動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜高效制備丹酚酸A工藝研究

★ 劉地發(fā) 王振 周鵬 余水平 王章偉（1.暨南大學(xué) 廣州 510635；2.創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西 贛州 341000；3.江西青峰藥業(yè)有限公司 江西 贛州341000）

丹參水溶性酚酸類化合物的研究是國(guó)內(nèi)新藥研究的熱點(diǎn)，目前已有注射用丹參多酚酸和注射用丹參多酚酸鹽等多個(gè)品種上市銷售。丹酚酸類化合物有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的功能，其中丹酚酸 A（salvianolic acid A）活性最強(qiáng)［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，丹酚酸 A 具有抗氧化［2-4］、抗血栓［5］、抗炎［6］等多重藥理作用，對(duì)腦缺血及缺血再灌損傷具有明顯保護(hù)作用［7-9］。然而，丹參藥材中丹酚酸A的天然含量非常低［10］，高效制備高純度丹酚酸A難度系數(shù)大。目前關(guān)于丹酚酸A的制備工藝多屬于實(shí)驗(yàn)室級(jí)別［11-12］，采用常規(guī)制備方法成本高，步驟繁瑣，且丹酚酸A純度達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，工藝重現(xiàn)性差，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，無(wú)法滿足新藥開(kāi)發(fā)的需求。因此，有必要尋找一種簡(jiǎn)便快速的制備方法，以便更好地開(kāi)發(fā)利用丹酚酸A。

工業(yè)制備色譜是大規(guī)模分離和制備活性成分的重要方法，其高效的優(yōu)勢(shì)在中藥分離純化研究中的作用逐漸突顯。其中，動(dòng)態(tài)軸向壓縮技術(shù)（Dynamic axial compression，DAC）作為一種新型的制備色譜技術(shù)，因其柱效高、重現(xiàn)性好、分離效率高、制備量大等優(yōu)點(diǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注［13］。文獻(xiàn)報(bào)道，該技術(shù)已用于梔子苷［14］、銀杏內(nèi)酯 B［15］、斷氧化馬錢子苷［16］、芍藥苷［17］等化合物的純化制備，并獲得良好的收益。本實(shí)驗(yàn)旨在采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜技術(shù)，以正相硅膠為填料，建立一種快速大量制備高純度丹酚酸A的方法，實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，促進(jìn)相關(guān)新藥的研究進(jìn)程，同時(shí)也為從其他植物中制備高純度單一天然藥物成分提供一條新的思路和方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；ACE Excel 3 C18-PFP 色譜柱（3.0 μm，4.6 mm×150 mm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；Nicolet iS5紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；XS105DU/ML204T 電子天平（梅特勒-托利多科技有限公司）；Waters Xevo G2-XS Q-TOF 質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）；BRUKER AV-400 型核磁共振譜儀（瑞士布魯克公司）；DAC-HB 150動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜系統(tǒng)（150 mm ×650 mm，江蘇漢邦科技有限公司）。

1.2 材料

丹參購(gòu)自陜西商洛丹參GAP種植基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltorrhizaBge.的干燥根和根莖；丹酚酸 A對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量平衡法含量99.2%（江西青峰藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20181210）；柱層析正相硅膠（300~400目，青島海灣精細(xì)化工有限公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；溴化鉀（光譜純，中世沃克〈天津〉科技發(fā)展股份有限公司）；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；95%乙醇（藥用級(jí)，梅河口市阜康酒精有限責(zé)任公司）；環(huán)己烷（分析級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑股份有限公司）；叔丁基甲基醚（分析級(jí)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；雙蒸水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ACE Excel 3 C18-PFP 色譜柱（3.0 μm，4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為甲醇∶乙腈（50∶50，A）-0.1%磷酸溶液（B）；流速：0.7 mL/min，進(jìn)樣體積 10 μL，柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm。洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 丹酚酸A液相檢測(cè)洗脫梯度表

2.2 質(zhì)譜條件

Waters Xevo G2-XS Q-TOF質(zhì)譜儀記錄其質(zhì)譜圖。離子源：ESI離子源，掃描模式：PositiveTOF，毛細(xì)管電壓 2 500 V，離子源溫度：120 ℃，脫溶劑氣溫度：450 ℃，脫溶劑氣流量：600 L/h，錐孔氣流量：50 L/h，質(zhì)荷比掃描范圍100~1 200 Da，流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水（1∶1），流速 0.2 mL/min，柱溫：40 ℃，色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。

2.3 丹酚酸A粗品制備

丹參藥材粉碎，加水（10倍、8倍、6倍）溫浸提取3次，提取液減壓濃縮、醇沉，濾過(guò)，濾液調(diào)pH后轉(zhuǎn)化，離心。離心液通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱富集純化，收集目標(biāo)洗脫液，減壓濃縮、叔丁基甲基醚萃取，萃取液減壓濃縮至稠膏，即得丹酚酸A粗品，備用。丹酚酸A粗品純度80%以上。

2.4 動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜分離

2.4.1 柱層析填料選擇硅膠介質(zhì)是天然產(chǎn)物批量制備的主要角色，利用硅膠表面與溶質(zhì)分子之間的范德華力或硅膠表面的硅羥基與待分離物質(zhì)之間的氫鍵作用，達(dá)到良好的分離純化效果。根據(jù)丹酚酸A粗品的性質(zhì)和雜質(zhì)情況，以正相硅膠（300~400目）為填料進(jìn)行分離純化。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明硅膠能有效去除丹酚酸A粗品中的色素和雜質(zhì)，得到的目標(biāo)產(chǎn)品性狀好。綜合考慮選擇300~400目正相硅膠作為分離填料純化丹酚酸A粗品。

2.4.2 色譜洗脫溶劑選擇以薄層色譜法（TLC）為依據(jù)，根據(jù)不同溶劑的性質(zhì)，選擇洗脫體系。實(shí)驗(yàn)比較正己烷-叔丁基甲基醚、環(huán)己烷-叔丁基甲基醚溶劑體系不同配比，對(duì)“2.3”項(xiàng)下的丹酚酸A粗品進(jìn)行單向展開(kāi)，雜質(zhì)的比移值（Rf值）在0.2~0.3之間。以斑點(diǎn)數(shù)、分離度、拖尾現(xiàn)象為柱色譜分離能力的判斷指標(biāo)，對(duì)分離溶劑系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選，選擇分離度好、無(wú)脫尾的系統(tǒng)作為色譜分離的洗脫劑。結(jié)果表明，環(huán)己烷-叔丁基甲基醚、正己烷-叔丁基甲基醚系統(tǒng)對(duì)樣品均有較好的分離作用。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，正己烷屬低毒類溶劑，且具有高揮發(fā)性、高脂溶性，并有蓄積作用。正己烷主要通過(guò)呼吸道、皮膚、消化道等進(jìn)入人體，對(duì)中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)損害，對(duì)皮膚黏膜的刺激作用，長(zhǎng)期接觸可致多發(fā)性周圍神經(jīng)病變，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，甚至肌肉萎縮，嚴(yán)重者可引起肝腎損害［18］。結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)要求及溶劑本身的性質(zhì)（安全性、質(zhì)量可控性、沸點(diǎn)等）、溶劑使用原則、溶劑價(jià)格等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，選擇環(huán)己烷-叔丁基甲基醚系統(tǒng)作為色譜分離的洗脫劑。通過(guò) TLC 初步確定柱色譜洗脫劑的洗脫梯度為：先用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（4∶6，V/V）洗脫，再用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（3∶7，V/V）洗脫。

2.4.3 純化硅膠用量篩選采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱（150 mm× 650 mm），以正相硅膠（300~400 目）為填料制備丹酚酸A。取“2.3”項(xiàng)下丹酚酸A粗品（含丹酚酸A200g），加適量硅膠（300~400目）拌樣，干燥。另按丹酚酸A與層析硅膠（300~400目）1∶10、1∶15、1∶20、1∶25不同重量比例，進(jìn)行柱層析，柱層析參數(shù)如下：洗脫流速500 mL/min，紫外檢測(cè)器在線跟蹤檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm），洗脫劑體系及洗脫梯度為：先用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（4∶6，V/V）洗脫至丹酚酸A出現(xiàn)，再用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（3∶7，V/V）洗脫至無(wú)丹酚酸A時(shí)洗脫結(jié)束。合并純度大于98%的洗脫流份，減壓濃縮，干燥，即得。結(jié)果表明：純化硅膠用量為1∶10、1∶25時(shí)，收得的丹酚酸A質(zhì)量符合要求，但收率低，成本高；純化硅膠用量在1∶15~1∶20范圍時(shí)，樣品質(zhì)量、收得率符合工藝要求，因此確定純化硅膠比例定為1∶15~1∶20，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 純化硅膠用量篩選結(jié)果匯總表

2.4.4 洗脫流速篩選采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱（150 mm×650 mm），以正相硅膠（300~400目）為填料制備丹酚酸A。取“2.3”項(xiàng)下丹酚酸A粗品（含丹酚酸A200 g），加適量硅膠（300~400目）拌樣，干燥，按丹酚酸A與層析硅膠（300~400目）重量比1∶20進(jìn)行柱層析，柱層析參數(shù)如下：洗脫流速控制300~1 200 mL/min，紫外檢測(cè)器在線跟蹤檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm），洗脫劑體系及洗脫梯度為：先用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（4∶6，V/V）洗脫至丹酚酸A出現(xiàn)，再用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（3∶7，V/V）洗脫至無(wú)丹酚酸A時(shí)洗脫結(jié)束。合并純度大于98%的洗脫流份，減壓濃縮，干燥，即得。結(jié)果表明：洗脫流速控制300~900 mL/min時(shí)，收得的丹酚酸A質(zhì)量符合要求，且制備得率高，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 洗脫流速篩選結(jié)果匯總表

2.4.5 洗脫劑用量考察采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱（150 mm×650 mm），以正相硅膠（300~400目）為填料制備丹酚酸A。取“2.3”項(xiàng)下丹酚酸A粗品（含丹酚酸A200 g），加適量硅膠（300~400目）拌樣，干燥，按丹酚酸A與層析硅膠（300~400目）重量比1∶20進(jìn)行柱層析，柱層析參數(shù)如下：洗脫流速控600 mL/min，紫外檢測(cè)器在線跟蹤檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm），洗脫劑體系及洗脫梯度為：先用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（4∶6，V/V）洗脫13倍柱體積（91 L），再用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（3∶7，V/V）洗脫8倍柱體積（56 L）。合并純度大于98%的洗脫流份，減壓濃縮，干燥，即得。結(jié)果表明：純化時(shí)先采用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（4∶6，V/V）洗脫10倍柱體積（70L），再采用環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（3∶7，V/V）洗脫6倍柱體積（42 L），收得的流份經(jīng)處理后丹酚酸A質(zhì)量符合要求，且制備效率高。各洗脫流份丹酚酸A純度變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 洗脫流份中丹酚酸A純度變化趨勢(shì)圖

2.4.6 工業(yè)色譜純化工藝采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱（150 mm× 650 mm），以正相硅膠（300~400 目）為填料制備純化丹酚酸A。取“2.3”項(xiàng)下丹酚酸A粗品，加適量硅膠（300~400目）拌樣，干燥，干法上樣（純化硅膠用量比例為1∶20），流動(dòng)相為環(huán)己烷-叔丁基甲基醚系統(tǒng)，紫外檢測(cè)器在線跟蹤檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm）。洗脫程序如下：環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（4∶6，V/V）洗脫10倍柱體積（70L），環(huán)己烷-叔丁基甲基醚（3∶7，V/V）洗脫6倍柱體積（42 L），洗脫流速控制 600 mL/min。合并純度大于98%的洗脫流份，減壓濃縮，干燥，即得丹酚酸A成品。

2.5 丹酚酸A純度檢測(cè)

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱定丹酚酸A工作對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，再精密量取0.7 mL，置100 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋制成每1 mL中約含丹酚酸A 0.7 μg的溶液，搖勻，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備精密稱定“2.4.6”項(xiàng)下丹酚酸 A 10 mg，置 50 mL 量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋成每1 mL含丹酚酸A 0.2 mg的溶液，搖勻，即得。

2.5.3 樣品測(cè)定精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以面積歸一化法計(jì)算丹酚酸A主峰純度為99.10%，相對(duì)保留時(shí)間為19.8 min，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 丹酚酸A工業(yè)色譜純化前后HPLC色譜圖

2.6 丹酚酸A結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 UV鑒定取“2.4.6”項(xiàng)下丹酚酸A成品10 mg，精密稱定，加水溶解制成每1 mL含丹酚酸A 10 μg的溶液，按紫外-可見(jiàn)分光光度法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0401），在190~400 nm范圍內(nèi)掃描測(cè)定。本品的最大吸收波長(zhǎng)在198，254，286 nm處，提示結(jié)構(gòu)中有強(qiáng)共軛系統(tǒng)，符合丹酚酸A紫外光譜特征。

2.6.2 IR鑒定取“2.4.6”項(xiàng)下丹酚酸A成品及對(duì)照品適量，分別采用KBr（溴化鉀∶樣品=100∶1）壓片法，參考《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0402紅外分光光度法測(cè)定，將樣品的紅外光吸收?qǐng)D譜與對(duì)照品圖譜進(jìn)行對(duì)比分析可知：氫鍵締合的-OH的吸收峰在3324 cm-1；羧酸-C=O的吸收峰在1 686 cm-1；苯環(huán)骨架-C=C-的吸收峰 在 1 601 cm-1、1 519 cm-1；羧 酸 -COO- 的 吸收峰在 1 284 cm-1；反式雙鍵 RCH=CHR 的吸收峰在 968 cm-1，Ar-H 的吸收峰在 807 cm-1。結(jié)果表明：本品結(jié)構(gòu)中含-OH、羧基、苯環(huán)、-COO-、CH=CH、-CH2-等基團(tuán)，紅外光譜數(shù)據(jù)與丹酚酸A紅外信號(hào)特征相符。

2.6.3 結(jié)構(gòu)鑒定本品為黃色無(wú)定形粉末；ESI MSm/z：493.1139［M-H］-,分 子 式：C26H22O10。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：2.84（1H，dd，J=14.4，8.4 Hz，H-7''-a），2.96（1H，dd，J=14.4，4.4 Hz，H-7''-b），5.02（1H，dd，J=8.4，4.4 Hz，H-8''），6.32（1H，d，J=15.6 Hz，H-8'），6.47（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6''），6.49（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.60（1H，d，J=8.0 Hz，H-5''），6.65（1H，d，J=2.0 Hz，H-2''），6.73（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.77（1H，d，J=8.4 Hz，H-4'），6.80（1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6），6.99（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），7.03（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），7.20（1H，d，J=8.4 Hz，H-5'），7.91（1H，d，J=15.6 Hz，H-7'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：36.7（C-7''），73.4（C-8''），113.4（C-2），114.7（C-4'），114.7（C-8'），115.9（C-5''），116.3（C-5），117.0（C-2''），119.3（C-6），119.4（C-8），119.8（C-5'），120.7（C-6''），124.1（C-6'），127.6（C-1'），127.8（C-1''），129.4（C-1），136.3（C-7），143.6（C-2'），144.5（C-4''），145.4（C-3''），145.5（C-7'），146.0（C-3），146.3（C-4），147.7（C-3'），166.7（C-9'），171.4（C-9''）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報(bào)道一致，確定其為丹酚酸 A（salvianolic acid A），結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

圖3 丹酚酸A化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3 討論

丹酚酸A具有較強(qiáng)的藥理活性，對(duì)該成分的研究具有較大的運(yùn)用價(jià)值。由于丹酚酸A在丹參藥材中含量極低，且化合物的標(biāo)準(zhǔn)品比較昂貴，直接用于新藥開(kāi)發(fā)成本較高。綜合大規(guī)模制備成本和分離效果等方面因素，本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速大量制備高純度丹酚酸A的方法，制備的丹酚酸A純度99.0%以上。具體為：以丹參藥材為原料，經(jīng)提取、濃縮、轉(zhuǎn)化、大孔吸附樹(shù)脂富集，然后用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜分離制備丹酚酸A，制備速度快、效率高，克服了常規(guī)制備方法成本高，步驟繁瑣、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。采用正相硅膠填料有成本低、分離度好、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)，為丹酚酸A的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，也為本品后期的新藥開(kāi)發(fā)提供了充足的原料。