磷脂酶D水解活性測定方法的研究

王鋆坦，郭碧珊，張夢雪，朱海華*，許君，劉紅偉，王法云，王慧

（1.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450002；2.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；4.上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025）

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是大腦中調(diào)控細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白功能狀態(tài)的磷脂[1]，具有提高腦細(xì)胞活力、改善記憶力、修復(fù)大腦損傷、緩解疲勞以及平衡情緒等多種生理功能[2-3]，被稱為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”，已通過美國食品藥品監(jiān)督管理局的安全認(rèn)證，被國家衛(wèi)生健康委員會批準(zhǔn)為新資源食品[4]。磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是生物法制備PS的關(guān)鍵合成酶，具備水解磷酸二酯鍵和堿基互換的能力，可催化高純度磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和L-絲氨酸合成PS[5]。PLD在自然界中來源廣泛，如植物中的大豆和卷心菜、動(dòng)物的腦和肝臟、微生物中的鏈霉菌和酵母等[6-7]。與動(dòng)植物來源相比，微生物來源的PLD具有較強(qiáng)的底物耐受性，較寬廣的底物專一性和較高的堿基交換催化活性[8]，從而備受人們關(guān)注。此外，PLD在生物膜形成、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮著重要作用[9-10]。

目前，對PLD的報(bào)道多集中在結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理方面，動(dòng)力學(xué)方面的研究進(jìn)展緩慢，其中一個(gè)限制性因素就是PLD的活力測定困難[11]，由于該酶水解反應(yīng)需在水-有機(jī)相系統(tǒng)中進(jìn)行，且反應(yīng)產(chǎn)物為磷脂酸（弱酸）[12]，為酶活力的快速、準(zhǔn)確測定帶來不便。傳統(tǒng)測定方法如分光光度法和固體顯色法是以卵磷脂的相似物為底物間接反映其活力[13]，存在靈敏度和準(zhǔn)確度不高等問題。此外，還有放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記法和高效液相法等，此類方法雖然準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜，不適合酶活力快速檢測[14-15]。酶聯(lián)比色法通過直接測定水解產(chǎn)物來檢測酶活，是目前最常用的PLD活力測定方法[16]。該方法靈敏性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)且成本大。同時(shí)，由于相關(guān)研究中的PLD來源不同，酶活定義和計(jì)算方法模糊，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件不同，現(xiàn)仍存在誤差偏大、缺乏系統(tǒng)性等諸多問題[17]。而市面上PLD活性檢測試劑盒價(jià)格普遍較高，對樣品的適應(yīng)性不強(qiáng)，難以滿足試驗(yàn)需求[18]。因此，研究開發(fā)一種便捷、高效的磷脂酶D水解活性測定方法勢在必行。

本研究從反應(yīng)機(jī)理出發(fā)，基于酶聯(lián)比色法對反應(yīng)底物、反應(yīng)條件、反應(yīng)體系、反應(yīng)終止等方面進(jìn)行逐步探究和優(yōu)化，旨在確定一套科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、靈活實(shí)用、適用性強(qiáng)的磷脂酶D水解活性測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLD：從鏈霉菌中分離純化所得[19]；不同來源（蛋黃、大豆、鏈霉菌）以及不同純度（PC含量分別為70%、80%、90%）的卵磷脂：生工生物工程（上海）股份有限公司；膽堿氧化酶（10 U/mg）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（300 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；FeCl3、FeSO4、CuCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2、CaCl2、TritonX-100、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、二甲基亞砜、乙醚、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、4-氨基氨替吡啉、苯酚（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠；振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-78CN）：上海知楚儀器有限責(zé)任公司；臺式離心機(jī)（CT15RE）：日本日立公司；多功能微孔板檢測儀（Infine200pro）：瑞士迪肯公司。

1.3 方法

1.3.1 反應(yīng)溶液制備

底物溶液：用80%乙醇溶液溶解蛋黃卵磷脂至終濃度為10 mg/mL，渦旋振蕩5 min后置于冰上待用；膽堿氧化酶母液：用蒸餾水溶解膽堿氧化酶至終濃度為250 U/mL，存放于-20℃待用；過氧化氫酶母液：用0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液溶解過氧化氫酶至終濃度為200 U/mL存放于4℃待用。

1.3.2 酶聯(lián)比色法測定磷脂酶D水解活性

1.3.2.1 反應(yīng)原理

反應(yīng)分為3個(gè)階段：底物磷脂酰膽堿經(jīng)PLD水解生成磷脂酸和膽堿；膽堿在膽堿氧化酶的作用下生成甜菜堿和H2O2；H2O2酶將H2O2分解為氧化物，氧化4-氨基氨替吡啉和苯酚生成粉紅色醌類混合物，于500 nm波長處下測定吸光值[20-21]。

1.3.2.2 反應(yīng)體系

磷脂酶D酶活檢測包括解離和顯色兩個(gè)反應(yīng)體系。解離反應(yīng)體系：200 μL反應(yīng)液A中加入200 μL底物溶液，37℃、200 r/min搖床預(yù)混合5min。加入100 μL稀釋后的酶液繼續(xù)反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后向解離體系中加200 μL反應(yīng)終止液，37℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 min，12 000 r/min離心取上清液。顯色反應(yīng)體系：取2.5mL反應(yīng)液B加入離心后上清并混勻，加入2 U膽堿氧化酶，2 U過氧化氫酶，放入搖床37℃、200 r/min反應(yīng)30 min，制備為待測樣品溶液。

酶活測定反應(yīng)體系的組成如表1所示。

表1 酶活測定反應(yīng)體系的組成Table 1 Composition of reaction system for determination of enzyme activity

1.3.2.3 吸光度的檢測

使用全波長酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測。取100 μL待測樣品溶液加入96孔板在500 nm波長處檢測吸光度值，分別以空板和去離子水為對照，對照組和試驗(yàn)組的每個(gè)樣品做3組平行，計(jì)算均值和方差。

1.3.2.4 磷脂酶D水解活性的計(jì)算

磷脂酶D水解活性定義：在溫度為37℃和pH值為5.5的條件下，磷脂酶D每分鐘解離磷脂酰膽堿生成1 μmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

酶活力計(jì)算如下式所示。

式中：D為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)；n為膽堿物質(zhì)的量，mol；t為PLD水解時(shí)間，10 min；V為所取發(fā)酵液體積，0.1 mL。

1.3.3 底物來源的選擇及底物溶液制備

1.3.3.1 底物來源及純度的選擇

選擇不同來源（大豆、蛋黃、鏈霉菌）以及不同純度（PC含量分別為70%、80%、90%）的卵磷脂配制底物溶液進(jìn)行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

1.3.3.2 底物溶劑及濃度的選擇

選擇甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、二甲基亞砜、乙醚等有機(jī)溶劑配制10 mg/mL的底物溶液，渦旋振蕩15 min，觀察底物溶解難易情況及反應(yīng)顏色變化。對其中效果較好的乙醇溶液進(jìn)一步優(yōu)化，分別以30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液作溶劑進(jìn)行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

1.3.4 磷脂酶D酶學(xué)性質(zhì)測定

最佳反應(yīng)溫度：分別設(shè)置溫度為30、37、44、51、58、65、72℃進(jìn)行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

最佳反應(yīng)pH值：分別設(shè)置pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0進(jìn)行酶活力測定。定義最高酶活力為100%，以相對酶活作圖。

最佳金屬離子助劑：對不添加金屬離子的對照組和分別添加終濃度為10 mmol/L的金屬離子（Fe3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Na+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+） 試驗(yàn)組進(jìn)行酶活力測定[22]。定義對照組酶活力為100%，以相對酶活作圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，采用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂酶D水解活性標(biāo)準(zhǔn)曲線

底物磷脂酰膽堿經(jīng)PLD水解生成了磷脂酸和膽堿，膽堿作為反應(yīng)物進(jìn)行下一階段的酶聯(lián)反應(yīng)，它極易吸收二氧化碳和水且遇熱分解，在酸性的反應(yīng)體系中會生成更穩(wěn)定的氯化膽堿[23]。為了對酶水解反應(yīng)中生成的膽堿進(jìn)行定量，測定了以氯化膽堿物質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，500 nm下的吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 磷脂酶D水解活性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of activity of phospholipolysis D

由圖1可知，氯化膽堿物質(zhì)的量在0～2.0 μmol范圍內(nèi)，與吸光度有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.461 8x+0.042 8，R2=0.998 8。根據(jù)回歸方程計(jì)算n[23]。

2.2 底物來源及純度的選擇

底物卵磷脂對相對酶活的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同來源及純度的卵磷脂與相對酶活的關(guān)系Fig.2 Relationship between lecithin from different sources and purity and relative enzyme activity

由圖2可知，鏈霉菌來源的卵磷脂的相對酶活檢測水平最高，70%純度的底物相對酶活可保持在78%。大豆來源的卵磷脂的相對酶活最低，90%純度的底物的相對酶活僅有62%。蛋黃卵磷脂的相對酶活隨純度的升高逐漸增強(qiáng)，90%純度的蛋黃卵磷脂作為底物的相對酶活能保持在75%。鑒于鏈霉菌來源的卵磷脂價(jià)格昂貴，大豆來源的卵磷脂相對酶活檢測穩(wěn)定性差，90%純度的蛋黃卵磷脂成本低廉，相對酶活檢測穩(wěn)定性高。綜合考慮選擇90%純度的蛋黃卵磷脂作為底物。

2.3 底物溶劑及濃度的選擇

2.3.1 底物溶劑的選擇

卵磷脂是一種混合物，除含有參與反應(yīng)的磷脂酰膽堿外，還包含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和膽堿等物質(zhì)[24]。有機(jī)磷脂有其特定的溶解條件，根據(jù)相似相溶原理，需用極性有機(jī)試劑溶解。不同溶劑對底物卵磷脂的溶解情況見表2。

表2 不同溶劑溶解卵磷脂的情況及反應(yīng)顏色變化Table 2 The situation of dissolving lecithin in different solvents and the change of reaction color

由表2可知，選擇不同試劑溶解底物，發(fā)現(xiàn)簡單醇類對卵磷脂溶解度較好，甲醇、乙醇、乙醇水溶液這3種溶劑對底物溶解情況最佳，顏色變化也相對更明顯?？紤]到酶聯(lián)反應(yīng)的特殊性，溶劑在保證能完全溶解底物的同時(shí)須兼顧后續(xù)反應(yīng)，對體系中其它反應(yīng)物也要有較好的溶解度。由于反應(yīng)在水相中進(jìn)行，而卵磷脂、膽堿、苯醌都能溶于乙醇，因此選擇乙醇水溶液作為底物溶劑。

2.3.2 乙醇含量的選擇

乙醇含量對相對酶活的影響結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇含量與相對酶活的關(guān)系Fig.3 Relationship between ethanol content and relative enzyme activity

由圖3可知，當(dāng)乙醇含量為30%時(shí)，相對酶活僅有42%。隨著乙醇占比增高，PLD的相對酶活也逐漸增高，在乙醇含量為80%時(shí)，PLD相對酶活達(dá)到最高；乙醇含量達(dá)到90%時(shí)，相對酶活明顯下降，保持在85%。乙醇含量在90%～100%之間相對酶活差異不明顯，無水乙醇作底物溶劑時(shí)相對酶活為78%。

2.4 磷脂酶D的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最佳反應(yīng)溫度

溫度對相對酶活的影響結(jié)果見圖4。

圖4 溫度與相對酶活的關(guān)系Fig.4 Relationship between temperature and relative enzyme activity

由圖4可知，在37℃時(shí)，測得的PLD酶活力水平最高，以其為對照，計(jì)算其它溫度下的相對酶活。隨著溫度的升高，相對酶活逐漸升高，當(dāng)溫度升高到44℃時(shí)，PLD相對酶活明顯下降，在44℃～51℃之間相對酶活差異不明顯，72℃時(shí)相對酶活達(dá)到最小值。

2.4.2 最佳反應(yīng)pH值

pH值對相對酶活的影響結(jié)果見圖5。由于PLD酶解離磷脂酰膽堿生成膽堿的反應(yīng)在酸性環(huán)境下進(jìn)行，因此設(shè)置pH值均小于7。

圖5 pH值與相對酶活的關(guān)系Fig.5 Relationship between pH and relative enzyme activity

由圖5可知，pH值為4.0時(shí)相對酶活僅為60%，隨著pH值的升高，PLD的相對酶活逐漸增高，在pH值為5.5時(shí)達(dá)到最高值，pH值為6.0時(shí)PLD相對酶活保持在85%，pH值在6.0～6.5之間相對酶活差異不明顯，在pH值為7.0時(shí)仍能保持72%的相對酶活。

2.4.3 不同金屬離子對相對酶活的影響

不同金屬離子對相對酶活的影響結(jié)果見圖6。

圖6 不同金屬離子與相對酶活的關(guān)系Fig.6 Relationship between different metal ions and relative enzyme activity

由圖6可知，加入 Cu2+、Zn2+、Mn2+時(shí)，PLD 的相對酶活明顯下降，其中Mn2+最低，相對酶活為71%。加入Fe3+、Fe2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+時(shí)，PLD 的相對酶活升高，分別為120%、118%、130%、132%、140%和150%，加入Ca2+后相對酶活的提升最為明顯，較對照組提高了50%。

3 結(jié)論

本文通過對酶聯(lián)比色法測定磷脂酶D水解活性的方法進(jìn)行研究，分別對反應(yīng)底物、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和反應(yīng)過程進(jìn)行了一定的改良和優(yōu)化。選擇蛋黃卵磷脂和80%的乙醇溶液配制底物溶劑，同時(shí)配制反應(yīng)液A、B，簡化試驗(yàn)步驟，試驗(yàn)測得水解反應(yīng)的最佳條件為37℃，pH值為5.5，同時(shí)加入10 mmol/L CaCl2作為金屬離子助劑。反應(yīng)終止液成分：0.1 mol/L pH值為8.0的 Tris-HCl、10 mmol/L EDTA 和 10 g/L 16-烷基-3-甲基氯化銨。該方法測定磷脂酶D的酶活力在保證靈敏度的情況下兼具可操作性，減少了對儀器設(shè)備和樣品種類的限制，降低了成本，有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。