波卓鏈霉菌合成納米硒的物理化學(xué)表征及其抑菌促生活性

何 斐，崔 鳴，王 甜，杜小平，張博泉，朱錦镕，馮明月

(1安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2 安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

硒(Se)是生物體必需的微量元素之一，但硒過量則產(chǎn)生毒害[1]。與無機(jī)硒亞硒酸鹽(SeO32-)、硒酸鹽(SeO42-)和有機(jī)硒化合物(Se2-)相比，納米硒(Selenium nanoparticles，SeNPs)是一種新型單質(zhì)硒，其毒性低、生理活性強(qiáng)、易吸收，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境監(jiān)測、化工及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。如在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，利用SeNPs作為肥料添加劑，可有效增強(qiáng)植株抗逆境脅迫的能力[3-4]，達(dá)到提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。因此，近年來關(guān)于SeNPs的人工制備及機(jī)理日益成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

利用微生物的同化還原、異化還原和甲基化等途徑可將土壤、水體、底泥等環(huán)境中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為納米硒[5]。與物理和化學(xué)合成方法相比，微生物合成納米硒是一種環(huán)境友好的合成途徑，具有轉(zhuǎn)化條件溫和、安全性高、環(huán)保經(jīng)濟(jì)、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、分散性好等眾多優(yōu)勢[6]。目前，合成納米硒的微生物主要集中在細(xì)菌和真菌中，而關(guān)于放線菌的研究較少。放線菌廣泛存在于自然界中，許多放線菌作為農(nóng)用、醫(yī)藥抗生素和生物活性次生代謝產(chǎn)物的重要產(chǎn)生菌，不僅環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)孢量大，而且在合成生物納米硒方面具有潛在的優(yōu)勢[7-8]。昌青青等[9]利用唐德鏈霉菌(Streptomycestendae)為模板，以Na2SeO3為硒源，在9 mg/L硒條件下富集產(chǎn)生紅色圓球狀單質(zhì)硒。崔彬[10]利用放線菌將0.01 μg/mL的Na2SeO3還原為直徑100～200 nm的紅色單質(zhì)硒。本課題組前期從陜西省安康市健康花魔芋根際土壤中分離篩選到1株具有富硒能力的菌株A1，其與Na2SeO3作用可以合成紅色球形納米顆粒，該顆?；咎卣髋c用其他放線菌合成的納米硒[9-10]類似。本研究即針對菌株A1合成納米硒的細(xì)胞形態(tài)特征、物理化學(xué)特征(晶型、元素組成和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)等)及抑菌促生活性進(jìn)行分析，以期為納米硒生物合成提供新的放線菌菌種資源，同時為菌株A1在富硒花魔芋栽培中的后續(xù)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試放線菌菌株A1是本課題組從安康學(xué)院農(nóng)學(xué)大棚健康花魔芋根際土壤中分離獲得。

供試靶標(biāo)菌為花魔芋軟腐病原菌菊果膠桿菌(Pectobacteriumchrysanthemi)CZS-B6菌株，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)(武漢大學(xué))提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 采用高氏1號固體培養(yǎng)基[11]進(jìn)行菌株A1活化、保藏，采用高氏1號液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株A1發(fā)酵濾液的制備；分別采用高氏1號固體培養(yǎng)基、GYM培養(yǎng)基、沙漠菌培養(yǎng)基和ISP2培養(yǎng)基[12]觀察菌株A1的基本特征。采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)制備花魔芋軟腐病靶標(biāo)病原菌懸液；采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備用于抑菌活性檢測的軟腐病靶標(biāo)病原菌平板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株A1的富硒特性檢測 采用紅硒法[13]進(jìn)行富硒特性檢測。挑取已活化的菌株A1，分別劃線接種在添加10，100，200 mg/L Na2SeO3的高氏1號固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察平板上的菌苔是否出現(xiàn)紅色，以不添加Na2SeO3的高氏1號固體培養(yǎng)基為對照。

1.2.2 利用菌株A1合成生物納米硒 按照程麗娟等[11]的方法配制高氏1號液體培養(yǎng)基，將其分裝在250 mL三角瓶(100 mL/瓶)中，PE膜封口，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后置于超凈工作臺上。加入經(jīng)孔徑0.22 μm無菌濾膜過濾的Na2SeO3溶液，使培養(yǎng)基中的Na2SeO3質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L，對照組不添加Na2SeO3；然后按體積分?jǐn)?shù)5%的量分別接種活化的菌株A1菌液。每處理重復(fù)3次，150 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，可得到菌株A1合成的生物納米硒。

1.2.3 菌株A1的細(xì)胞形態(tài)觀察與納米硒基本特性表征 取1.2.2節(jié)培養(yǎng)10 d的培養(yǎng)物于50 mL離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集的發(fā)酵濾液用于種子萌發(fā)促生活性和抑菌活性檢測，獲得的菌體沉淀經(jīng)冷凍干燥、噴金等處理后，通過掃描電鏡(SEM)觀察菌株A1的細(xì)胞形態(tài)及其合成的納米硒形貌。

取1.2.2節(jié)高氏1號液體培養(yǎng)基培養(yǎng)離心收集的菌體沉淀，清洗3次后于-80 ℃下冷藏16 h。經(jīng)真空冷凍干燥后，利用X射線能譜分析儀(EDS)、X射線衍射儀(XRD)和傅里葉紅外變換光譜儀(FTIR)，對菌株A1合成的納米硒進(jìn)行物理化學(xué)特性表征。X射線衍射分析用Bruker D8 Advance測定，電壓40 kV、電流40 mA，Cu靶Kα輻射(λ=0.154 056?)，步進(jìn)掃描，步長0.01°，每一步停留時間0.1 s，掃描范圍5°～90°。

1.2.4 納米硒的種子萌發(fā)促生活性測定 采用室內(nèi)培養(yǎng)皿生物測定法檢測納米硒的種子萌發(fā)促生活性[14]。供試小麥和玉米種子用體積分?jǐn)?shù)70%酒精表面消毒30 s，無菌水沖洗3次；再用體積分?jǐn)?shù)10% NaOCl表面消毒1 min，無菌水沖洗3次后放入試管中，每試管10粒種子。將1.2.3節(jié)離心收集的SeNPs富硒發(fā)酵濾液和非富硒發(fā)酵濾液分別稀釋0(原液)，5和50倍，以無菌水為對照，于25 ℃下避光浸種24 h。棄去浸液，無菌水沖洗種子3次后，放入裝有無菌水浸潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每處理重復(fù)3皿，每皿10粒種子，25 ℃恒溫培養(yǎng)。以胚根長度達(dá)到種子全長的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，以7 d內(nèi)發(fā)芽數(shù)計(jì)算發(fā)芽率[15]，發(fā)芽率按照以下公式計(jì)算：

發(fā)芽率=種子發(fā)芽終期(前7 d)全部正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

培養(yǎng)7 d后用直尺測量各處理種子以上部分苗高和主根長，統(tǒng)計(jì)正常發(fā)芽種子的單株根數(shù)，用電子天平稱各處理幼苗的總鮮質(zhì)量。

1.2.5 納米硒的抑菌活性測定 參照徐煒等[16]的方法制備靶標(biāo)病原菌懸液，取50 μL菌懸液接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，備用。分別用濾紙片擴(kuò)散法和牛津杯法測定納米硒的抑菌活性。

(1)濾紙片擴(kuò)散法。取1.2.3節(jié)制備的菌株A1富硒發(fā)酵濾液SeNPs和非富硒發(fā)酵濾液(A1)各50 mL，用孔徑0.22 μm無菌濾膜過濾，將直徑6 mm的滅菌濾紙片放入過濾后的濾液中浸泡10 min，用無菌鑷子取出，再放入已接種靶標(biāo)菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，每皿四周等距離放4個浸泡的濾紙片，中間以無菌水浸泡的濾紙片作對照[17]。

(2)牛津杯法。在已接種靶標(biāo)菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上放3個牛津杯，分別取1.2.3節(jié)制備的菌株A1的SeNPs富硒發(fā)酵濾液和非富硒發(fā)酵濾液100 μL，加入2個牛津杯中，另一個牛津杯中加入100 μL無菌水作對照。

以上處理各重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察記錄抑菌圈直徑。

1.2.6 菌株A1的鑒定 (1)分別在高氏1號固體培養(yǎng)基、GYM培養(yǎng)基、沙漠菌培養(yǎng)基和ISP2培養(yǎng)基[12]上稀釋涂布接種菌株A1，28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，觀察記錄菌株A1的菌落形態(tài)特征。

(2)按照徐麗華等[18]的方法進(jìn)行碳源利用、明膠液化、牛奶胨化、硝酸鹽還原及H2S、黑色素產(chǎn)生等生理生化特性分析。

(3)采用酶解法[18]提取菌株A1的總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(PA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，PB：5′-AAGGAGGTG-ATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，20 mmol/L Mg2+2.0 μL，10 mmol/L dNTP mixture 0.5 μL，3 U/μLTaqPolymerse 0.5 μL，20 μmol/L引物PA和PB各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 17.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性60 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。采用ClustalX v2.2軟件進(jìn)行同源性分析，Mega 5.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，以Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A1的富硒特性

Na2SeO3作用下菌株A1的富硒特性及合成生物納米硒SeNPs的掃描電鏡觀察見圖1和圖2。

微生物可將培養(yǎng)基中添加的Na2SeO3還原成紅色生物硒，使細(xì)胞出現(xiàn)紅色顆粒沉積[19]，通過紅色的深淺和培養(yǎng)基中的含硒量可以判斷菌株的富硒能力[9]。由圖1-A-D可見，無硒培養(yǎng)條件下菌株A1菌絲呈現(xiàn)白色；在添加10 mg/L Na2SeO3的高氏1號固體培養(yǎng)基平板上，菌株A1菌苔呈現(xiàn)淡紅色；在添加100和200 mg/L Na2SeO3的高氏1號固體培養(yǎng)基平板上，菌株A1菌苔呈現(xiàn)深紅色，說明含硒條件下菌株A1產(chǎn)生了紅色的生物硒。將菌株A1接種到含有200 mg/L Na2SeO3的高氏1號液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)10 d，菌液顏色呈現(xiàn)紅色(圖1-E)，說明單質(zhì)硒生成。為進(jìn)一步確定此結(jié)果的準(zhǔn)確性，取菌體進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，培養(yǎng)基中添加200 mg/L Na2SeO3的菌株A1合成了單質(zhì)球形生物納米硒。利用X射線能譜分析儀(EDS)對球形顆粒表面元素組成分析結(jié)果(圖3和表1)表明，在1.4 keV處出現(xiàn)了Se元素的特征峰，其相對含量為15.0%，此外含有部分來自于生物大分子的有機(jī)元素，確定菌株A1所產(chǎn)生的球形顆粒為生物納米硒[20-21]。

表1 菌株A1及其合成生物納米硒顆粒表面元素的相對含量Table 1 Relative content of strain A1 and its synthesized SeNPs

2.2 SeNPs的物理化學(xué)特性表征

從Na2SeO3的衍射譜(圖4-A)可以看出，衍射角2θ約為22.01°，37.64°處出現(xiàn)了多個尖銳峰。但經(jīng)過菌株A1生物轉(zhuǎn)化之后(圖4-B)，尖銳峰全部消失，在12.91°，19.62°，29.00°共3個位置出現(xiàn)了較為寬泛的峰，無明顯的晶體衍射峰，說明底物Na2SeO3的晶體結(jié)構(gòu)在菌株A1作用下被轉(zhuǎn)化為非晶態(tài)的納米硒。

采用傅里葉紅外變換光譜儀對菌株A1合成的生物納米硒表面官能團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖5)顯示，3 259.89 cm-1處存在一個吸收峰，為N-H或O-H伸縮振動，源于纖維素或多糖類物質(zhì)[22]；在2 914.51 cm-1處存在吸收峰，為C-H伸縮振動，源于脂肪類物質(zhì)[23]；在1 638.71和1 547.08 cm-1的吸收峰分別對應(yīng)-CONH-和N-H的伸縮振動，源于蛋白質(zhì)類物質(zhì)[24]；1 406.10 cm-1處的吸收峰屬于脂肪族的C-H伸縮振動；在1 029.00 cm-1處的吸收峰對應(yīng)C-O的伸縮振動，源于多糖類物質(zhì)[25-26]。說明菌株A1在轉(zhuǎn)化Na2SeO3過程中，分泌的多糖類物質(zhì)為納米硒顆粒的形成提供了結(jié)合位點(diǎn)[27]，且該菌株合成的納米硒含有脂肪類、蛋白質(zhì)類有機(jī)成分，這些物質(zhì)的存在使合成納米硒的穩(wěn)定性和生物活性增強(qiáng)[6]。

2.3 菌株A1富硒發(fā)酵濾液的促生活性

花魔芋有性繁殖器官是實(shí)生種子，但由于其休眠期長，出苗率低，難以直接用實(shí)生種子及幼苗進(jìn)行微生物代謝產(chǎn)物促生活性試驗(yàn)[28]。而小麥和玉米種子及其幼苗對微生物代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)反應(yīng)敏感，且易在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行測定，因此其促生活性具有良好的重現(xiàn)性[29-30]。菌株A1發(fā)酵濾液對小麥和玉米種子萌發(fā)及生長的影響見表2,其表現(xiàn)觀察見圖6。從表2和圖6可以看出，菌株A1的SeNPs富硒發(fā)酵濾液原液可促進(jìn)小麥和玉米幼苗的生長，且對根系生長促進(jìn)效果尤為明顯；其中，小麥和玉米幼苗主根長及總鮮質(zhì)量均較無菌水對照顯著增加(P<0.05)。菌株A1的SeNPs富硒發(fā)酵濾液原液對小麥和玉米幼苗單株根數(shù)促進(jìn)作用不明顯，但其50倍稀釋液處理的小麥和玉米幼苗單株根數(shù)分別較無菌水對照顯著增加27.1%和56.7%(P<0.05)。

從表2和圖6也可看出，菌株A1本身也有一定的促生作用。隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增大，未添加Na2SeO3的菌株A1發(fā)酵濾液對小麥和玉米幼苗生長的促進(jìn)作用總體呈上升趨勢。稀釋50倍時，小麥種子發(fā)芽率、幼苗苗高和主根長達(dá)到最大值，分別較無菌水對照顯著增加36.4%，75.0%，65.4%；玉米幼苗主根長和總鮮質(zhì)量分別較無菌水對照顯著增加72.3%，12.7%(P<0.05)。

表2 菌株A1發(fā)酵濾液對小麥和玉米種子萌發(fā)及生長的影響Table 2 Effect of supernatant synthesized by strain A1 on seed germination and growth of wheat and maize

2.4 菌株A1富硒發(fā)酵濾液的抑菌活性

軟腐病是我國花魔芋生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害之一，是制約花魔芋種植業(yè)發(fā)展的重要因素[31]。菌株A1富硒發(fā)酵濾液的抑菌活性見圖7。

從圖7可以看出，菌株A1的SeNPs富硒發(fā)酵濾液原液對花魔芋軟腐病原菌菊果膠桿菌有明顯的抑菌效果。用濾紙片擴(kuò)散法(圖7-A)和牛津杯法(圖7-B)測得的平均拮抗圈直徑分別為14.6和13.1 mm；但未添加Na2SeO3轉(zhuǎn)化的菌株A1非富硒發(fā)酵濾液原液對花魔芋軟腐病原菌無抑制作用(圖7-C和圖7-D)。

2.5 菌株A1的鑒定

2.5.1 培養(yǎng)特征 由圖8可以看出，放線菌菌株A1具有典型的鏈霉菌屬特征，在高氏1號固體培養(yǎng)基、GYM培養(yǎng)基、沙漠菌培養(yǎng)基和ISP2培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，均生長良好，菌絲白色至灰白色，邊緣放射狀，菌落直徑0.40～0.55 cm，無可溶性色素產(chǎn)生。

2.5.2 生理生化特性 菌株A1能利用碳源果糖、乳糖、麥芽糖和D-甘露醇，但利用D-木糖、肌醇和山梨醇的能力較差；可使明膠液化，牛奶不凝固不胨化；可產(chǎn)生H2S和黑色素，淀粉水解能力強(qiáng)，纖維素分解能力較弱。菌株A1的碳源利用及生理生化等14項(xiàng)特性與波卓鏈霉菌(Streptomycesbottropensis)[32-33]吻合。

2.5.3 16S rDNA序列分析 測序結(jié)果表明，菌株A1的16S rDNA序列全長1 462 bp(GenBank登錄號：OK035202)。調(diào)取與菌株A1相似性較高的8株鏈霉菌屬相關(guān)典型菌株，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖9)顯示，菌株A1與波卓鏈霉菌(Streptomycesbottropensis)在同一系統(tǒng)進(jìn)化分支上，相似性為98.3%。

綜合16S rDNA序列分析結(jié)果及菌落形態(tài)、生理生化特性，將菌株A1鑒定為波卓鏈霉菌。

3 討論與結(jié)論

本研究對所獲菌株進(jìn)行培養(yǎng)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析的結(jié)果表明，菌株A1為鏈霉菌屬的波卓鏈霉菌(Streptomycesbottropensis)。該菌株具有合成生物納米硒的能力，其富硒發(fā)酵濾液有促生效應(yīng)，對花魔芋軟腐病原菌表現(xiàn)出抑菌活性。

目前，國內(nèi)外對波卓鏈霉菌有一定的研究。Park等[34]從波卓鏈霉菌中分離的波卓霉素A2和都奈霉素D3S對水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)具有抑菌活性。寧楚涵等[32]研究表明，波卓鏈霉菌能產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)鐵載體和固氮，并對植物病原菌禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和瓜類炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)具有不同程度的抑制作用。杜宜新等[33]研究發(fā)現(xiàn)，波卓鏈霉菌對香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、蘆筍莖枯病菌(Phomopsisasparagi)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、大豆炭疽病菌(Colletotrichumtruncatum)和玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)等多種重要的植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，波卓鏈霉菌菌株A1合成納米硒的發(fā)酵濾液對花魔芋軟腐病原菌菊果膠桿菌(Pectobacteriumchrysanthemi)有一定的抑制作用，亦能促進(jìn)小麥和玉米種子萌發(fā)及生長，預(yù)示著其在軟腐病防治和作物促生方面具有較好的應(yīng)用潛力和開發(fā)價值。但其在花魔芋植株上的抑病促生效果有待進(jìn)一步研究。

目前已報(bào)道的具有納米硒合成能力的微生物主要集中在細(xì)菌[35-38]和真菌[39-40]中，而合成納米硒的放線菌較少，僅有細(xì)黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus)[41]、比基尼鏈霉菌(S.bikiniensis)[42]、唐德鏈霉菌(S.tendae)[9]和其他少數(shù)鏈霉菌屬菌株[43]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，波卓鏈霉菌菌株A1具有納米硒合成能力，該結(jié)果豐富了合成納米硒的放線菌種質(zhì)資源，為納米紅色硒的進(jìn)一步應(yīng)用提供了依據(jù)。且菌株A1具有分泌胞外多糖、蛋白質(zhì)、脂肪類等有機(jī)分子的能力，這些生物分子對維持納米硒的穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要，因此后續(xù)還應(yīng)利用蛋白組學(xué)技術(shù)，對菌株A1合成的納米硒生物組分進(jìn)一步解析。此外，本研究發(fā)現(xiàn)生物合成的納米硒多為非晶態(tài)。Ye等[44]以茶多酚、蛋白質(zhì)和碳水化合物等為原料，通過抗壞血酸-亞硒酸鈉氧化還原反應(yīng)合成的納米硒也呈非晶態(tài)；王麗紅等[45]利用嗜酸乳桿菌LA5還原亞硒酸鈉也獲得非晶態(tài)的納米硒，且非晶態(tài)納米硒反應(yīng)活性高于晶體形態(tài)。由此可知，相比化學(xué)合成的晶態(tài)納米硒，菌株A1合成的非晶態(tài)納米硒具有潛在的生物活性優(yōu)勢。