更強(qiáng)的生物活性（Acosta-Estrada et al.，2014）。若只對(duì)游離酚進(jìn)行研究而忽略結(jié)合態(tài)多酚的存在，會(huì)低估植物原料中多酚化合物的營(yíng)養(yǎng)健康效應(yīng)。本研究通過(guò)堿水解方式，破壞相關(guān)的共價(jià)鍵來(lái)提取肉桂中的結(jié)合酚，結(jié)果表明，肉桂多酚主要以游離酚的形式存在，也存在一定比例的結(jié)合酚（3.21±0.12 mg GAE/g）。此外，本研究中檢測(cè)到肉桂中總黃酮含量為46.49±4.75 mg CE/g，與前人研究結(jié)果（林款等，2019）存在一定差異，可能與檢測(cè)方法有一定關(guān)系，本研究中所用的SBC法可檢測(cè)包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷醇和花青素等更多的黃酮類(lèi)物質(zhì)，故本研究的測(cè)定結(jié)果可能較前人測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。

大量研究證實(shí)多酚是重要的活性成分，可能具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用（Park et al.，2013;Rafiei et al.，2018）。為探究肉桂酚類(lèi)提取物對(duì)肝臟脂肪變性的調(diào)節(jié)作用，本研究在體外建立NAFLD細(xì)胞模型分析肉桂酚類(lèi)提取物改善NAFLD的活性。國(guó)內(nèi)外的研究表明，可利用游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性構(gòu)建體外模型。張玉龍（2021）、Hsu等（2021）分別以0.5 mmol/L油酸或0.3 mmol/L棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立NAFLD模型，研究鴨油和黃瓜多酚水提物對(duì)脂質(zhì)代謝的影響。然而，飽和脂肪酸（棕櫚酸）和不飽和脂肪酸（油酸）均是人們?nèi)粘ｏ嬍持袛z入的常見(jiàn)長(zhǎng)鏈脂肪酸。由于攝入飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的過(guò)量或失衡會(huì)導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生，且劉萌等（2016）研究發(fā)現(xiàn)油酸和棕櫚酸（2∶1）對(duì)HepG2細(xì)胞毒性較小，誘導(dǎo)后更符合人體脂肪變性的病理過(guò)程，因此，本研究利用0.4 mmol/L FAA誘導(dǎo)劑（油酸鈉∶棕櫚酸=2∶1）造模，并運(yùn)用此模型進(jìn)行肉桂酚類(lèi)提取物改善脂質(zhì)代謝的研究。

肉桂游離酚提取物中含有多種形式的原花青素類(lèi)和糖苷類(lèi)物質(zhì)，還有少量的蘆丁等物質(zhì)存在。目前，已有研究證明上述化合物具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用（Tie et al.，2020;Qin et al.，2021）。原花青素對(duì)脂肪酶具有明顯的抑制作用，且聚合度越高，抑制作用越強(qiáng)（周培羽等，2019）;其可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路，顯著降低體內(nèi)白色脂肪含量，抑制脂肪沉積（顧艾鑫等，2021）。原花青素B2可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)以及脂肪酸代謝、膽汁酸代謝等多個(gè)代謝途徑，顯著改善高血脂模型小鼠的血脂代謝異常和氧化應(yīng)激（吳其國(guó)，2019）。此外，異槲皮苷可改善NAFLD大鼠模型肝臟或肝細(xì)胞脂質(zhì)積聚，減輕炎癥和氧化應(yīng)激（Qin et al.，2018）。蘆丁可減少3T3-L1前脂肪細(xì)胞中脂滴的生成，改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積（徐紅敏和吳惠文，2021），還可降低T2DM大鼠的血糖和血脂，改善其糖脂代謝紊亂（苗建紅等，2014）。因此，肉桂中存在的多種黃酮類(lèi)物質(zhì)可能對(duì)機(jī)體脂代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用。經(jīng)定性和定量分析后，發(fā)現(xiàn)肉桂游離酚提取物中含有的原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1均明顯高于其余23種黃酮類(lèi)化合物。因此，原花青素類(lèi)物質(zhì)可能是改善肝臟細(xì)胞脂肪變性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中結(jié)合酚并未表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，推測(cè)可能是與該存在形式多酚物質(zhì)的含量較低有關(guān)。

已有研究證明油脂是脂肪肝的重要危險(xiǎn)因素，攝入過(guò)多的油脂能促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展（魏穎等，2014）。TG是FFA和甘油形成的脂肪分子，在體內(nèi)含量最高;TG合成所需的FFA主要來(lái)源于血清和糖代謝（廖海林和肖新華，2014）。高脂飼料中的油脂經(jīng)機(jī)體吸收后，會(huì)升高血清中的FFA和TC含量。這為小鼠肝臟的TG合成和TC積累提供了大量原料。本研究結(jié)果表明，中劑量和高劑量的肉桂游離酚提取物干預(yù)后，肝臟的TG和FFA含量顯著降低。這可能與肉桂游離酚提取物抑制腸道油脂的吸收轉(zhuǎn)化，降低血清和肝臟中FFA含量，從而降低肝臟合成TG有關(guān)。此外，HDL可將TC從肝外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，將其轉(zhuǎn)化生成膽汁酸鹽排出體外（王麗霞等，2013）。本研究中肉桂游離酚提取物干預(yù)后，血清中HDL-C含量升高。因此，肉桂游離酚提取物還可能通過(guò)加快TC的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，降低血清中TC。但是其調(diào)節(jié)NAFLD小鼠脂代謝紊亂的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

肉桂多酚主要以游離酚的形式存在，也存在一定比例的結(jié)合酚，且黃酮類(lèi)物質(zhì)是肉桂的主要酚類(lèi)物質(zhì)之一。肉桂游離酚提取物在體外具有改善NAFLD細(xì)胞模型脂肪變性的作用，而結(jié)合酚提取物的作用不明顯。肉桂游離酚提取物不僅可以降低血脂水平，還能降低肝臟中TG和FFA含量，減少肝臟中脂質(zhì)堆積，減輕肝細(xì)胞變性程度。因此，肉桂游離酚提取物對(duì)機(jī)體的肝臟脂肪變性可能起到改善作用，且原花青素類(lèi)物質(zhì)可能是改善肝臟細(xì)胞脂肪變性的主要活性物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）