火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型的建立

呂欣欣，馮志恒，林 熙，李賽楠，黃少偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣東省森林植物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

火炬松(PinustaedaL.)為松科松屬喬木，原產(chǎn)于美國東南部，是一種生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)的樹種。火炬松材質(zhì)強(qiáng)韌，用途廣泛，可供建筑、橋梁等使用[1]，從其樹干中割取的樹脂多用于醫(yī)藥、化工等行業(yè)[2-3]，可以提取松香和松節(jié)油，兩者均是很重要的化工原料[4-5]。松針是松樹的針形葉，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，松針提取物中含有多種對人體有益的重要活性成分，如黃酮類[6]、萜類[7]、揮發(fā)油類[8]等化合物，具有抗氧化[9]、降血脂[10]、抑菌[11]、抗癌[12]等藥理作用。目前，國內(nèi)外檢測植物中活性成分含量的方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[13-14]等，但這些方法都存在成本高、操作費(fèi)時(shí)、有污染風(fēng)險(xiǎn)等問題。

近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRs)預(yù)測技術(shù)是基于植物中某成分含量變化引起其對近紅外光的吸收產(chǎn)生差異，通過在近紅外光譜區(qū)采集該植物樣品有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(O-H、N-H、C-H)的特征信息，經(jīng)過一系列計(jì)算將這些信息與相應(yīng)的化學(xué)值產(chǎn)生聯(lián)系，建立能夠快速預(yù)測樣品中某成分含量的近紅外預(yù)測模型，用于該成分含量快速預(yù)測的一種方法。該方法在不同領(lǐng)域的研究中多有應(yīng)用。蔣開彬等[15]建立了火炬松木材基本密度和纖維長度的近紅外預(yù)測模型，該模型能夠滿足快速、準(zhǔn)確、大規(guī)模檢測火炬松育種群體木材材質(zhì)的要求；Karoojee等[16]建立了石斛蘭葉片中全氮含量的近紅外預(yù)測模型，通過預(yù)測葉片的全氮含量來達(dá)到及時(shí)為石斛蘭施加氮肥的目的；林艷等[17]基于近紅外光譜技術(shù)建立了沉香含油量的預(yù)測模型，經(jīng)過驗(yàn)證該模型能夠準(zhǔn)確、快速地鑒定沉香的結(jié)香品質(zhì)。

目前國內(nèi)外對于火炬松的良種選育工作多集中在提高木材形質(zhì)和產(chǎn)脂量上，尚未開展以提高生物活性成分含量為目標(biāo)的良種選育工作。兒茶素主要是從茶葉等植物中提取出來的酚類物質(zhì)，在降脂、消炎、抗氧化、抑菌等方面具有良好表現(xiàn)[18-20]。國內(nèi)外基于近紅外技術(shù)建立的兒茶素含量預(yù)測模型主要集中在茶葉[21]、大豆[22]等作物上，尚未建立松針中兒茶素含量的近紅外預(yù)測模型。為了節(jié)省松針中活性成分含量檢測的時(shí)間和成本，提高選擇效率，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)檢測火炬松針葉中的兒茶素含量，基于近紅外光譜技術(shù)建立火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型，旨在為高兒茶素含量火炬松優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器 甲醇、甲酸，沃凱化學(xué)試劑公司；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，Aladdin化學(xué)試劑公司。API5000三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司；多功能近紅外成分分析儀，瑞典 Perter公司；ACQU ITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美國Waters公司。

1.1.2 樣品的采集與處理 2019年10月，于廣東省英德市林業(yè)科學(xué)研究所火炬松1.5代種子園自由授粉子代林摘取火炬松針葉樣品，該子代林于2015年春造林，有8個(gè)區(qū)組，5株行式小區(qū)。采集火炬松剛木質(zhì)化枝梢上的第1、2顆針葉，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清理，65 ℃烘干處理[23]。將充分干燥的針葉利用粉碎機(jī)粉碎，過孔徑270 μm的篩子后得到火炬松針葉粉末，將樣品裝進(jìn)密封袋后置于裝有硅膠的干燥器中保存。試驗(yàn)共采集102個(gè)火炬松針葉樣品，從中隨機(jī)選取90個(gè)樣品作為近紅外預(yù)測模型的校正集，其余12個(gè)樣品作為近紅外預(yù)測模型的驗(yàn)證集。

1.2 火炬松針葉兒茶素含量測定

1.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇配制成兒茶素母液。取適量兒茶素母液用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為125，250，500，1 000，2 000，4 000，10 000，20 000 ng/mL，制成兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用API5000三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀對兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC-MS檢測，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 松針葉樣品前處理 稱取200 mg火炬松針葉粉末于2 mL EP管中，加入600 μL甲醇溶液，渦旋振蕩30 s，室溫超聲15 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾，將濾液加入到檢測瓶中。

1.2.3 松針葉兒茶素含量測定 采用API5000三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀對經(jīng)前處理的火炬松針葉樣品進(jìn)行LC-MS檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兒茶素含量，繪制兒茶素含量頻率分布直方圖。色譜條件：ACQU ITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，流速0.25 mL/min。梯度洗脫條件為0～1 min，10% B；1～3 min，10%～33% B；3～10 min，33% B；10～15 min，33%～50% B；15～20 min，50%～90% B；20～21 min，90% B；21～22 min，90%～10% B；22～25 min，10% B。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI)源，負(fù)離子電離模式；離子源溫度500 ℃，離子源電壓4 500 V，碰撞氣6 psi，氣簾氣30 psi，霧化氣和輔助氣均為50 psi；采用多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)進(jìn)行掃描[24]。

1.3 火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型的建立

1.3.1 近紅外光譜信息采集 使用多功能近紅外成分分析儀掃描火炬松針葉粉末樣品，采集其近紅外光譜信息。該近紅外成分分析儀掃描的光譜范圍為950～1 650 nm，分辨率5 nm，采用漫反射的方式掃描，光斑直徑3.5 cm。采集光譜信息前，將需要掃描的針葉粉末樣品置于近紅外成分分析儀所在實(shí)驗(yàn)室24 h，以適應(yīng)溫度等環(huán)境因素，減少環(huán)境變化對試驗(yàn)過程產(chǎn)生的影響；開機(jī)后，先打開軟件預(yù)熱30 min，預(yù)熱結(jié)束后將樣品盛在近紅外成分分析儀配套的樣品杯中進(jìn)行掃描和光譜信息采集。試驗(yàn)重復(fù)裝樣3次，每次裝樣重復(fù)3次。

1.3.2 近紅外光譜信息的預(yù)處理和建模 采集的樣品近紅外光譜信息會(huì)受到噪音、儀器、環(huán)境中散射光等的干擾[25]，進(jìn)而影響近紅外模型的準(zhǔn)確性。對采集的近紅外光譜信息進(jìn)行預(yù)處理可以在一定程度上降低上述干擾因素對近紅外模型造成的影響。從近紅外成分分析儀中導(dǎo)出火炬松針葉的近紅外光譜信息，利用軟件The Unscrambler 9.7(CAMO公司)對獲得的光譜信息進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方式有一階導(dǎo)數(shù)(first deviation，F(xiàn)D)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換法(standard normal variate transformation，SNV)、平滑算法(smoothing)、乘積分散校正法(multiplicative scattering correction，MSC)和標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)以及FD+SNV、MSC+FD，以未預(yù)處理光譜信息為對照。通過杠桿值影響圖和學(xué)生化殘差圖剔除異常樣品，最后結(jié)合偏最小二乘法進(jìn)行建模。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和計(jì)算，采用SAS 9.4軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算和t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的回歸方程為：Y=92.608X-18.515，相關(guān)系數(shù)R接近0.99，定量限為125 ng/mL，表明在125～20 000 ng/mL時(shí)兒茶素質(zhì)量濃度與峰面積具有較好的相關(guān)性，能夠滿足對火炬松針葉粉中兒茶素含量進(jìn)行定量分析的要求。

2.2 火炬松針葉粉的兒茶素含量

由表1可知，90個(gè)火炬松針葉校正集樣品的兒茶素含量最小值為4.24 μg/g，最大值為33.74 μg/g，平均值為15.03 μg/g，標(biāo)準(zhǔn)差為5.58 μg/g。由90個(gè)火炬松針葉校正集樣品兒茶素含量的頻率分布直方圖(圖1)可知，火炬松針葉兒茶素含量基本符合正態(tài)分布，可以用于建立預(yù)測模型。12個(gè)驗(yàn)證集火炬松針葉樣品的兒茶素含量最小值為5.29 μg/g，最大值為22.30 μg/g，平均值為11.97 μg/g，標(biāo)準(zhǔn)差為4.04 μg/g。

2.3 火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型的建立

在樣品各近紅外光譜預(yù)處理方法所獲模型的校正集相關(guān)系數(shù)(RC)、校正集均方根誤差(RMSEC)、交互驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)(RV)及交互驗(yàn)證集均方根誤差(RMSEV)中，RC和RV越接近1，RMSEC和RMSEV越小，模型的預(yù)測效果越好[26]。不同光譜預(yù)處理方法得到的火炬松針葉兒茶素含量預(yù)測模型的參數(shù)如表2所示。由表2可知，火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型的最優(yōu)光譜預(yù)處理方法為FD+SNV，該法所建立的預(yù)測模型主成分?jǐn)?shù)為14，RC為0.969 6，RMSEC為1.308 4，RV為0.817 1，RMSEV為3.105 2，RC和RV值均達(dá)到最大，且RMSEC和RMSEV均達(dá)到最小，表明該模型的預(yù)測效果較好。與未預(yù)處理的近紅外光譜圖(圖2)相比，經(jīng)過FD+SNV預(yù)處理后近紅外光譜圖(圖3)的曲線更加聚集，吸收峰更加明顯。

2.4 火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型的驗(yàn)證和評價(jià)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證近紅外預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，使用建立的火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型預(yù)測驗(yàn)證集中12個(gè)火炬松針葉樣品的兒茶素含量，并與其實(shí)測值進(jìn)行對比，結(jié)果(圖4)顯示，驗(yàn)證集中12個(gè)火炬松針葉樣品兒茶素含量預(yù)測值與其實(shí)測值之間有顯著的相關(guān)性(R=0.880 7)，表明所建模型的預(yù)測準(zhǔn)確度較高。

3 討論與結(jié)論

預(yù)測效果好的近紅外預(yù)測模型首先應(yīng)該具備較高的RC值[27]，劉洪林[28]建立的工夫紅茶兒茶素近紅外預(yù)測模型RC值為0.971 5。本研究建立的火炬松針葉兒茶素含量近紅外預(yù)測模型校正集RC值為0.969 6，與前人的研究結(jié)果接近。

對于建立的近紅外預(yù)測模型，可通過驗(yàn)證集的實(shí)測值和預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)對其預(yù)測準(zhǔn)確度進(jìn)行評價(jià)。陳華才等[29]建立了茶多酚總兒茶素近紅外光譜預(yù)測模型，其驗(yàn)證集樣品的實(shí)測值與預(yù)測值相關(guān)系數(shù)R=0.992。Huang等[21]建立的4種兒茶素含量光譜模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.949，0.893，0.968和0.931。本研究驗(yàn)證集中12個(gè)火炬松針葉樣品兒茶素含量實(shí)測值與預(yù)測值之間有顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R=0.880 7，與前人的研究結(jié)果接近，表明本研究的結(jié)果可信且準(zhǔn)確度較高。t檢驗(yàn)表明，本研究驗(yàn)證集的預(yù)測值與實(shí)測值存在一定的偏差，但是偏差不顯著(P=0.109 4>0.05)，偏差產(chǎn)生原因可能與火炬松針葉粉碎不均勻有關(guān)，也可能是儀器在長時(shí)間工作的過程中產(chǎn)生誤差所致。

本研究建立了火炬松針葉兒茶素含量的近紅外預(yù)測模型，該模型的主成分?jǐn)?shù)為14，RC為0.969 6，RMSEC為1.308 4，RV為0.817 1，RMSEV為3.105 2，預(yù)測值與實(shí)測值之間有顯著的相關(guān)性(R=0.880 7)，可用于火炬松針葉兒茶素含量的預(yù)測。