過敏性紫癜患兒血清miR-374b表達水平及其與并發(fā)腎炎的相關(guān)性

張書鋒 劉翠華 劉玉潔 江春亞 賈東華 李玉柳 劉鈞菲 田 明 曹廣海

腎炎是過敏性紫癜的嚴重并發(fā)癥，發(fā)生率≥30%，嚴重影響預后[1]。早期、有效地評估過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的情況，有利于及時采取相應治療措施，從而改善預后。微小RNA(miR)在過敏性紫癜[2]以及紫癜性腎炎[3]的發(fā)病中起重要作用。有研究顯示，IgA腎病患者外周血B淋巴細胞中miR-374b表達上調(diào)，抑制miR-374b可阻止IgA1異常糖基化，為IgA腎病的診治提供了新思路[4]。本文報告過敏性紫癜患兒血清中miR-374b的變化情況及其與并發(fā)腎炎的關(guān)聯(lián)。

1 方法

1.1 倫理學 本研究經(jīng)鄭州大學附屬兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會審批(審批號：201801-009)。

1.2 研究設計 病例對照研究。以過敏性紫癜患兒為病例組，以健康兒童為對照組，比較兩組血清中miR-374b水平；病例組分為并發(fā)和未并發(fā)腎炎亞組，分析過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的影響因素。

1.3 納入標準 病例組納入2018年3月至2020年7月我院門診或住院部收治的首次發(fā)病的過敏性紫癜(診斷參照文獻[5] )患兒；對照組納入同期在我院體檢的健康兒童。兩組均年齡≤14歲且兒童家長簽署針對本研究的知情同意書。

1.4 排除標準 兩組共同排除：①合并心、肝、肺等臟器疾病，原發(fā)性腎小球腎炎，風濕免疫性疾病，血液系統(tǒng)疾病，過敏性哮喘，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，惡性腫瘤；②近2周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑；③近1個月內(nèi)發(fā)生過感染性疾病。

1.5 分組考慮 病例組分為并發(fā)腎炎亞組和未并發(fā)腎炎亞組。過敏性紫癜并發(fā)腎炎的診斷參照中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟學組的“紫癜性腎炎診治循證指南(2016)”[6]。

1.6 血清miR-374b表達水平檢測 病例組患兒于收診當天或入院次日、對照組兒童于體檢當天采集晨起空腹外周靜脈血各5 mL至EDTA抗凝管中，3 000 rpm離心10 min，分離血清并保存?？俁NA提取(Trizol試劑盒,上海晶抗生物公司)和逆轉(zhuǎn)錄(One Step PrimeScript?miRNA cDNA synthesis Kit試劑盒，大連寶生物工程有限公司)均按照試劑盒說明書操作。采用實時熒光定量PCR法檢測血清中的miR-374b水平，反應體系為20 μL，包含2 μL逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板、10 μL的SYBR?Primer Ex TaqTMⅡ(2×)、0.8 μL的PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)、0.8 μL的Uni-miR qPCR Primer(10 μmol·L-1)、0.4 μL ROX Reference Dye(50×)和6 μL蒸餾水。正向引物序列：5'-AGTTCGGATATAATACAACCTGC-3'，反向引物序列：5'-TATCCTTGTTCTCCAGTCCTCTAC-3'。反應條件：預變性95℃ 30 s；PCR反應95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以U6作內(nèi)參，計算miR-374b表達水平。

1.7 資料截取 ①從病歷資料中截取病例組患兒的性別、年齡、病程、過敏性紫癜的并發(fā)癥情況，血PLT、WBC、ALB、FIB、LDL、HDL、TC，尿微量白蛋白(>2.0 mg·L-1為升高)、血IgA(>4.5 g·L-1為升高)、血IgG(>16.6 g·L-1為升高)、血IgM(>2.6 g·L-1為升高)，尿微量白蛋白采用首診當天檢查數(shù)據(jù)，其他檢查數(shù)據(jù)均來自首診和住院后首次檢查記錄；②從體檢記錄中截取對照組兒童的年齡、性別；③血清miR-374b水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件，計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以n(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic回歸性分析法分析過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的影響因素。采用ROC曲線分析血清miR-374b表達水平對過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 病例組103例、對照組86例進入本文分析。病例組男58例，女45例；年齡3～14(7.2±1.2)歲；病程3～39(19.0±3.4)d；其中單純性皮膚紫癜68例，伴腹痛23例，伴關(guān)節(jié)痛17例，伴消化道出血15例。對照組男46例，女40例；年齡2～13(7.0±1.1)歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義。

病例組中，并發(fā)腎炎亞組43例，未并發(fā)腎炎亞組60例。表1顯示，并發(fā)腎炎亞組和未并發(fā)腎炎亞組的年齡、病程、臨床表現(xiàn)、PLT和WBC計數(shù)、ALB、FIB、HDL、尿微量白蛋白、血IgA、血IgG和血IgM升高占比差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 miR-374b表達水平 病例組血清miR-374b表達水平(0.69±0.13)低于對照組(1.36±0.24)，差異有統(tǒng)計學意義(t=24.4，P<0.01)。

并發(fā)腎炎亞組血清miR-374b水平(0.51±0.09)低于未并發(fā)腎炎亞組(0.82±0.15)，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.1，P<0.01)。

2.3 過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的危險因素分析 以并發(fā)腎炎為因變量，以表1中差異有統(tǒng)計學意義的項目為自變量，行多因素Logistic回歸分析，表2顯示，年齡≥7歲、病程長、伴腹痛、伴關(guān)節(jié)痛、伴消化道出血、WBC高水平、PLT高水平、FIB高水平、尿微量白蛋白升高、血IgA升高、血IgG升高、血IgM升高是過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的危險因素，ALB和HDL高水平、miR-374b高表達水平是其保護因素。

表1 并發(fā)腎炎亞組和未并發(fā)腎炎亞組的臨床資料比較[n(%)]

表2 過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎危險因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清miR-374b表達水平對過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的診斷價值 圖1 ROC曲線顯示，以血清miR-374b表達水平預測過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的AUC為0.919(95%CI ：0.849～0.964)，截斷值為≤0.65時，敏感度為90.7%(95%CI：77.9%～97.4%)，特異度為83.3%(95%CI：71.5%～91.7%)，其中真陽性39例，假陽性10例，真陰性50例，假陰性4例。

3 討論

miR在人體多種生理病理過程中起著重要調(diào)控作用，因其在體液中比較穩(wěn)定、在組織細胞中的表達具特異性、在不同物種間高度保守性以及檢測較容易等，已成為臨床研究關(guān)注的焦點[7，8]。miR-374b定位于染色體Xq13.2，其表達與前列腺癌等多種疾病相關(guān)[9,10]。本研究顯示，過敏性紫癜患兒血清miR-374b表達水平較對照組低，與文獻報道[11]一致，提示miR-374b可能參與了過敏性紫癜的發(fā)病進程。

有研究[12]報道，循環(huán)miR在腎臟炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。本研究中過敏性紫癜并發(fā)腎炎患兒血清miR-374b表達水平低于未并發(fā)腎炎患兒，且多因素Logistic回歸分析顯示，miR-374b高表達水平是過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的保護因素，提示過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎可能與血清miR-374b表達低水平有關(guān)。ROC曲線分析顯示，血清miR-374b水平預測過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎的截斷值為≤0.65，敏感度為90.7%，特異度為83.3%，AUC為0.919，故監(jiān)測患兒血清miR-374b表達水平可能對過敏性紫癜患兒并發(fā)腎炎有一定的診斷價值。唐余燕等[13]研究顯示，紫癜性腎炎患者尿液miR-374b表達水平低于體檢正常人群及IgA腎病患者。有研究[14]顯示，miR-374b表達水平下調(diào)可導致TNF-α介導的炎癥反應增強。因此推測，過敏性紫癜患兒血清miR-374b表達水平降低，促使TNF-α等炎性因子釋放增多，進而促進局部腎組織炎癥反應，促使腎小球系膜細胞增殖與活化，由此參與腎炎的發(fā)生。

此外，本研究結(jié)果提示過敏性紫癜患兒年齡≥7歲、病程長、伴腹痛、伴關(guān)節(jié)痛、伴消化道出血，WBC、PLT和FIB高水平，尿微量白蛋白、血IgA、血IgG和血IgM升高是并發(fā)腎炎的危險因素；而ALB和HDL高水平是其保護因素?？赡艿脑驗椋S著年齡的增長，機體免疫能力增強，而病程越長，變態(tài)反應引發(fā)的免疫復合物沉積以及補體激活等越明顯，腎小球或腎間質(zhì)發(fā)生炎性反應的可能越大；伴腹痛、關(guān)節(jié)痛、消化道出血等臨床特征，常提示患兒存在其他器官受累，則并發(fā)腎損害的可能性較大，與白亞杰等[15]研究結(jié)果一致。WBC可釋放氧自由基、促進血管損傷，其黏附在血管內(nèi)皮細胞，引發(fā)微血管損傷，增加腎損害風險；尿微量白蛋白異?？勺鳛榉从衬I損害的一個敏感性指標，其含量增加常提示腎小球功能受損；PLT參與免疫應答，受多種因素的影響可趨化至腎臟，釋放細胞因子等生物活性物質(zhì)，引發(fā)腎損傷。肖李艷等[16]也報道，WBC升高、尿微量白蛋白異常、PLT升高是過敏性紫癜腎損害的危險因素。FIB水平升高，使機體處于高凝狀態(tài)，進而引發(fā)毛細血管微血栓，導致腎損害；IgA水平升高，其形成的抗原抗體免疫復合物經(jīng)由血液循環(huán)可大量沉積于小血管壁，從而引發(fā)腎損傷；T淋巴細胞與CD細胞高度表達，促進B細胞增殖，進而活化與合成IgM，與腎損傷程度密切相關(guān)。吳軍等[17]研究也顯示，皮疹持續(xù)時間、FIB、PLT、IgA和IgM均是過敏性紫癜患者發(fā)生腎損傷的獨立危險因素。血IgG增高，提示免疫復合物沉積，可引發(fā)腎損害；ALB明顯降低，提示患兒可能丟失大量蛋白，存在腎損傷的情況；HDL水平降低，運輸膽固醇的作用減弱，可導致脂質(zhì)沉積，進而損傷腎小管，引起腎小球硬化，與文獻 報道[18-20]研究結(jié)果一致。因此，臨床工作中對有以上危險因素的過敏性紫癜患兒應定期監(jiān)測實驗室指標，以及時發(fā)現(xiàn)腎炎合并癥并積極干預，從而改善預后。