長白落葉松種子園遺傳多樣性分析

邱新宇 張磊 張含國 閆平玉

摘 要：為分析長白落葉松生產(chǎn)群體的遺傳多樣性及其變化趨勢(shì)，為落葉松優(yōu)良種質(zhì)資源收集、保護(hù)和多世代遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。該文從270對(duì)松科SSR（Simple Sequence Repeat）通用引物中篩選出多態(tài)性高的30對(duì)引物，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)林口縣青山林場(chǎng)長白落葉松種子園105個(gè)單株進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明，30對(duì)引物共檢測(cè)到258對(duì)等位基因，群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)（Average number of observed alleles，Na）為2.833，平均有效等位基因數(shù)（Average number of effective alleles，Ne）為1.814，平均觀測(cè)雜合度（Average observed heterozygosity，Ho）為0.404，平均期望雜合度（Average expected heterozygosity，He）為0.401;群體內(nèi)近交系數(shù)（Inbreeding coefficient in population，F(xiàn)is）、群體總近交系數(shù)（Total inbreeding coefficient in population，F(xiàn)it）均為負(fù)值，表現(xiàn)出群體輕微雜合子過量，未出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象;Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.694，多態(tài)性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）為0.354 1，具有較高遺傳多樣性，遺傳變異主要源于群體內(nèi);UPGMA聚類圖以0.692為閾值，可以將105個(gè)單株分為4個(gè)類群。該研究篩選出的SSR引物具有較好通用性，長白落葉松種子園遺傳多樣性較高，無性系群體遺傳變異水平?jīng)]有降低。

關(guān)鍵詞：長白落葉松;SSR標(biāo)記;通用性;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號(hào)：S791.22??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1006-8023（2022）03-0016-10

Genetic Diversity Analysis of Larix olgensis Clone Seed Orchards

QIU Xinyu， ZHANG Lei， ZHANG Hanguo*， YAN Pingyu

（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：In order to understand the genetic diversity and change trend of Larix olgensis production groups， and to provide scientific basis for collection， protection and multi-generation genetic improvement of L. olgensis excellent breeding resource， 30 pairs of primers with high polymorphism were selected from 270 pairs of Pinaceae SSR universal primers， and 105 individual plants of L. olgensis seed orchard in Linkou Qingshan forest farm were analyzed by SSR molecular markers. The results showed that a total of 258 pairs of alleles were detected with 30 pairs of primers， the average number of observed alleles （Na） was 2.833， the average number of effective alleles （Ne） was 1.814， the average observed heterozygosity （Ho） was 0.404， and the average expected heterozygosity （He） was 0.401. The inbreeding coefficient in population （Fis） and total inbreeding coefficient in population （Fit） were negative， indicated a slight heterozygote excess and no inbreeding decline. The Shannon diversity index （I） was 0.694， and the polymorphism information content （PIC） was 0.354 1， exhibited a high genetic diversity and genetic variation was mainly within the population. The UPGMA cluster diagram took 0.692 as the threshold and divided the 105 individual plants into four groups. The SSR primers for this study have good versatility， the genetic diversity of L. olgensis seed orchard is high， and the genetic variation level of clonal population is not reduced.D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C

Keywords：Larix olgensis; SSR; transferability; genetic diversity;clustering analysis

0 引言

長白落葉松（Larix olgensis）為松科（Pinaceae）落葉松屬（Larix）落葉喬木，是我國優(yōu)良的速生用材、紙漿材樹種，也是東北地區(qū)森林更新和荒山造林的主要樹種之一[1]，且因其樹干通直、圓滿，木材耐腐、 耐濕，具有生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)和分布廣等特點(diǎn)，是電業(yè)、煤礦、造船、橋梁和鐵路等方面的優(yōu)良用材[2]，保存并延續(xù)其優(yōu)良性狀一直是科研人員的研究重點(diǎn)。建立種子園是有效提高樹木種實(shí)遺傳品質(zhì)的根本途徑之一。種子園指由優(yōu)樹無性系或家系建立起來的，以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種實(shí)為目的的林地。優(yōu)樹是從條件相似、林齡相同或相近的同種天然林或人工林中選拔出來的表型優(yōu)良樹木個(gè)體，優(yōu)樹無性系指優(yōu)樹嫁接苗、扦插苗和組織培養(yǎng)苗等繁殖材料，優(yōu)樹家系指由優(yōu)樹自由授粉或控制授粉后所形成的繁殖材料。種子園既要獲得較高的遺傳增益，又必須保持較寬的遺傳基礎(chǔ)[3]，但是作為種子園親本群體的優(yōu)樹基因庫是有限的，加之還需在一定條件下選育，很大比例的天然群體將被淘汰，從而造成其遺傳基礎(chǔ)過窄，多樣性流失，在育種群體和生產(chǎn)群體中往往出現(xiàn)近交和共祖現(xiàn)象，近交使其適應(yīng)力降低，隨著遺傳改良力度加大，遺傳基礎(chǔ)會(huì)越來越窄，阻礙遺傳改良活動(dòng)長久開展[4]。當(dāng)前，種子園遺傳基礎(chǔ)過窄是林木多世代改良中最值得關(guān)注的問題，在分子水平上對(duì)其遺傳多樣性水平和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行科學(xué)分析和評(píng)價(jià)十分必要。

隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展，分子標(biāo)記成為生物信息學(xué)最重要的研究手段之一，利用分子標(biāo)記技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)物種各群體遺傳學(xué)參數(shù)和親緣關(guān)系的快速分析[5]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）是以PCR技術(shù)為核心的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，或稱微衛(wèi)星序列標(biāo)記（Microsatellite Sequence，MS），在落葉松屬植物遺傳分析和基因型分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。何清偉[7]利用20對(duì)SSR分子標(biāo)記選出的華北落葉松（Larix principis-rupprechtii）和長白落葉松優(yōu)樹群體擁有相對(duì)較寬的遺傳參數(shù)變化范圍;董明亮[8]利用新開發(fā)的SSR標(biāo)記得出華北落葉松種子園的遺傳多樣性處于中等水平;貫春雨等[9]利用RAPD、SSR分子標(biāo)記得到日本落葉松（Larix kaempferi）×興安落葉松（Larix gmelinii）雜種F1代群體遺傳多樣性水平各指數(shù)基本一致的結(jié)論;于大德[10]利用10對(duì)SSR引物揭示出華北落葉松種子園親子代之間遺傳多樣性沒有顯著變化，并認(rèn)為在后續(xù)育種工作中可繼續(xù)進(jìn)行高世代優(yōu)樹選擇，不必過度擔(dān)心遺傳多樣性降低。上述研究結(jié)果為落葉松遺傳改良提供了理論依據(jù)，并為落葉松資源高效利用奠定了基礎(chǔ)。

相較闊葉樹種而言，基因組較大、DNA序列缺乏的針葉樹種多樣性研究較為滯后，主要是缺乏有效的分子標(biāo)記，尤其是多態(tài)性好、通用性高的共顯性標(biāo)記。由于微衛(wèi)星序列側(cè)翼有相當(dāng)保守的DNA序列，使得微衛(wèi)星引物具有較高的通用性，因此在同一物種間或物種親緣關(guān)系較近的物種間，甚至分類地位很近的物種間，可以利用引物序列的通用性進(jìn)行遺傳學(xué)研究[4]。物種間所開發(fā)的SSR標(biāo)記或許可以作為可參考的重要標(biāo)記來源，并能夠顯著降低SSR標(biāo)記開發(fā)成本，但關(guān)于落葉松SSR標(biāo)記開發(fā)的研究比起模式植物和其他物種相對(duì)較少。Zhang等[11]利用74條含有興安落葉松SSR的序列設(shè)計(jì)45對(duì)SSR引物，在日本落葉松、華北落葉松和長白落葉松中均成功進(jìn)行了跨物種擴(kuò)增;劉超等[12]利用1 788個(gè)日本落葉松SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)500對(duì)引物，隨機(jī)合成102對(duì)，以紅豆杉科（Taxaceae）、柏科（Cupressaceae）、松科材料為模板進(jìn)行通用性檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增率均在70%以上，并利用101對(duì)SSR引物對(duì)7種不同落葉松品種親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。以上研究表明，不同松科植物間的SSR引物具有良好的通用性。本研究從270對(duì)松科SSR通用引物中篩選出多態(tài)性高的30對(duì)引物，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)林口縣青山林場(chǎng)長白落葉松種子園105個(gè)單株進(jìn)行遺傳分析，以期了解長白落葉松生產(chǎn)群體的遺傳多樣性及其變化趨勢(shì)，為落葉松優(yōu)良種質(zhì)資源收集、保護(hù)和多世代遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來源于黑龍江省林口縣青山林場(chǎng)長白落葉松無性系種子園，無性系親本采自小北湖林場(chǎng)天然母樹林，1994年定植，于第78區(qū)采取105株無性系單株。樣本采用當(dāng)年生幼嫩針葉，分袋標(biāo)記，冰袋運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冷凍保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

使用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的DNA試劑盒提取樣品總DNA，并采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，如圖1所示，DNA條帶清晰明亮，無拖尾彌散。利用Micro Drop超微量分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)量濃度均在100 mg/mL以上，A260/A280為1.8～2.0（核酸純度的指示值，純凈的DNA樣品A260/A280大于1.8，如果比值低于1.8，表示存在蛋白質(zhì)或酸類物質(zhì)的影響），DNA質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。將DNA質(zhì)量濃度稀釋至相同濃度20 mg/mL備用。

1.2.2 引物篩選

對(duì)已發(fā)表的松科SSR引物進(jìn)行篩選，得到火炬松（Pinus taeda）[13-14]、美國白皮松（Pinus albicauli）[15]、大別山五針?biāo)桑≒inus dabeshanensis）[16]、華山松（Pinus armandii）[17]、紅松（Pinus koraiensis）[18]、馬尾松（Pinus massoniana）[19]、毛枝五針?biāo)桑≒inus wangii）[20]、日本落葉松[12，21-22]、華北落葉松[6]和興安落葉松[23-24] 10個(gè)物種共計(jì)270對(duì)SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，隨機(jī)選取5個(gè)樣本DNA對(duì)合成引物進(jìn)行初步篩選，并用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的條帶檢測(cè)，二次篩選用40個(gè)樣本DNA對(duì)可擴(kuò)增出目的條帶的引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，并用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行目的條帶檢測(cè)，進(jìn)一步篩選獲得30對(duì)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物用于遺傳多樣性分析。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C

1.2.3 SSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序

以長白落葉松基因組DNA為模板，SSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照姚宇的研究方法[4]進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件見表1和表2。

1.2.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

基于SSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?qū)﹂L白落葉松105個(gè)單株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，500 bp DNA Marker作為已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用1×TBE電泳緩沖液，設(shè)定恒壓200 V，電泳1.5 h，銀染法染色，在凝膠成像儀下成像。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)于電泳圖譜中的多態(tài)位點(diǎn)，每個(gè)SSR標(biāo)記只統(tǒng)計(jì)目標(biāo)片段范圍內(nèi)的條帶，重復(fù)試驗(yàn)中穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶用于數(shù)據(jù)分析，按照片段由上到下順序，根據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品在凝膠上的指示位置，估計(jì)DNA樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，有帶記為1，無帶記為0。利用GenAlex 6.41、Popgen 32、Power marker和NTSYS-pc 2.10聚類軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，包括觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）以及Shannon多樣性指數(shù)（I）;運(yùn)用Power marker軟件計(jì)算群體多態(tài)性信息含量（PIC）;利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖;使用Structure 2.3.1軟件估計(jì)最佳群體群組數(shù)K值，并將數(shù)據(jù)上傳至Structure 2.3.1 Harvester軟件進(jìn)行分析。GenAlex 6.41和Power marker利用位置與同一泳道GL500分子內(nèi)標(biāo)進(jìn)行比較，得出SSR擴(kuò)增產(chǎn)物長度進(jìn)行計(jì)算，Popgen 32和NTSYS-pc 2. 10利用0-1二進(jìn)制數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。引物通用率和多態(tài)性引物率計(jì)算公式如下：

引物通用率（%）=有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)數(shù)/通用性檢測(cè)的引物對(duì)數(shù)×100。

多態(tài)性引物率（%）=擴(kuò)增出多態(tài)條帶的引物對(duì)數(shù)/有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)數(shù)×100[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物質(zhì)量分析

2.1.1 引物通用性分析

利用270對(duì)SSR引物對(duì)長白落葉松105個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同引物擴(kuò)增得到的譜帶長度明顯不同，標(biāo)記產(chǎn)物大小范圍為100～300 bp。108對(duì)引物可擴(kuò)增出條帶，通用率為40.00%，50對(duì)引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物率為46.30%，不同樹種SSR引物在長白落葉松無性系中的通用性檢測(cè)結(jié)果見表3。與長白落葉松同為落葉松屬的20對(duì)華北落葉松引物，有19對(duì)在長白落葉松無性系中擴(kuò)增出目的條帶，通用率為95.00%，其中有14對(duì)引物在長白落葉松無性系中檢測(cè)到多態(tài)性，多態(tài)性引物率為73.68%，而日本落葉松、興安落葉松分別有48對(duì)、7對(duì)引物在長白落葉松無性系中擴(kuò)增出目的條帶，通用率分別為67.16%、28.00%，分別有30對(duì)、1對(duì)引物在長白落葉松無性系中檢測(cè)到多態(tài)性，多態(tài)性引物率分別為62.50%、14.28%。與長白落葉松親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的松屬的大別山五針?biāo)?、華山松、紅松分別有4對(duì)、5對(duì)、12對(duì)引物在長白落葉松無性系中擴(kuò)增出目的條帶，通用率分別為25.00%、14.70%、34.29%，分別有1對(duì)、1對(duì)、3對(duì)引物在長白落葉松無性系中檢測(cè)到多態(tài)性，多態(tài)性引物率分別為25.00%、20.00%、25.00%。比較下來，落葉松屬的引物通用率明顯高于松屬，說明SSR引物在落葉松屬中具有很好的普適性，在親緣關(guān)系相近的物種間可以共享同一SSR標(biāo)記。

2.1.2 引物多態(tài)性分析

通過對(duì)引物通用性和穩(wěn)定性的驗(yàn)證，華北落葉松篩選出D2-D19[6]，日本落葉松篩選出RH1-RH8、RL2-RL11、RQ3-RQ10[11]，共30對(duì)SSR引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增帶類型、擴(kuò)增帶數(shù)量和多態(tài)性檢出率等方面存在差異，簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果見表4（以GenAlex 6.41計(jì)算為準(zhǔn)）。30對(duì)引物共檢測(cè)到258對(duì)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)2～4個(gè)，平均觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為2.833，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.814，平均觀測(cè)雜合度（Ho）為0.404，平均期望雜合度（He）為0.401，其中RQ4引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，Ne和He最大（分別為3.297和0.697），Shannon多樣性指數(shù)（I）最高（1.291）;RQ3位點(diǎn)的Ne和He最?。ǚ謩e為1.100和0.091），Shannon多樣性指數(shù)（I）最低（0.191）。平均Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.694，平均PIC為0.354 1，其中PIC<0.25的位點(diǎn)有7個(gè)，為低度多態(tài)性位點(diǎn);0.250.5的位點(diǎn)有7個(gè)，為高度多態(tài)性位點(diǎn)。這說明，各位點(diǎn)對(duì)群體遺傳多樣性的檢測(cè)能力和效果不同，篩選的SSR引物能有效揭示群體遺傳多樣性，以引物RH8和RL8為代表的擴(kuò)增結(jié)果分別如圖2和圖3所示。

通常，種群內(nèi)近交系數(shù)（Fis）代表觀測(cè)雜合度與期望雜合度之間的偏差程度，對(duì)群體交配系統(tǒng)具有重要意義[26]。根據(jù)Wright（1978）[27]關(guān)于Fis的計(jì)算公式：Fis=1-Ho/He，當(dāng)Fis小于0時(shí)，則Ho>He，表明遠(yuǎn)交產(chǎn)生的雜合體過多，出現(xiàn)雜合子過剩;當(dāng)Fis大于0時(shí)，則HoSymbol|@@ He，表明近交產(chǎn)生的純合個(gè)體較多，出現(xiàn)純合子過剩。30個(gè)SSR位點(diǎn)的F統(tǒng)計(jì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)is、Fit（群體總近交系數(shù)）分別為-0.049和-0.031，均為負(fù)值，群體表現(xiàn)出輕微雜合子過量，純合子不足，未出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象;基因流Nm平均值為286.232，遠(yuǎn)高于自然群體，說明群體基因穩(wěn)定性較低，基因交流頻繁;根據(jù)公式Nm=0.25（1-Fst）/Fst可知，每代遷入的有效個(gè)體數(shù)與群體間遺傳差異水平成反比，群體越穩(wěn)定，度量群體間遺傳差異程度的Fst越大[28]，群體間遺傳分化系數(shù)Fst平均值為0.018，可見群體間遺傳分化程度較小。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C

2.2 不同統(tǒng)計(jì)方法遺傳多樣性分析

采用不同統(tǒng)計(jì)方法分析遺傳多樣性差異，GenAlex 6.41、Popgen 32、Power marker軟件計(jì)算所得平均觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）均為2.833，平均有效等位基因數(shù)（Ne）基本一致，平均觀測(cè)雜合度（Ho）Popgen 32略高于GenAlex 6.41，但平均期望雜合度（He）和平均Shannon多樣性指數(shù)（I）差異很小，平均Nei基因多樣性指數(shù)（H）則完全相同（表5）。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算分析其差異是否顯著，平均觀測(cè)雜合度（Ho）符合正態(tài)分布，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)計(jì)算P值均小于0.05，平均期望雜合度（He）的P值以及平均Shannon多樣性指數(shù)（I）均為0，平均有效等位基因數(shù)（Ne）不符合正態(tài)分布，配對(duì)樣本的秩和檢驗(yàn)計(jì)算得到P值為1，說明不同遺傳多樣性分析軟件的計(jì)算結(jié)果差異微小，本研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較高可信度。

2.3 聚類分析

為進(jìn)一步分析其中的親緣關(guān)系，根據(jù)長白落葉松種子園105個(gè)單株的遺傳一致度構(gòu)建長白落葉松UPGMA聚類圖。如圖4所示，以0.692為閾值，可將105單株分為4個(gè)類群。105個(gè)單株間遺傳相似系數(shù)為0.518 5～0.923 1，平均遺傳相似度為0.720 4，遺傳距離為0～0.656 7，平均遺傳距離為0.336 8，說明選取的長白落葉松單株在分子水平上具有一定差異，其遺傳多樣性較豐富。長白落葉松105個(gè)單株中，第9單株與第72單株之間的遺傳相似度最?。?.518 5），遺傳距離最大（0.656 7），說明二者之間的遺傳差異最大。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

對(duì)長白落葉松種子園生產(chǎn)群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析可知，lnP（D）隨著K值增加逐漸降低，lnP（D）在K=4時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，此時(shí)ΔK為最大值，如圖5所示，根據(jù)似然數(shù)最大原則確定最佳群體數(shù)目[29]，可將105個(gè)單株分為4個(gè)理論群組，意味著長

白落葉松種子園105個(gè)單株分化為4個(gè)不同基因型族。如圖6所示，橫坐標(biāo)表示105個(gè)單株，縱坐標(biāo)表示Q分布，長白落葉松被劃分為4亞群體：第一亞群包括單株25、84和27，第二亞群只包括單株89，第三亞群包括單株7、9、12、31、32、37、55、61、67、79、80、90，其余為第四亞群。

3 討論與結(jié)論

不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致SSR長度的高度變異性，這一變異性正是微衛(wèi)星變異的實(shí)際遺傳基礎(chǔ)。物種之間DNA序列的同源性，使得不同物種間轉(zhuǎn)移使用SSR引物成為可能，已有試驗(yàn)證明同科不同屬或更近物種間可共用某些SSR引物[30]。從近緣物種270對(duì)引物中篩選出108對(duì)引物，可以在40個(gè)長白落葉松無性系中成功擴(kuò)增，通用率為40.00%，落葉松屬112對(duì)引物中有效引物45對(duì)，多態(tài)性引物率高達(dá)60.81%，松屬158對(duì)引物通用率為21.52%，多態(tài)性引物率為14.71%，其中與長白落葉松同為落葉松屬的華北落葉松、日本落葉松、興安落葉松引物通用率分別為95.00%、67.16%、28.00%，多態(tài)性引物率引物率分別為73.68%、62.50%、14.28%。這些引物幾乎在所有供試材料上均能擴(kuò)增出與目的條帶大小相似的產(chǎn)物，但不同屬間SSR引物揭示的多態(tài)性水平不盡相同，表明本研究篩選的SSR引物表現(xiàn)出較高的通用性和多態(tài)性，屬間通用引物成功率主要依賴于屬間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，與劉超等[12]開發(fā)的落葉松引物通用性檢測(cè)結(jié)果一致。本試驗(yàn)篩選出30對(duì)有效引物，其中RQ4等位基因數(shù)最多，Ne和He最大，RQ3相比之下較低，也驗(yàn)證了不同屬SSR引物雖然跨屬間高度擴(kuò)增，但多態(tài)性水平存在差異。一個(gè)標(biāo)記系統(tǒng)的交叉轉(zhuǎn)移程度決定其在其他遺傳研究中的適用性，應(yīng)用多種DNA標(biāo)記方法有助于從長白落葉松全基因組組織分化角度，更準(zhǔn)確揭示長白落葉松的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究篩選的多態(tài)性SSR引物，特異性強(qiáng)且穩(wěn)定性較好，對(duì)于目前只有少量SSR引物公布的落葉松屬樹種來說，豐富了現(xiàn)有分子標(biāo)記資源，有助于落葉松屬種群遺傳結(jié)構(gòu)、品種指紋圖譜構(gòu)建以及種質(zhì)鑒定等研究領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展，尤其對(duì)分析遺傳背景較近的資源意義重大。

從多種遺傳多樣性軟件計(jì)算得到的數(shù)據(jù)可以看出，每個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)2～4個(gè)不等，平均觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）均為2.833，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.737 0～1.815 7，觀測(cè)雜合度（Ho）為0.383 0～0.617 3，期望雜合度（He）為0.371 0～0.404 4，Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.654 0～0.693 9，平均PIC為0.354 1，說明種子園遺傳多樣性較高，無性系遺傳多樣性也未降低。姚宇[4]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)林口青山種子園38個(gè)長白落葉松無性系親代與子代遺傳多樣性進(jìn)行分析，子代群體和親代群體的Shannon多樣性指數(shù)（I）分別為1.023 2和0.980 5，比本試驗(yàn)利用30對(duì)SSR引物研究77區(qū)和78區(qū)共105個(gè)單株的遺傳多樣性（0.673）高，與長白落葉松種子園77區(qū)347個(gè)單株的ISSR遺傳多樣性相比，平均Shannon多樣性指數(shù)（I）略高于單株的0.436，分析其原因可能是長白落葉松無性系種子園存在部分砧木存活等情況，下一步將利用分子標(biāo)記手段對(duì)種子園內(nèi)無性系進(jìn)行鑒定分析，也可能是不同數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法存在一定誤差。與范英明[31]得到的20個(gè)華北落葉松天然群體的平均Shannon多樣性指數(shù)（0.787）相比，差異不明顯，說明種子園的無性系遺傳多樣性高。

在進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，遺傳距離是反映遺傳變異水平和遺傳分化程度的重要指標(biāo)，可為雜種優(yōu)勢(shì)提供基本遺傳參數(shù)[32-33]。長白落葉松種子園105個(gè)單株的平均遺傳相似度為0.720 4，平均遺傳距離為0.336 8，說明其存在一定程度的遺傳差異。華北落葉松20個(gè)天然群體的平均遺傳距離為0.035 3[32]，日本落葉松無性系種子園按5個(gè)種源計(jì)算的遺傳距離為0.002～0.015[34]，長白落葉松種子園單株之間的遺傳距離與種源之間相比明顯要高得多。且從Structure 2.3.1的分析結(jié)果將其歸為4個(gè)類群，說明種子園的遺傳組成存在明顯差異，長白落葉松種內(nèi)遺傳分化比較廣泛，無性系遺傳多樣性豐富，進(jìn)一步表明種子園遺傳多樣性高，無性系分布配置合理。在后續(xù)的育種工作中，可以參考胡立平等[35]對(duì)長春長白落葉松種子園子代測(cè)定的方法，進(jìn)一步研究林口青山長白落葉松種子園遺傳增益與遺傳多樣性的平衡點(diǎn)，有利于長白落葉松高輪次遺傳改良的發(fā)展，為營建多世代種子園奠定基礎(chǔ)。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C

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