白芍總苷對(duì)肝郁脾虛模型大鼠腦-腸軸炎性因子表達(dá)的影響

★ 彭志婷 李晨 周艷麗 王新 胡書群（.徐州市中醫(yī)院藥劑科 江蘇 徐州 00；.徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇 徐州 009）

腹瀉常出現(xiàn)易痛易怒、情緒躁動(dòng)不安、精神抑郁等問(wèn)題［1］，因此很多現(xiàn)代研究將其歸結(jié)為腦-腸軸系統(tǒng)問(wèn)題。由于肝郁脾虛病理機(jī)制復(fù)雜，其常與腦、腸組織中多種炎癥因子如白介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、P物質(zhì)（SP）和干擾素-γ（IFN-γ）等相關(guān)［2-5］。目前臨床多以抗抑郁藥、胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)藥、調(diào)節(jié)免疫藥和抗炎藥等多種藥物聯(lián)合使用，治療程序相對(duì)復(fù)雜，提高了藥物在配伍禁忌和協(xié)同治療過(guò)程中的潛在風(fēng)險(xiǎn)，不利于安全用藥［6］。芍藥歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血柔肝的功效，用于多種脅痛、腹痛、四肢攣痛，是治療肝郁脾虛證的組方中常用藥物之一［7］。白芍總苷（total glucosides of paeonia，TGP）是從白芍中提取分離得到的苷類混合物，主要包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷以及芍藥花苷等，臨床多用于調(diào)節(jié)免疫和保肝等作用［8-9］。白芍總苷作為白芍的主要有效成分在治療肝郁脾虛型腹瀉的研究卻相對(duì)較少。本研究通過(guò)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激結(jié)合導(dǎo)泄藥刺激的方法建立肝郁脾虛證模型［10-12］，并觀察白芍總苷對(duì)肝郁脾虛模型大鼠機(jī)械痛閾、腸推進(jìn)和腦前額葉皮層組織，腸組織病理形態(tài)和腸道內(nèi)IL-1β、SP、TNF-α和IFN-γ的影響，初步探討白芍總苷對(duì)肝郁脾虛腹瀉證腦腸軸組織的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）；電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；Von Frey機(jī)械痛閾檢測(cè)纖維絲（美國(guó)賽默飛公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）；動(dòng)物呼吸麻醉劑（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 材料

番瀉葉（安徽亳千草國(guó)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1807039）500 g，8倍水煎煮 2 h，煎煮兩次，合并兩次藥液減壓濃縮至每毫升含1 g藥材，備用；IFN-γ 試 劑 盒（ 批 號(hào)：JM-01762R1），SP試 劑盒（批號(hào)：JM-01851R1），IL-1β試劑盒（批號(hào)：JM-01454R1），IL-6試劑盒（批號(hào)：JM-01597R1），TNF-α試劑盒（批號(hào)：JM-01587R1），均購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司。。活性炭粉、阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉、高脂飼料為市售分析純；馬來(lái)酸曲美布汀膠囊（山西振東安特生物制藥有限公司，批號(hào)：20200404），用生理鹽水配制2 mg/mL 混懸液備用；白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司，批號(hào)：200307）取白芍總苷膠囊內(nèi)容物，加0.3%羧甲基纖維素鈉溶液，分別配制成5、10、20 mg/mL的溶液。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，初始體重（220±20）g，購(gòu)自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK<蘇>2015-0009），飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，每日隨日光交替光照，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

SD雄性大鼠60只隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組以及白芍總苷低、中、高劑量組，給藥劑量分別為 50、100、200 mg/（kg·d）；陽(yáng)性對(duì)照組，給予馬來(lái)酸曲美布汀20 mg/（kg·d）。每組各10只。

2.2 模型的建立

除正常組外，其余各組均采用高脂飲食喂養(yǎng)，每天冰水浴刺激 5 min、噪音刺激 1 h、束縛 8 h 和10 mL/（kg·d）番瀉葉提取物導(dǎo)瀉的方法持續(xù)6周，建立肝郁脾虛證大鼠模型，然后分別給予各設(shè)計(jì)藥物，連續(xù)用藥 7 d。

2.3 足底機(jī)械痛閾測(cè)試

給藥第7天后，采用纖維絲法測(cè)量各組大鼠足底機(jī)械縮痛閾，依次使用不同強(qiáng)度的Von-Frey纖維絲刺激大鼠左后肢足底，記錄實(shí)驗(yàn)大鼠最早出現(xiàn)縮足、甩足、抬足或舔足動(dòng)作時(shí)的纖維絲強(qiáng)度為痛閾值。

2.4 腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

痛閾測(cè)試完畢后，間隔2 h給予各組動(dòng)物10 mL/kg體重的10%活性碳與5%阿拉伯膠混懸液灌胃，計(jì)時(shí)30 min后將實(shí)驗(yàn)大鼠脫頸處死，分離完整的胃腸道，測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠幽門至活性炭黑前沿的距離，以從幽門至回盲連接處全長(zhǎng)為小腸全長(zhǎng)，按照炭墨前端與幽門的距離/小腸全長(zhǎng)×100%計(jì)算腸推進(jìn)百分率。

2.5 病理學(xué)和相關(guān)炎癥因子測(cè)定

各組大鼠麻醉后脫頸處死，取前額葉皮層組織，多聚甲醛固定后進(jìn)行皮層組織的IL-1β、TNF-α免疫熒光染色，再另取前額葉皮層組織用Elisa法考察IL-1β、TNF-α的水平變化。取空腸道組織，多聚甲醛固定后HE染色觀察病理學(xué)變化，另取空腸組織使用Elisa試劑盒法檢測(cè)各組大鼠腸組織中IL-1β、TNF-α、SP和IFN-γ水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

收集各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以（±s）表示，組間比較采用方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 機(jī)械痛閾和腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與正常組比較，模型組的腸推進(jìn)率顯著增加，痛閾顯著降低（P<0.05)，白芍總苷給藥組和模型組比較，痛閾值均顯著提高（P<0.05)，其中白芍總苷低劑量組對(duì)痛閾的作用最顯著，陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)痛閾值作用較弱；白芍總苷對(duì)腸推進(jìn)作用有抑制效果，陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)腸推進(jìn)作用最顯著。見(jiàn)表1。

表1 各組動(dòng)物機(jī)械痛閾和腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s ，n=10）

表1 各組動(dòng)物機(jī)械痛閾和腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s ，n=10）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 機(jī)械痛閾值/g 腸推進(jìn)率/%正常組 24.17±4.49 45.86±6.25模型組 7.00±1.67 73.85±8.27白芍總苷高劑量組 15.63±6.67*# 55.73±9.5*#白芍總苷中劑量組 15.33±5.96*# 61.33±7.32*#白芍總苷低劑量組 17.50±7.12*# 62.50±5.58*#陽(yáng)性對(duì)照組 11.92±7.76*# 49.67±6.33#

3.2 前額葉皮層免疫熒光結(jié)果

模型組大鼠前額葉皮層組織較正常組IL-1β的綠色熒光和TNF-α的粉色熒光顯著增加，且IL-1β和TNF-α的熒光共定位不在同一區(qū)域，IL-1β的綠色熒光只在皮層外側(cè)和細(xì)胞核中，而TNF-α的粉色熒響應(yīng)較多，在皮層實(shí)質(zhì)非核區(qū)域也有顯著響應(yīng)；白芍總苷中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組IL-1β的綠色熒光顯著減少；給藥后TNF-α的粉色熒光響應(yīng)皮層實(shí)質(zhì)區(qū)有所減少，作用較陽(yáng)性對(duì)照組弱。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠前額葉皮層組織免疫熒光染色（IL-1β、TNF-α，IF×40）

3.3 皮層組織IL-1β和TNF-α水平

與正常組比較，模型組大鼠皮層組織中IL-1β、和TNF-α水平均顯著升高（P<0.05），與模型組相比，各給藥組均可不同程度降低大鼠腸道組織中的炎性因子，其中中劑量白芍總苷對(duì)皮層IL-1β水平作用最顯著（P<0.05），隨白芍總苷劑量增加，皮層TNF-α水平現(xiàn)在降低，中、高劑量組作用較陽(yáng)性對(duì)照藥作用更顯著（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 大鼠皮層組織中IL-1β和TNF-α水平（±s ，n=10） pg/g

表2 大鼠皮層組織中IL-1β和TNF-α水平（±s ，n=10） pg/g

注：與模型組比較，*P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別 IL-1β TNF-α正常組 92.43±7.30 4.53±1.18模型組 131.96±10.53 11.35±2.89白芍總苷高劑量組 122.05±20.58* 5.29±1.05*#白芍總苷中劑量組 105.37±13.06*# 5.81±0.98*#白芍總苷低劑量組 115.39±18.96* 6.54±1.76*陽(yáng)性對(duì)照組 118.40±14.61* 7.35±1.42*

3.4 腸組織病理結(jié)果

模型組大鼠腸道組織較正常組出現(xiàn)明顯的腸道絨毛損傷，組織結(jié)構(gòu)有不清晰，有部分絨毛斷裂和炎性聚集，白芍總苷低劑量組腸道絨毛結(jié)構(gòu)有斷裂，中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組腸道絨毛結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠腸組織病理切片（HE，×40）

3.5 腸道組織IL-1β、SP、TNF-α和IFN-γ水平

與正常組比較，模型組大鼠腸道組織中IL-1β、SP、TNF-α和IFN-γ水平均顯著升高（P<0.05），與模型組相比，各給藥組均可不同程度降低大鼠腸道組織中的炎性因子（P<0.05），其中IL-1β、SP、TNF-α水平變化隨白芍總苷劑量增加，而低劑量組對(duì)腸道組織中IFN-γ水平作用最顯著。見(jiàn)表3。

表3 大鼠腸道組織中IL-1β、SP、TNF-α和IFN-γ水平（±s ，n=10） pg/g

表3 大鼠腸道組織中IL-1β、SP、TNF-α和IFN-γ水平（±s ，n=10） pg/g

注：與模型組比較，*P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別 IL-1β SP TNF-α IFN-γ正常組 442.21±54.86 53.70±6.66 7.69±1.42 3.20±1.03模型組 913.88±79.13 123.16±9.61 14.34±3.56 6.19±1.39白芍總苷高劑量組 703.01±74.29*# 85.40±9.02*# 8.77±1.76*# 5.13±1.55*白芍總苷中劑量組 736.38±151.72*# 89.45±11.89*# 9.26±1.39*# 5.08±1.83*白芍總苷低劑量組 715.67±63.12*# 96.93±14.75*# 9.10±2.06*# 3.97±1.17*#陽(yáng)性對(duì)照組 921.47±36.65 111.93±14.42* 12.18±2.23* 5.92±3.79

4 討論

在臨床中肝郁脾虛引起的腸道功能紊亂，其病因病機(jī)與肝脾氣機(jī)不暢有關(guān)。如張子和曰：“夫憤郁不伸，則肝氣乘脾”，意為肝氣郁結(jié)，情志抑郁，氣血不暢，可致疏泄失常，氣機(jī)郁滯，引起脾胃功能失常。肝郁脾虛證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的心身應(yīng)激反應(yīng)相似，常與人體在非正常情況下或高負(fù)荷的壓力事件以及受到的強(qiáng)烈刺激因素有關(guān)［13］。長(zhǎng)期的心身應(yīng)激狀態(tài)造成機(jī)體整體較高的負(fù)荷［14］，引起抑郁或中樞的氧化應(yīng)激損傷，繼而出現(xiàn)中樞皮層炎性因子高表達(dá)，也能引起疼痛的敏感化。應(yīng)激反應(yīng)在外周消化道組織則主要表現(xiàn)為腹瀉或便秘以及腸道的炎癥反應(yīng)，同時(shí)引起消化系統(tǒng)組織血管收縮，供血減少，阻礙腸道屏障功能修復(fù)［15］。

白芍功效偏重養(yǎng)血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗，主治胸腹脅肋疼痛、瀉痢腹痛等疾病，是經(jīng)典的平肝止痛中藥。白芍總苷具有顯著的抗抑郁功效，具有顯著的抗應(yīng)激作用，可有效緩解焦慮抑郁狀態(tài)［16-17］。本實(shí)驗(yàn)研究了白芍總苷干預(yù)動(dòng)物模型的機(jī)械痛閾和腸推進(jìn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以現(xiàn)在提高肝郁脾虛證大鼠模型的機(jī)械痛閾值，并且抑制腸推進(jìn)率的亢進(jìn)，其中高劑量效果更顯著。

由于肝郁脾虛證病理機(jī)制復(fù)雜，涉及中樞皮層的多種炎癥因子IL-1β、TNF-α和腸道神經(jīng)遞質(zhì)如SP［3-4］。IL-1β在產(chǎn)生炎性反應(yīng)和疼痛敏感化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激，可激活皮層和腸道組織的免疫細(xì)胞迅速釋放IL-1β，并誘導(dǎo)產(chǎn)生早期炎癥反應(yīng)，并刺激炎癥組織釋放TNF-α、SP等更多種炎性介質(zhì)使炎癥反應(yīng)擴(kuò)散，其中SP是重要的腸道神經(jīng)遞質(zhì)，不僅加重炎性反應(yīng)，還可引起腸道平滑肌興奮，腸推進(jìn)增加，并且降低腸道痛覺(jué)閾值，是現(xiàn)成痛覺(jué)敏感的重要因素［14］。因此，腸道組織中IL-1β、SP、TNF-α的水平可以作為研究肝郁脾虛證腸道炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)部分免疫因子干擾素如IFN-γ也和肝郁脾虛證關(guān)系密切［3］。IFN-γ又稱免疫干擾素，由T細(xì)胞產(chǎn)生，干擾素不僅可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬能力，還可增強(qiáng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織上皮細(xì)胞以及部分結(jié)締組織細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的黏附作用，達(dá)到聚集淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)TNF-α生物學(xué)作用的效果，對(duì)研究肝郁脾虛證整體疾病進(jìn)程具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)的組織病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以顯著減輕肝郁脾虛模型組大鼠前額葉皮層組織IL-1β和TNF-α的響應(yīng)，其中白芍總苷對(duì)IL-1β的作用較顯著，陽(yáng)性對(duì)照藥曲美布汀對(duì)皮層TNF-α的作用較白芍總苷更顯著。白芍總苷可有效減輕腸道組織中的炎性反應(yīng)，抑制炎性細(xì)胞的滲出和聚集。炎性因子的檢測(cè)結(jié)果顯示，白芍總苷可抑制腸道組織中相關(guān)炎性因子IL-1β、SP、TNF-α的水平，而對(duì)IFN-γ的作用結(jié)果并未隨劑量增加，白芍總苷低劑量組的抑制效果優(yōu)于高劑量組。

綜上所述，肝郁脾虛證的慢性應(yīng)激過(guò)程是腸道功能紊亂發(fā)生的重要病因，本研究對(duì)比了白芍總苷對(duì)肝郁脾虛大鼠的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)白芍總苷對(duì)肝郁脾虛模型大鼠的痛閾和腸推進(jìn)率具有顯著作用，其中低劑量的白芍總苷可顯著的提高痛閾、抑制痛覺(jué)敏感，高劑量白芍總苷抑制對(duì)模型的腸推進(jìn)效果更顯著，組織病理學(xué)顯示白芍總苷可顯著抑制肝郁脾虛型腦-腸軸的炎癥反應(yīng)，抑制炎性因子IL-1β、SP、TNF-α和IFN-γ水平。由此可見(jiàn)白芍總苷在肝郁脾虛證IBS的治療過(guò)程中具有較好的應(yīng)用前景和深入挖掘研究的價(jià)值。