萬(wàn)古霉素高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵配方優(yōu)化

王會(huì)會(huì) 程啟東 戴夢(mèng) 趙建強(qiáng) 任風(fēng)芝 葛鹍鵬 張志江

摘 要：為了提高東方擬無(wú)枝酸菌產(chǎn)萬(wàn)古霉素的發(fā)酵單位，降低生產(chǎn)成本，采用紫外誘變、常壓室溫等離子體誘變對(duì)東方擬無(wú)枝酸菌出發(fā)菌株V19-02進(jìn)行誘變處理，通過(guò)篩選鏈霉素抗性突變菌株，選育高產(chǎn)菌株;通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源進(jìn)行篩選，選取葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉4個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，獲得的高產(chǎn)菌株V19-1-07搖瓶發(fā)酵單位提高33.7%，且具有良好的傳代穩(wěn)定性;優(yōu)化后的培養(yǎng)基配比質(zhì)量分?jǐn)?shù)為葡萄糖8.0%、淀粉1.0%、低溫豆粉1.0%、酵母粉4.0%、氯化鈉1.0%、磷酸二氫鉀0.1%;小試結(jié)果證明，優(yōu)化配方可使50 L罐發(fā)酵單位平均達(dá)到14 110 μg/mL，比原始配方提高了28.9%。因此，研究獲得的高產(chǎn)菌株V19-1-07可應(yīng)用于萬(wàn)古霉素工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，以幫助企業(yè)降低成本，進(jìn)一步提高競(jìng)爭(zhēng)力。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵工程;萬(wàn)古霉素;復(fù)合誘變;菌種選育;均勻設(shè)計(jì);東方擬無(wú)枝酸菌

中圖分類號(hào)：TQ465.9?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx03011

Breeding of high vancomycin producing strains and optimization of fermentation formula

WANG Huihui1，2，3，CHENG Qidong4，DAI Meng1，2，3，ZHAO Jianqiang4，REN Fengzhi1，2，3，

GE Kunpeng1，2，3，ZHANG Zhijiang4

（1.New Drug Research & Development Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;2.National Engineering Research Center of Microbial Medicine，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;3.Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;4.Huasheng Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China）

Abstract：In order to increase the yield of vancomycin by Amycolatopsis orientalis and reduce the cost，the original strain Amycolatopsis orientalis V19-02 was treated by UV and atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）.High yield strains were selected by screening streptomycin resistance treatment.Meanwhile，the carbon sources and nitrogen sources of fermentation medium were optimized and four factors including glucose，starch，low-temperature soybean powder and yeast powder were selected for uniform design experiment.The results show that the yield of vancomycin fermentation of the high-yield mutant strain Amycolatopsis orientalis V19-1-07 is increased by 33.7% in flask culture.In addition，the strain has an excellent propagating stability.The optimal fermentation medium is as follows：glucose 8.0%，starch 1.0%，low-temperature soybean powder 1.0%，yeast powder 4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1%.The experimental results show that the production of vancomycin reachs 14 110 μg/mL under the optimal conditions by the strain V19-1-07 in 50 L fermentor，which is 28.9% higher than the original formula.After applied to large-scale production，it is conductive to reduce the cost and improve the competitiveness of enterprises further.

Keywords：

fermentation engineering;vancomycin;complex mutagensis;strain breeding;uniform design;Amycolatopsis orientalis

萬(wàn)古霉素（vancomycin）由東方擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵所得，其通過(guò)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖來(lái)殺死細(xì)菌[1]，是臨床上用于治療由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引起的嚴(yán)重感染疾病的重要藥物[2]。萬(wàn)古霉素的應(yīng)用日漸增多，在巨大的市場(chǎng)前景下，提高發(fā)酵單位、降低生產(chǎn)成本，有利于企業(yè)在競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)有利地位[3-4]。

中國(guó)生產(chǎn)萬(wàn)古霉素的廠家（如浙江新昌制藥、浙江海正藥業(yè)、重慶大新藥業(yè)及華北制藥等）都在致力于提高發(fā)酵單位的研究。江蘇海闊生物醫(yī)藥有限公司[5]采用核糖體誘變選育方法獲得的萬(wàn)古霉素生產(chǎn)菌株發(fā)酵液產(chǎn)量（質(zhì)量濃度，下同）高達(dá)8.9 g/L，且菌株傳代穩(wěn)定，連續(xù)傳代5次后萬(wàn)古霉素產(chǎn)量穩(wěn)定性高達(dá)92.7%;北大方正集團(tuán)有限公司等[6]通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中每天補(bǔ)加0.1%～0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的硫酸銨，萬(wàn)古霉素含量（質(zhì)量濃度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可達(dá)到10 157 μg/mL。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作簡(jiǎn)單、突變率高、獲得的突變株穩(wěn)定性好，已在諸多領(lǐng)域應(yīng)用并取得成效[7]。關(guān)亞鵬等[8]應(yīng)用ARTP誘變選育非達(dá)霉素高產(chǎn)菌株，搖瓶發(fā)酵能力比出發(fā)菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列誘變篩選措施對(duì)萬(wàn)古霉素產(chǎn)生的菌株?yáng)|方擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02進(jìn)行選育，旨在獲得萬(wàn)古霉素高產(chǎn)菌株，并且通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)一步提高萬(wàn)古霉素的發(fā)酵單位。

1 材 料

1.1 菌種

研究所用菌種為東方擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由華北制藥華勝有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

1）種子培養(yǎng)基（除pH值外，其余物質(zhì)含量均為質(zhì)量濃度）

葡萄糖為20.0 g/L，蛋白胨為5.0 g/L，NaCl為5.0 g/L，K2HPO4為0.3 g/L，pH值為7.0～7.2。

2）發(fā)酵培養(yǎng)基（除pH值外，其余物質(zhì)含量均為質(zhì)量濃度）

葡萄糖為30.0 g/L，工業(yè)淀粉為80.0 g/L，酵母粉為10.0 g/L，低溫豆粉為15.0 g/L，NaCl為1.0 g/L，KH2PO4為0.1 g/L，pH值為7.0～7.2。

1.3 主要原材料和儀器設(shè)備

1）原材料

葡萄糖，河北金鋒淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家莊賽特工貿(mào)有限公司提供;工業(yè)淀粉，河北興柏藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供;酵母粉，浙江東成生物科技股份有限公司提供;低溫豆粉，欒城縣通大工貿(mào)有限公司提供;無(wú)機(jī)鹽，均由天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供。

2）儀器設(shè)備

發(fā)酵搖瓶機(jī)（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等離子誘變儀，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色譜儀，島津公司提供;PICO 21離心機(jī)，Thermo公司提供。

2 方 法

2.1 檢測(cè)方法

1）菌體濃度的檢測(cè)

采用PMV法（packed mass volume）測(cè)定菌體生物量[9]。

2）樣品處理方法

取發(fā)酵液1.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000 r/min離心10 min后取上清液進(jìn)樣。

3）HPLC檢測(cè)色譜條件

色譜柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-三乙胺水（pH值為3.2，體積分?jǐn)?shù)為0.2%），三者體積比為7∶1∶92），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

2.2 培養(yǎng)方法

1）斜面及平板培養(yǎng)

取冷凍保存的甘油管接入斜面培養(yǎng)基或誘變處理的單孢子懸液涂布于平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)6～8 d。

2）種子培養(yǎng)

挖取約0.5 cm2斜面孢子接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，28 ℃培養(yǎng)24 h。

3）發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，28 ℃培養(yǎng)6 d放瓶。

4）50 L罐培養(yǎng)

采用兩級(jí)發(fā)酵，母瓶種子液以體積分?jǐn)?shù)0.5%接種于10 L種子培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后以體積分?jǐn)?shù)5%接種量轉(zhuǎn)接于30 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵過(guò)程中通氣比為1 m3/（m3·min-1），初始攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)控制攪拌調(diào)節(jié)溶氧量，保證最低溶氧量不低于20%（體積分?jǐn)?shù)）。發(fā)酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培養(yǎng)7 d放罐。

2.3 高產(chǎn)菌株選育

2.3.1 單孢子懸液的制備

取生長(zhǎng)良好的斜面2支，加入無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的三角瓶中，搖床120 r/min振蕩15 min打散菌體，過(guò)濾后制備成約106個(gè)/mL的單孢子懸液。

2.3.2 鏈霉素最低抑制濃度的確定

取50 μL單孢子懸液分別涂布于含有不同濃度鏈霉素的平板培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)6～8 d。

2.3.3 復(fù)合誘變選育菌株

1）紫外誘變

取單孢子懸液置無(wú)菌平皿中，于紫外誘變箱（照射距離為30 cm，紫外功率為30 W）分別照射30，40，60，80，100 s，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)6～8 d。根據(jù)菌落大小和形態(tài)特征，每個(gè)誘變條件下挑選80～100個(gè)單菌落按照2.2項(xiàng)的方法進(jìn)行篩選，計(jì)算突變率。

2）ARTP誘變

取單孢子懸液涂于金屬載片上，于ARTP誘變箱（電源功率為110 W，工作氣流量為10 L/min，照射距離為2 mm），分別處理15，30，45，60，90 s后，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)6～8 d。根據(jù)菌落大小和形態(tài)特征，每個(gè)誘變條件下挑選80～100個(gè)單菌落按照2.2項(xiàng)的方法進(jìn)行篩選，計(jì)算突變率。

3）復(fù)合誘變

根據(jù)確定的最佳條件紫外照射60 s、ARTP誘變45 s，采用復(fù)合誘變處理萬(wàn)古霉素單孢子懸液。

2.3.4 鏈霉素抗性菌株選育

將復(fù)合誘變處理的單孢子懸液涂布于含鏈霉素1 500 μg/mL（質(zhì)量濃度）的抗性平板上，長(zhǎng)出的菌株即為抗性菌株，通過(guò)搖瓶試驗(yàn)篩選高產(chǎn)菌株。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 碳源的選擇

選取葡萄糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油作為基礎(chǔ)碳源，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察碳源對(duì)萬(wàn)古霉素的影響。

2.4.2 氮源的選擇

選取低溫豆粉、高溫豆粉、硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕作為基礎(chǔ)氮源，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察氮源對(duì)萬(wàn)古霉素的影響。

2.4.3 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基成分

選取單因素試驗(yàn)中影響效果較大的葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉4個(gè)因素為自變量，分別用X1，X2，X3和X4表示，發(fā)酵效價(jià)為因變量，用Y表示;根據(jù)均勻設(shè)計(jì)V4.0版軟件提供的模型設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選高產(chǎn)菌株發(fā)酵的最適配方。

3 結(jié)果與分析

3.1 鏈霉素最低抑制濃度的確定

將東方擬無(wú)枝酸菌菌懸液涂布于鏈霉素抗性平板，隨著抗性濃度的增加菌落生長(zhǎng)越來(lái)越弱，當(dāng)抗性濃度（質(zhì)量濃度，下同）達(dá)1 500 μg/mL時(shí)，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明鏈霉素對(duì)東方擬無(wú)枝酸菌出發(fā)菌株的最低抑制濃度（質(zhì)量濃度，下同）為1 500 μg/mL。

3.2 誘變條件的選擇

對(duì)出發(fā)菌株誘變處理結(jié)果見(jiàn)表1和表2。由表可見(jiàn)，隨著紫外（UV）和ARTP誘變處理時(shí)間延長(zhǎng)，致死率越高，負(fù)突變率也越高，而正突變率呈上升又下降的趨勢(shì)。紫外處理60 s時(shí)，致死率為95.4%，正突變率高達(dá)20.5%。ARTP處理45 s和60 s時(shí)，正突變率分別為18.7%和17.8%，相差不大，但負(fù)突變率差距明顯，故選擇45 s作為最佳處理時(shí)間。

3.3 復(fù)合誘變及鏈霉素抗性篩選

按照2.3.3項(xiàng)和2.3.4項(xiàng)的方法處理篩選萬(wàn)古霉素高產(chǎn)菌株，挑選出245個(gè)生長(zhǎng)良好的單菌落，經(jīng)多次搖瓶篩選，獲得8株發(fā)酵水平提高20%以上的菌株，其中菌株V19-1-07提高幅度達(dá)到33.7%，結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。

經(jīng)誘變處理后，東方擬無(wú)枝酸菌在平皿固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)突起、高聳，有褶皺或呈火山狀突起，產(chǎn)孢子情況明顯差異（見(jiàn)圖2），從中挑取單菌落，用搖瓶試驗(yàn)篩選高產(chǎn)菌株。

3.4 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性

菌株傳代穩(wěn)定性是決定其能否用于工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素[10]。將選育的高產(chǎn)菌株V19-1-07采用斜面?zhèn)鞔绞?，考察穩(wěn)定性，連續(xù)傳代5次，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)酵效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4。菌株V19-1-07從F1到F4代，發(fā)酵效價(jià)波動(dòng)水平不超過(guò)10%，說(shuō)明高產(chǎn)菌株具有良好的傳代穩(wěn)定性，有利于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。

3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

3.5.1 碳源的優(yōu)化

微生物的生長(zhǎng)繁殖和合成產(chǎn)物均離不開(kāi)碳源物質(zhì)。發(fā)酵工業(yè)中常用的碳源有糖類、油脂、有機(jī)酸和小分子醇等。本研究選取葡萄糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油為唯一碳源，考察不同碳源對(duì)高產(chǎn)菌株V19-1-07生長(zhǎng)和合成萬(wàn)古霉素的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，淀粉和葡萄糖對(duì)東方擬無(wú)枝酸菌菌絲生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物均有利，發(fā)酵單位明顯高于其他碳源，因此，選取淀粉和葡萄糖進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.5.2 氮源的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成。本研究選取低溫豆粉、高溫豆粉、硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕分別作為唯一氮源，考察不同氮源對(duì)萬(wàn)古霉素高產(chǎn)菌株V19-1-07的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。低溫豆粉和酵母粉作為唯一氮源時(shí)，發(fā)酵液中萬(wàn)古霉素含量明顯高于其他氮源，因此，選取酵母粉和低溫豆粉作為氮源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.5.3 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基

按照2.4.3項(xiàng)的方法，設(shè)置4個(gè)因素、6個(gè)水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化，其中，4個(gè)因素分別為葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉，賦值（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）范圍分別為1.0%～8.0%，2.4%～8.0%，1.0%～4.0%，1.0%～4.0%，設(shè)計(jì)的U6（64）試驗(yàn)方案以及優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表5。

利用均勻設(shè)計(jì)V4.0版軟件進(jìn)行分析，采用最優(yōu)回歸子集法得到發(fā)酵效價(jià)（Y）對(duì)4個(gè)因素（葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、低溫豆粉（X3）、酵母粉（X4））的回歸方程：Y=277.106 526 3+899.378 027 7X1-77.148 630 8X1X1+112.085 849 6X1X4-18.138 399 4X2X3。

對(duì)回歸方程的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6，得到的最優(yōu)解見(jiàn)表7。

由回歸方程的方差分析表6可見(jiàn)，相關(guān)系數(shù)R2值和p值都很合理，說(shuō)明方程擬合很好，方程有極其顯著的意義。確定的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方為葡萄糖8.0%，淀粉1.0%，低溫豆粉1.0%，酵母粉4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1% 。

3.6 50 L發(fā)酵罐驗(yàn)證

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，使用2.2項(xiàng)的方法，在50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行配方驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表8。由表可見(jiàn)，被均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，使發(fā)酵效價(jià)較原來(lái)提高28.9%，高產(chǎn)菌株在50 L罐代謝曲線和發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5可見(jiàn)，高產(chǎn)菌株V19-1-07在50 L發(fā)酵罐中，前40 h菌體生物量快速增長(zhǎng)，總糖急劇下降，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌體緩慢增長(zhǎng)，進(jìn)入次級(jí)代謝階段，產(chǎn)物快速合成，呈直線上升趨勢(shì)。發(fā)酵160 h后溶氧量和pH值都開(kāi)始回升，總糖質(zhì)量濃度降至10 g/L左右，表明發(fā)酵結(jié)束。

4 討 論

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變是利用在常溫（25～40 ℃）和常壓下（1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓），產(chǎn)生高活性粒子（包括處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）的等離子體射流作用于生物體，影響細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)活性，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生變化，產(chǎn)生明顯的誘變效果[11]。ARTP具有操作簡(jiǎn)單、突變穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。李磊[12]應(yīng)用ARTP獲得了小球藻突變株BYQ-1，生物量比出發(fā)株增加了13.24%。肖志強(qiáng)等[13]采用ARTP誘變處理黏著劍菌，篩選出高產(chǎn)維生素B12的誘變菌株，經(jīng)過(guò)2輪ARTP誘變處理后搖瓶發(fā)酵單位相比于原始菌株提高了24.8%。張拴力等[14]采用ARTP誘變?nèi)樗崛榍蚓?，獲得一株產(chǎn)乳酸鏈球菌素達(dá)到6 120 IU/mL的突變株。紫外和化學(xué)誘變等傳統(tǒng)誘變育種方法是獲得高產(chǎn)菌株的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，多年來(lái)一直應(yīng)用于工業(yè)微生物菌種的改良。但是，長(zhǎng)期、重復(fù)使用某種誘變?cè)矗鶎?dǎo)致突變率低、突變譜窄和抗性飽和[15]。兩種或多種誘變劑同時(shí)使用的復(fù)合誘變處理可擴(kuò)大突變的位點(diǎn)范圍，增大獲得正突變株的可能性。胡悅等[16]采用LiCl-ARTP復(fù)合誘變處理地衣芽孢桿菌，獲得了高產(chǎn)堿性蛋白酶的優(yōu)良菌株。黃玉等[17]用紫外和ARTP復(fù)合誘變金龜子綠僵菌，獲得了產(chǎn)孢量高、耐紫外線、毒力強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定的高性能優(yōu)良菌株。

研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉素抗性與核糖體蛋白上氨基酸殘基的改變有關(guān)，這些特定位點(diǎn)的突變會(huì)啟動(dòng)菌體產(chǎn)生抗生素，從而提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[18-19]。目前核糖體工程中主要采用鏈霉素、利福霉素、慶大霉素等抗生素作為篩選壓力，該方法能夠快速提高抗生素的產(chǎn)量，耗費(fèi)時(shí)間較少。魯鳳娟等[20]利用核糖體工程技術(shù)選育得到了米爾貝霉素的高產(chǎn)菌株，李文華等[21]應(yīng)用該技術(shù)選育了卡伍爾鏈霉菌高產(chǎn)菌株。

本研究首次將ARTP誘變選育技術(shù)應(yīng)用于東方擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis orientalis），并結(jié)合紫外誘變和鏈霉素抗性篩選，對(duì)出發(fā)菌株萬(wàn)古霉素產(chǎn)生菌V19-02進(jìn)行誘變育種，獲得的高產(chǎn)菌株V19-1-07搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高了33.7%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可用于萬(wàn)古霉素工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

5 結(jié) 語(yǔ)

本研究通過(guò)復(fù)合誘變和抗性篩選選育萬(wàn)古霉素高產(chǎn)菌株，采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，經(jīng)50 L罐驗(yàn)證后，較初始提高28.9%。經(jīng)選擇誘變條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫外誘變處理60 s 時(shí)正突變率為20.5%，ARTP誘變處理45 s時(shí)正突變率達(dá)18.7%，鏈霉素對(duì)東方擬無(wú)枝酸菌的最小抑制濃度為1 500 μg/mL，經(jīng)以上誘變技術(shù)選育的高產(chǎn)菌株V19-1-07從F1到F4代，發(fā)酵效價(jià)波動(dòng)水平不超過(guò)10%，遺傳穩(wěn)定，表明東方擬無(wú)枝酸對(duì)誘變處理較敏感，ARTP誘變和核糖體工程技術(shù)用于東方擬無(wú)枝酸菌誘變選育可行有效。通過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)篩選出的葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方中淀粉比例由初始的80 g/L降為10 g/L，降低了培養(yǎng)基的黏稠程度，有利于徹底滅菌，避免了染菌情況的出現(xiàn)。同時(shí)培養(yǎng)基變的稀薄，增加了溶氧的傳遞，有利于菌絲生長(zhǎng)。

在鏈霉素抗性篩選過(guò)程中，以含鏈霉素最小抑制濃度1 500 μg/mL的抗性平板進(jìn)行突變菌株篩選，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)篩選得到鏈霉素抗性不小于1 500 μg/mL的突變菌株，復(fù)篩后獲得8株發(fā)酵水平提高20%以上的菌株。下一步可繼續(xù)考察這8株菌的鏈霉素抗性濃度，探索鏈霉素抗性與萬(wàn)古霉素產(chǎn)量之間的關(guān)系。均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方中葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L，由于葡萄糖含量較高，在以后的發(fā)酵工藝優(yōu)化中可降低初始葡萄糖含量，采用補(bǔ)糖的方式提供碳源，考察分批補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)萬(wàn)古霉素發(fā)酵的影響，該方式提高碳源的轉(zhuǎn)化率，降低發(fā)酵成本，有利于企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的提升。

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